3. 总RNA的提取,电泳鉴定及RT-PCR.ppt

实验二、实验二、RNA提取及提取及RT-PCR实验内容实验内容1、小鼠肝脏组织总、小鼠肝脏组织总RNA的提取的提取2、RNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳3、以、以RNA为模板进行为模板进行RT-PCR4、PCR产物的电泳及回收产物的电泳及回收实验一实验一.提取小鼠肝脏组织的提取小鼠肝脏组织的RNARNA一、真核细胞的总一、真核细胞的总RNA 1、mRNA:1-5%5鸟鸟嘌嘌呤呤7位甲基化位甲基化CH3修修饰饰。1）免受核酸）免受核酸酶酶破坏，破坏，2）起始、促）起始、促进进蛋白蛋白质质合成。合成。3poly(A)尾巴尾巴结结构构 20-200个个A.翻翻译译所必需。所必需。起始密起始密码码：AUG 终终止密止密码码：UAA,UAG,UGA。2、tRNA:10-15%3、rRNA:80-85%大大亚亚基基60S:28S=4718nt 5S=120nt 5.8S=160nt 小小亚亚基基40S:18S=1874nt二、二、RNA提取的注意事项提取的注意事项 RNA酶酶：广泛存在：灰：广泛存在：灰尘尘、人体唾液、人体唾液、实验实验器材表面。器材表面。生物活性非常生物活性非常稳稳定：耐定：耐热热、耐酸、耐碱。、耐酸、耐碱。1、尽量避免外源性尽量避免外源性RNase 污污染染 A.操作操作环环境空气境空气洁净洁净。带带手套、口罩。手套、口罩。B.用新开封的化学用新开封的化学试剂试剂。（。（试剂应该专试剂应该专用）用）C.一次性塑料器材最好是新开封，一次性塑料器材最好是新开封，(DEPC水水处处理后）高理后）高压灭压灭菌。菌。D.玻璃器材、水都玻璃器材、水都应该经过应该经过去去RNase 处处理。理。对对玻璃器材玻璃器材还应该进还应该进行高温烘烤。行高温烘烤。2、抑制内源性、抑制内源性RNase 活性：活性：RNase 抑制抑制剂剂。RNA分离的关键因素：避免分离的关键因素：避免RNA酶的污染。酶的污染。1)1)发放口罩，帽子，每个组来一个人领取。发放口罩，帽子，每个组来一个人领取。将将1 mL Trizol 1 mL Trizol 试剂移入试剂移入EppendorfEppendorf管中。管中。2)2)实验教师操作实验教师操作:取新鲜小鼠肝脏组织，组织块取新鲜小鼠肝脏组织，组织块不宜过大不宜过大,放在玻片上立即研磨放在玻片上立即研磨,研磨要彻底研磨要彻底。3)3)将将研研磨磨后后的的组组织织(小小米米粒粒大大小小)转转移移至至1 1 mL mL Trizol Trizol 试试 剂剂 中中，盖盖 紧紧 盖盖，上上 下下 颠颠 倒倒 混混 合合 2 2 minmin以以 上上。使使组组织织细细胞胞充充分分裂裂解解。肉肉眼眼观观察察可可见见液液体体变变成成均均匀匀浑浑浊状。浊状。4)4)室温孵育室温孵育10 min10 min。三、三、RNA提取的实验操作提取的实验操作 播放有声课件播放有声课件1:RNA提取方法及注意事项提取方法及注意事项1 1、异硫氰酸胍法：、异硫氰酸胍法：GuSCN GuSCN 是一种强的蛋白质变性剂，能够裂解是一种强的蛋白质变性剂，能够裂解细胞的同时，还能有效地抑制内源性细胞的同时，还能有效地抑制内源性 RnaseRnase的活性，的活性，通过有机溶剂的分步抽提，可获得纯度较高的细胞总通过有机溶剂的分步抽提，可获得纯度较高的细胞总RNARNA。特点：需低温操作，但价格经济。特点：需低温操作，但价格经济。