DNA和RNA提取方法及原理.ppt

DNA和和RNA提取方法及原理提取方法及原理第二部分：第二部分：DNA提取常见问题分析及对策提取常见问题分析及对策DNA提取专题提取专题第一部分：第一部分：DNA提取方法简介提取方法简介前言前言DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象。为信息分子，是分子生物学研究的主要对象。为了进行测序、杂交和基因的表达，获得高分子了进行测序、杂交和基因的表达，获得高分子量和高纯度的量和高纯度的DNA是非常重要的前提。是非常重要的前提。DNA提取原则提取原则q 保证DNA结构的完整性q 纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质q 排除有机溶剂和金属离子的污染q 蛋白质、多糖、脂类等降低到最低程度q 排除其他核酸分子的污染DNA提取的几种方法提取的几种方法q染色体染色体DNADNA的提取的提取CTAB法法SDS法法其它其它DNA提取的几种方法提取的几种方法q非染色体非染色体DNA的提取的提取质粒质粒DNA的提取的提取 碱裂解法碱裂解法 煮沸法煮沸法线粒体、叶绿体线粒体、叶绿体DNA的提取的提取 差速离心结合差速离心结合SDS裂解法裂解法基因组基因组DNA CTAB法法qCTAB法原理法原理（植物（植物DNA提取经典方法）提取经典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基十六烷基三甲基溴化铵溴化铵），），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。物。该复合物在高盐溶液中（该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。出来。注：注：CTAB溶液在低于溶液在低于15 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。qCTAB提取缓冲液的经典配方提取缓冲液的经典配方Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合螯合Mg2+或或Mn2+离子，抑制离子，抑制DNase活性；活性；NaCl 提供一个高盐环境，使提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除基因组基因组DNA CTAB法法qCTAB提取缓冲液的改进配方提取缓冲液的改进配方PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。有效去除多糖。qCTAB法流程图法流程图植物材料植物材料裂解液裂解液上层溶液上层溶液液氮研磨液氮研磨抽提抽提细胞裂解细胞裂解干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液基因组基因组DNA CTAB法法q SDS法原理法原理基因组基因组DNASDS法法SDS是是一一种种阴阴离离子子去去垢垢剂剂，在在高高温温（5565）条条件件下下能能裂裂解解细细胞胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提提高高盐盐(KAc或或NH4Ac)浓浓度度并并降降低低温温度度（冰冰浴浴），使使蛋蛋白白质质及及多多糖糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；杂质沉淀，离心后除去沉淀；上上清清液液中中的的DNA用用酚酚/氯氯仿仿抽抽提提，反反复复抽抽提提后后用用乙乙醇醇沉沉淀淀水水相相中中的的DNA。q SDSSDS法流程图法流程图 （以动物组织为例）（以动物组织为例）动物组织动物组织细胞裂解细胞裂解上层溶液上层溶液组织匀浆组织匀浆抽提抽提干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液基因组基因组DNASDS法法基因组基因组DNA其它方法其它方法物理方式物理方式：玻璃珠法、：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法超声波法、研磨法、冻融法化学方式化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法：异硫氰酸胍法、碱裂解法生物方式生物方式：酶法：酶法q根据细胞裂解方式的不同有：根据细胞裂解方式的不同有：基因组基因组DNA其它方法其它方法吸附材料结合法：吸附材料结合法：q根据核酸分离纯化方式的不同有：根据核酸分离纯化方式的不同有：硅质材料硅质材料阴离子交换树脂阴离子交换树脂磁珠磁珠高盐低高盐低pHpH值结合核酸，低盐高值结合核酸，低盐高pHpH值洗脱。值洗脱。快捷高效。快捷高效。低盐高低盐高pHpH值结合核酸，高盐低值结合核酸，高盐低pHpH值洗脱。值洗脱。适用于纯度要求高的实验。适用于纯度要求高的实验。磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。物，从而达到分离目的。