2 2 2 2、Trizol Trizol Trizol Trizol 试剂试剂试剂试剂（商品化产品）（商品化产品）（商品化产品）（商品化产品）特点：在室温下可以提取细胞总特点：在室温下可以提取细胞总特点：在室温下可以提取细胞总特点：在室温下可以提取细胞总RNARNARNARNA，简单、快速、提取量大、纯度高。简单、快速、提取量大、纯度高。简单、快速、提取量大、纯度高。简单、快速、提取量大、纯度高。3 3、mRNAmRNA提取试剂盒提取试剂盒 真核细胞真核细胞mRNAmRNA的的3 3末端有末端有ploy(A)ploy(A)尾，利用寡聚尾，利用寡聚 dTdT纤维素结合纤维素结合mRNAmRNA，将其从细胞总，将其从细胞总RNARNA中分离出来。中分离出来。RNA提取的几种方法提取的几种方法室温孵育室温孵育10 min介绍介绍RNase抑制剂抑制剂1、DEPC(二乙基焦炭酸盐二乙基焦炭酸盐)最常用的最常用的RNase抑制剂抑制剂:与蛋白质中的组氨酸结合，与蛋白质中的组氨酸结合，使蛋白质变性。使蛋白质变性。有效浓度：有效浓度：0.05%-0.1%(DEPC水水)，室温磁力搅拌，室温磁力搅拌20分钟。分钟。用于浸泡各种器材。用于浸泡各种器材。灭活条件：高压。灭活条件：高压。在在Tris溶液中半衰期为溶液中半衰期为1.25min。试剂的配制试剂的配制:无无RNase的溶液的溶液(用用DEPC水配制水配制,高压高压)储存方法：不能用聚苯乙烯器皿。储存方法：不能用聚苯乙烯器皿。4 C，或液氮中。，或液氮中。2、肝素：、肝素：使用浓度：使用浓度：0.110mg/ml 效效 果果:37 C 时，可抑制时，可抑制95%的的RNase 活力。活力。如果与如果与DEPC联合应用，联合应用，具有极强的抑制效果。具有极强的抑制效果。5)加入加入200 l氯仿，震荡混匀氯仿，震荡混匀20-30 s，室温放置室温放置5 min（此期间液体开始分层，不（此期间液体开始分层，不要轻易搅动液体）。要轻易搅动液体）。6)10000 rpm，离心离心 5 minRNA(清澈透明清澈透明)DNAProtein7)将清澈透明的将清澈透明的上层水相上层水相 转移至另一离心管中。转移至另一离心管中。有声有声课课件件2:RNA干燥及溶解技巧干燥及溶解技巧8)沉淀沉淀RNA：加加0.5 ml异丙醇异丙醇，上下颠倒混匀，室温，上下颠倒混匀，室温10 min。10,000 rpm，4 C，离心，离心10 min弃上清。弃上清。)加加1ml 75%乙醇乙醇洗涤管壁。洗涤管壁。(注意贴管壁在沉淀的对侧缓慢加入，不要搅动沉淀注意贴管壁在沉淀的对侧缓慢加入，不要搅动沉淀)10)7500rpm，4 C 离心离心 1 min，弃上清，弃上清 再离心几秒钟，再离心几秒钟，将管壁液体（用加样器）完全移净。将管壁液体（用加样器）完全移净。用用TriZol试剂提取总试剂提取总RNA时，全程均在室温进行。时，全程均在室温进行。当当RNA沉淀用水溶解后，应该注意在冰上操作，操作要迅速。沉淀用水溶解后，应该注意在冰上操作，操作要迅速。11)11)室温室温干燥干燥3 35 min5 min （根根据据RNARNA沉沉淀淀大大小小决决定定，干干燥燥后后的的沉沉淀淀应应该该是是无无色胶样透明状，避免过分干燥色胶样透明状，避免过分干燥,此此步骤非常关键步骤非常关键。）。）注意事项注意事项：RNA:避免放在避免放在37 C孵箱中过度干燥以防无孵箱中过度干燥以防无法溶解。法溶解。RNA沉淀必须绝对干燥，微量乙醇残留，沉淀必须绝对干燥，微量乙醇残留，容易造成容易造成RT的失败，但过分干燥又是造成的失败，但过分干燥又是造成RNA不溶解的主要原因不溶解的主要原因。判断判断RNA沉淀是否充分干燥但又不是过沉淀是否充分干燥但又不是过分干燥是逆转录成功的关键环节。分干燥是逆转录成功的关键环节。RNA pellet：透明胶样：透明胶样干燥后应该无色透明干燥后应该无色透明1212）RNARNA的的溶溶解解：用用加加样样器器吸吸取取冰冰冷冷DEPC-HDEPC-H2 2O O 13.5 13.5 l l，加加到到RNARNA上，进行吹打溶解上，进行吹打溶解RNA RNA 沉淀。沉淀。溶解的溶解的RNARNA应置冰上保存应置冰上保存。13)13)吸出吸出 4.5 4.5 l l溶液放到冰上备用溶液放到冰上备用(将用于电泳将用于电泳).).14)14)剩余剩余 9 9 l l溶液溶液,放到冰上备用（将用于放到冰上备用（将用于RTRTPCRPCR）.v注意：注意：RNA沉淀的溶解一定要耐心充沉淀的溶解一定要耐心充分，分，一定一定要用加要用加样样器器反复反复多次吹打方可。多次吹打方可。但由于溶液体但由于溶液体积积非常小，要避免出非常小，要避免出现现气气泡影响泡影响RNA的溶解。的溶解。避免气泡的方法：避免气泡的方法：用加样器的第一挡用加样器的第一挡每次吹打都不要打出气体每次吹打都不要打出气体判断溶解程度：判断溶解程度：吹打时液体流动不拐弯吹打时液体流动不拐弯为止。为止。实验二实验二.RNA 的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳 基本过程同基本过程同DNA电泳一样，但应明确一点的是，电泳一样，但应明确一点的是，因为因为RNA分子对分子对RNA酶的作用非常敏感，因此必酶的作用非常敏感，因此必须用对须用对RNA酶有抑制作用酶有抑制作用DEPC水水来配置所有溶液，来配置所有溶液，所有与所有与RNA接触的仪器和装置都要严格处理以尽接触的仪器和装置都要严格处理以尽量减少量减少RNA酶对样品的降解酶对样品的降解RNA 的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳 RNA样样品：品：4.5 l 上样缓冲液：上样缓冲液：1 l 混匀后，混匀后，5.5 l 直接直接电电泳上泳上样样（100伏，伏，1030分分钟钟）上上样样前前预电预电泳泳5min。注意注意:电泳槽的清洁！电泳槽的清洁！所有试剂、器材、溶液需要灭所有试剂、器材、溶液需要灭RNA酶处理。酶处理。琼脂糖凝胶要新鲜配制！琼脂糖凝胶要新鲜配制！紫外透射仪观察电泳结果紫外透射仪观察电泳结果RNA的的电电泳上泳上样样：RNA电电泳泳结结果果 rRNA rRNA可以作为内部可以作为内部MarkerMarker分子，通过观察分子，通过观察rRNArRNA的两条带的两条带（28S28S和和18S18S）的比）的比例例，可以判断所提取，可以判断所提取mRNAmRNA是是否存在降解。否存在降解。RNARNA电泳并不能判断电泳并不能判断mRNAmRNA是否提取成功，也不作为鉴是否提取成功，也不作为鉴定定RNARNA提取质量的常规方法，提取质量的常规方法，因为因为在电泳过程中在电泳过程中RNARNA可能发可能发生降解生降解。分析本次实验结果：分析本次实验结果：28S、18S和和5S的比例。的比例。RNA电电泳泳结结果分析果分析实验三：逆转录反应及实验三：逆转录反应及PCR（RT-PCR)逆逆转录转录酶酶：存在于逆转录病毒体内。存在于逆转录病毒体内。常见有哺乳动物型常见有哺乳动物型37oC，禽类，禽类型型42oC。