基因组基因组DNA其它方法其它方法浓盐法浓盐法：有机溶剂抽提法有机溶剂抽提法：密度梯度离心法：密度梯度离心法：利用利用RNP和和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离在盐溶液中溶解度不同，将二者分离有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物质粒质粒DNA碱裂解法碱裂解法q碱裂解法原理碱裂解法原理染色体染色体DNADNA比质粒比质粒DNADNA分子大得多，且染色体分子大得多，且染色体DNADNA为为线状分线状分子，而质粒子，而质粒DNADNA为共价闭合环状分子；为共价闭合环状分子；当用碱处理当用碱处理DNADNA溶液时，线状染色体溶液时，线状染色体DNADNA容易发生变性，共容易发生变性，共价闭环的质粒价闭环的质粒DNADNA在回到中性在回到中性pHpH时即恢复其天然构象；时即恢复其天然构象；变性染色体变性染色体DNADNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒淀，而复性的超螺旋质粒DNADNA分子则以溶解状态存在液相分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。中，从而可通过离心将两者分开。质粒质粒DNA碱裂解法碱裂解法q碱裂解法流程图碱裂解法流程图对数期菌体对数期菌体溶液溶液III中和中和溶液溶液I充分重悬充分重悬溶液溶液II裂解裂解上清液上清液抽提抽提离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀干燥溶解干燥溶解沉淀沉淀质粒质粒DNA溶液溶液质粒质粒DNA煮沸法煮沸法q煮沸法原理煮沸法原理染色体染色体DNADNA比质粒比质粒DNADNA分子大得多，且染色体分子大得多，且染色体DNADNA为为线状分线状分子，而质粒子，而质粒DNADNA为共价闭合环状分子；为共价闭合环状分子；当加热处理当加热处理DNADNA溶液时，线状染色体溶液时，线状染色体DNADNA容易发生变性，共容易发生变性，共价闭环的质粒价闭环的质粒DNADNA在冷却时即恢复其天然构象；在冷却时即恢复其天然构象；变性染色体变性染色体DNADNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒淀，而复性的超螺旋质粒DNADNA分子则以溶解状态存在液相分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。中，从而可通过离心将两者分开。细胞器细胞器DNA差速离心法差速离心法q差速离心法原理差速离心法原理是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。将待分离物质置于均匀介质（蔗糖将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进中，以一定的转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分离。从而得以分离。线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋白，它们的白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。种组分分级分离出来。第一部分：第一部分：DNA提取方法简介提取方法简介内容内容第二部分：第二部分：DNA提取及常见问题分析提取及常见问题分析DNA提取的基本步骤提取的基本步骤I.I.材料准备材料准备II.II.破碎细胞或包膜内容物释放破碎细胞或包膜内容物释放III.III.核酸分离、纯化核酸分离、纯化IV.IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质沉淀或吸附核酸，并去除杂质 V.V.核酸溶解在适量缓冲液或水中核酸溶解在适量缓冲液或水中材料准备材料准备最好使用新鲜材料，最好使用新鲜材料，低温保低温保存的样品材料不要反复冻融存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组提取血液基因组DNA时，要时，要选择有核细胞（白细胞）选择有核细胞（白细胞）组培细胞培养时间不能过长，组培细胞培养时间不能过长，否则会造成否则会造成DNA降解降解含病毒的液体材料含病毒的液体材料DNADNA含量较含量较少，提取前先富集少，提取前先富集基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取使用处于对数期的新鲜菌体（老使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）化菌体导致开环质粒增加）培养时应加入筛选压力，否则菌培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失体易污染，质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒，如为低尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体拷贝或大质粒，则应加大菌体用量用量菌株不要频繁转接（质粒丢失）菌株不要频繁转接（质粒丢失）细胞裂解细胞裂解材料应适量，过多会影响裂解，材料应适量，过多会影响裂解，导致导致DNA量少，纯度低量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：解预处理方式：植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨组培细胞蛋白酶组培细胞蛋白酶K细菌溶菌酶破壁细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠酵母破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡高温温浴时，定时轻柔振荡基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取菌体量适当菌体量适当培养基去除干净，同时保证菌体培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮在悬浮液中充分悬浮变性的时间不要过长（变性的时间不要过长（5分钟），分钟），否则质粒易被打断否则质粒易被打断复性时间也不宜过长，否则会有复性时间也不宜过长，否则会有基因组基因组DNA的污染的污染G菌、酵母质粒的提取，应先菌、酵母质粒的提取，应先用酶法或机械法处理，以破壁用酶法或机械法处理，以破壁核酸分离、纯化核酸分离、纯化采用吸附材料吸附的方式分离采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提时，应提供相应的缓冲体系供相应的缓冲体系采用有机（酚采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔动作要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法的去杂质的方法基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取核酸分离、纯化核酸分离、纯化q蛋白质的去除：蛋白质的去除：酚酚/氯仿抽提氯仿抽提使用变性剂变性（使用变性剂变性（SDSSDS、异硫氰酸胍等）异硫氰酸胍等）高盐洗涤高盐洗涤蛋白酶处理蛋白酶处理q多糖的去除：多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/21/2体体积的积的5M NaCl5M NaCl，高盐可溶解多糖。高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2(1/2体积体积)，氯苯可，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。用用PEGPEG80008000代替乙醇沉淀代替乙醇沉淀DNADNA：在：在500L DNA500L DNA液中加入液中加入200l 20%PEG200l 20%PEG8000 8000(含含1.2 M NaCl)1.2 M NaCl)，冰浴冰浴20min20min。核酸分离、纯化核酸分离、纯化q多酚的去除：多酚的去除：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：-巯基乙醇、巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如加入易与酚类结合的试剂：如PVPPVP、PEG(PEG(聚乙二醇聚乙二醇)，它，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNADNA的结合的结合核酸分离、纯化核酸分离、纯化q盐离子的去除：盐离子的去除：7070的乙醇洗涤的乙醇洗涤核酸沉淀、溶解核酸沉淀、溶解当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀会更充分沉淀时加入沉淀时加入1/10体积的体积的NaOAc（pH5.2，3M），），有有利于充分沉淀利于充分沉淀沉淀后应用沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用若长期储存建议使用TE缓冲液溶解缓冲液溶解TE中的中的EDTA能螯和能螯和Mg2+或或Mn2+离子，抑制离子，抑制DNasepH值为值为8.0，可防止，可防止DNA发生酸解发生酸解 基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取基因组基因组DNA的检测的检测 提取的基因组提取的基因组DNA片段在片段在20kb30kb之间之间高质量的基因组高质量的基因组DNA带型带型 单一无拖尾现象单一无拖尾现象DNA浓度及纯度的检测浓度及纯度的检测 A260=1 约约 50 g/mL 双链双链DNA；A260/280 约为约为1.8 DNA提取常见问题提取常见问题q问题一：问题一：DNADNA样品不纯，抑制后续酶解和样品不纯，抑制后续酶解和PCRPCR反应。反应。1.1.DNADNA中含有蛋白、多中含有蛋白、多糖、多酚类杂质糖、多酚类杂质2.2.DNADNA在溶解前，有酒在溶解前，有酒精残留，酒精抑制精残留，酒精抑制后续酶解反应后续酶解反应3.3.DNADNA中残留有金属离中残留有金属离子子4.4.有有RNARNA的存留的存留 原因原因对对策策1.1.重新纯化重新纯化DNADNA，过吸附过吸附柱去除蛋白、多糖、柱去除蛋白、多糖、多酚等杂质多酚等杂质2.2.重新沉淀重新沉淀DNADNA，让酒精让酒精充分挥发充分挥发3.3.增加增加7070乙醇洗涤的乙醇洗涤的次数（次数（2-32-3次）次）4.4.加入加入RNaseRNase降解降解RNARNADNA提取常见问题提取常见问题q问题二：问题二：DNADNA降解。降解。1.1.材料不新鲜或反复冻材料不新鲜或反复冻融融2.2.未很好抑制内源核酸未很好抑制内源核酸酶的活性酶的活性3.3.提取过程操作过于剧提取过程操作过于剧烈，烈，DNADNA被机械打断被机械打断4.4.外源核酸酶污染外源核酸酶污染5.5.反复冻融反复冻融 原原因因对对策策1.1.尽量取新鲜材料，低温保存材料避尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融免反复冻融2.2.液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液前加入裂解缓冲液3.3.在提取内源核酸酶含量丰富的材料在提取内源核酸酶含量丰富的材料的的DNADNA时，可增加裂解液中螯合剂时，可增加裂解液中螯合剂的含量，细胞裂解后的后续操作应的含量，细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔尽量轻柔4.4.所有试剂用无菌水配制，耗材经高所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌温灭菌5.5.将将DNADNA分装保存于缓冲液中，避免分装保存于缓冲液中，避免反复冻融反复冻融DNA提取常见问题提取常见问题q问题三：问题三：DNADNA提取量少。提取量少。1.1.实验材料不佳或量少实验材料不佳或量少2.2.破壁或裂解不充分破壁或裂解不充分3.3.吸附或沉淀不完全吸附或沉淀不完全4.4.洗涤时洗涤时DNADNA丢失丢失 原原因因对对策策1.1.尽量选用新鲜（幼嫩）的材尽量选用新鲜（幼嫩）的材料料2.2.动植物要匀浆研磨充分；动植物要匀浆研磨充分；G G菌、酵母裂解前先用生物酶菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁。高温裂解或机械方式破壁。高温裂解时，时间适当延长（对于动时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加物细胞、细菌可增加PKPK的用的用量）。量）。3.3.增加吸附的时间，或低温沉增加吸附的时间，或低温沉淀淀4.4.小心操作小心操作RNA提取专题提取专题第二部分：第二部分：RNA提取及常见问题分析提取及常见问题分析第一部分：第一部分：RNA提取方法简介提取方法简介分离提纯分离提纯RNA的目的的目的分析不同发育时期基因的表达状况分析不同发育时期基因的表达状况获得新基因获得新基因研究基因的拼接研究基因的拼接分析相应的蛋白产物分析相应的蛋白产物RNA的不稳定性的不稳定性 由于核糖残基的由于核糖残基的2和和3位置带有羟基，位置带有羟基，RNA易易于被于被RNA酶切割水解酶切割水解 RNA酶含量丰富，加热后仍能够正确折叠恢复酶含量丰富，加热后仍能够正确折叠恢复活性，不易失活活性，不易失活提取提取RNA的注意事项的注意事项经常更换新手套。因为皮肤和实验室用品上可能经常更换新手套。因为皮肤和实验室用品上可能有有RNase，会导致会导致RNase污染。污染。使用灭过菌的塑料制品和枪头避免交叉污染。使用灭过菌的塑料制品和枪头避免交叉污染。应使用不含应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150烘烤烘烤4小时，塑料器皿可在小时，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。常用常用RNA酶抑制剂酶抑制剂焦磷酸二乙酯（焦磷酸二乙酯（DEPC）：）：与与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，强烈但不彻底的合使蛋白质变性，强烈但不彻底的RNA酶抑制剂酶抑制剂。异硫氰酸胍：异硫氰酸胍：目前是最有效的目前是最有效的RNA酶抑制剂，裂解组织的同时也使酶抑制剂，裂解组织的同时也使RNA酶失活。既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对酶失活。既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。酶有强烈的变性作用。氧钒核糖核苷复合物：氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。酶的活性。RNA酶的蛋白抑制剂（酶的蛋白抑制剂（RNasin）：）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。的酸性糖蛋白。RNasin是是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种多种RNA酶结合，使其失活。酶结合，使其失活。其它：其它：SDS、尿素、硅藻土等对尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。酶也有一定抑制作用。RNA提取专题提取专题第二部分：第二部分：RNA提取及常见问题分析提取及常见问题分析第一部分：第一部分：RNA提取方法简介提取方法简介RNA提取的步骤提取的步骤材料的裂解材料的裂解杂质的去除杂质的去除RNA的吸附或沉淀的吸附或沉淀异硫氰酸胍异硫氰酸胍，亚硫氢胍，巯基乙醇，亚硫氢胍，巯基乙醇，N-月桂肌氨酸月桂肌氨酸 等。使细胞及核蛋白复等。使细胞及核蛋白复合物变性，释放合物变性，释放RNA，有效抑制核酸有效抑制核酸酶。酶。苯酚，氯仿，异戊醇抽提去除杂物，苯酚，氯仿，异戊醇抽提去除杂物，使使DNA及蛋白沉淀到有机相。及蛋白沉淀到有机相。硅质材料的吸附硅质材料的吸附或用异丙醇沉淀浓缩或用异丙醇沉淀浓缩RNA。经经DEPC 处理的水溶解处理的水溶解RNA材料准备及裂解材料准备及裂解尽量使用新鲜材料，植物组织选取杂质少生长较快的幼嫩部位，尽量使用新鲜材料，植物组织选取杂质少生长较快的幼嫩部位，现取现提。现取现提。组培细胞及血液应尽量离心去除培养液和上清，消化系统的组组培细胞及血液应尽量离心去除培养液和上清，消化系统的组织选取杂质少的部位织选取杂质少的部位,细菌和酵母需要匀浆处理。细菌和酵母需要匀浆处理。对不能马上提取的样品切成小块后立即投入液氮冷冻，或投入对不能马上提取的样品切成小块后立即投入液氮冷冻，或投入专门的专门的RNA样品储存液中保存。样品储存液中保存。液氮研磨时不要使液氮挥发净，随时补充；加入裂解液并且彻液氮研磨时不要使液氮挥发净，随时补充；加入裂解液并且彻底而迅速地匀浆。底而迅速地匀浆。RNA的提取的提取杂质的抽提杂质的抽提采用有机（酚采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀氯仿）抽提时应充分混匀离心分离两相时，应保证一定的转速和时间，使蛋白质、多糖和离心分离两相时，应保证一定的转速和时间，使蛋白质、多糖和DNADNA分布到中间层和有机相中，分布到中间层和有机相中，RNARNA留在水相中留在水相中对脂肪含量较多的样品注意不要吸入油质层，可以再次用有机溶对脂肪含量较多的样品注意不要吸入油质层，可以再次用有机溶剂抽提剂抽提RNA的提取的提取RNA的沉淀和溶解的沉淀和溶解含含RNARNA的水相过吸附柱，通过去蛋白液和漂洗液去除蛋白多糖的水相过吸附柱，通过去蛋白液和漂洗液去除蛋白多糖等杂质等杂质或使用异丙醇沉淀或使用异丙醇沉淀RNARNA应充分的混匀并放置应充分的混匀并放置10min10min左右离心收集左右离心收集沉淀，沉淀，7070乙醇洗涤，晾干乙醇洗涤，晾干用经用经DEPC处理过的水或专门的试剂来洗脱或溶解处理过的水或专门的试剂来洗脱或溶解RNA样品收集后或需长期保存时应置于样品收集后或需长期保存时应置于70 或加入或加入RNase抑制剂，抑制剂，分装使用分装使用RNA的提取的提取RNA的检测的检测电泳槽系统的处理电泳槽系统的处理乙二醛化琼脂糖凝胶电泳乙二醛化琼脂糖凝胶电泳含有甲醛的琼脂糖凝胶电泳含有甲醛的琼脂糖凝胶电泳RNA纯度及浓度的检测纯度及浓度的检测 （A260=1，约，约40 g/mL RNA；A260/A280 约为约为1.9-2.1）1 1 抽提过程不彻底存抽提过程不彻底存在蛋白或多糖多酚在蛋白或多糖多酚的污染的污染2 DNA 2 DNA 的污染的污染 3 离子浓度较高离子浓度较高 原因原因对对策策1 保证彻底的裂解和一定保证彻底的裂解和一定转数一定时间的离心；转数一定时间的离心；增加有机溶剂抽提的次增加有机溶剂抽提的次数数，用吸附柱纯化，用吸附柱纯化2 2 减少处理样品的量；加减少处理样品的量；加入不含入不含RNaseRNase的的DNaseDNase处处理；再次纯化理；再次纯化3 3 增加漂洗次数增加漂洗次数RNA提提取常见问题取常见问题q问题一：问题一：RNA样品不纯样品不纯1 1 样品含有杂质杂液样品含有杂质杂液 2 2 样品过量或样品裂解样品过量或样品裂解 和匀浆不彻底和匀浆不彻底3 RNA3 RNA未有效的吸附沉未有效的吸附沉淀或洗脱淀或洗脱4 4 样品样品RNARNA含量少含量少 原因原因对对策策1 1 去除样品中的杂质，离去除样品中的杂质，离心除净样品中的培养基心除净样品中的培养基或储存液或储存液 2 2 减少样品用量；充分研减少样品用量；充分研磨样品，增加裂解液的磨样品，增加裂解液的用量和裂解的时间用量和裂解的时间3 3 延长吸附时间或保证异延长吸附时间或保证异丙醇沉淀的时间和离心丙醇沉淀的时间和离心时间；再次洗脱时间；再次洗脱4 4 重复吸附，加入肝糖等重复吸附，加入肝糖等有助有助RNARNA沉淀的试剂沉淀的试剂RNA提提取常见问题取常见问题q问题二：问题二：RNA得率低得率低1 1 样品不新鲜或样品样品不新鲜或样品保存不当，保存不当，RNARNA降解降解2 2 污染了污染了RNaseRNase3 3 样品储存不当样品储存不当 原因原因对对策策1 1 尽量取新鲜的样品；取样尽量取新鲜的样品；取样后立即放入液氮保存；或后立即放入液氮保存；或放入专门的储存液内；研放入专门的储存液内；研磨样品及时补充液氮磨样品及时补充液氮2 2 认真地处理相应的器具和认真地处理相应的器具和试剂；严格地操作试剂；严格地操作3 -70 3 -70 冻存，分装使用；冻存，分装使用；加入加入RNaseRNase抑制剂抑制剂RNA提提取常见问题取常见问题q问题三：问题三：RNARNA容易降解容易降解