以以mRNA为模板的为模板的DNA聚聚合酶，形成与合酶，形成与RNA碱基相互补碱基相互补DNA链，后者称为互补链，后者称为互补DNAcDNA。RNAaseH的活性：切掉的活性：切掉DNA和和RNA杂合链上的杂合链上的RNA。逆转录反应原理逆转录反应原理AAAAAA(n)mRNAAAAAAA(n)3-TTTTTT(18)-568-70oC,annealingAAAAAA(n)3-TTTTTT(18)-537-42oC,RTase mRNAmRNAcDNA10min1-2h 逆转录逆转录有声有声课课件件3:RT 的原理和注意事的原理和注意事项项 总总RNA 9 l Oligo dT(0.05 g/ml)1 l(终：终：2.5 ng/ml)轻弹管底混合，轻弹管底混合，置置65水浴水浴10min，立即冰浴立即冰浴2min（防止（防止RNA形成二级结构）。形成二级结构）。第一步：打开第一步：打开RNA链之间的二级结构，链之间的二级结构，使使Oligo dT 特异性地结合到特异性地结合到 PolyA 尾。尾。5 RT-buffer 4 l RNasin(RNA酶抑制剂，酶抑制剂，40U/ml)1 l dNTPs(10mmol/L)4 l AMV （逆转录酶）（逆转录酶）1 l 轻弹管底混合。置轻弹管底混合。置42 oC 水浴水浴1h。第二步：向上述反应溶液中依次加入下列试剂第二步：向上述反应溶液中依次加入下列试剂第三步：第三步：将上述反应移至将上述反应移至68 oC水浴水浴10min以灭活以灭活 RTase，并冰浴，保存备用，并冰浴，保存备用午午 休休 PCR反应体系的建立反应体系的建立 PCR 反应的进行反应的进行 PCR产物的电泳产物的电泳 结果观察与分析结果观察与分析 PCR产物产物回收回收实验操作内容实验操作内容 有声课件有声课件（1）：）：PCR的基本原理的基本原理及反应体系的组成及反应体系的组成PCR反应动画反应动画目的目的基因片断的体外基因片断的体外扩扩增增（2）：PCR 反应条件的反应条件的确定及确定及PCR常见问题的解常见问题的解决方案决方案1）模板）模板DNA(上次课逆转录的上次课逆转录的cDNA）4 l2）加入下列试剂）加入下列试剂,，顺序可以改变，顺序可以改变 10X PCR buffer(含含MgCl2)5 l dNTPs(10mM)1 l 3 引物引物(10 mol/L)1 l 5 引物引物(10 mol/L)1 l 3）加）加去离子水去离子水，补足，补足50 l最终反应体系最终反应体系4）Taq DNA 聚合酶聚合酶(2U/l)1 l实验操作一、建立实验操作一、建立 PCR PCR 反应体系反应体系3.轻弹管底混匀，然后放入离心机的套管内，用离心机甩一下；轻弹管底混匀，然后放入离心机的套管内，用离心机甩一下；4.将将PCR小管交给老师，老师统一将样品放入小管交给老师，老师统一将样品放入PCR仪。仪。1.取取 1 支支200 l 微量离心管（在第一组同学的实验台上方的平皿里）中，微量离心管（在第一组同学的实验台上方的平皿里）中，用用 Marker 笔笔 在管的在管的侧面侧面 标记；标记；2.依次加入下列试剂：依次加入下列试剂：注意：注意：（1）PCR PCR相关相关相关相关试剂试剂试剂试剂均放在每排均放在每排均放在每排均放在每排实验实验实验实验台上方中台上方中台上方中台上方中间间间间位置位置位置位置处处处处的的的的蓝蓝蓝蓝色色色色 圆圆圆圆盒中盒中盒中盒中 （2）加样的体积要）加样的体积要准确准确，1 l 的体积不的体积不应该应该超过白色枪头的第一个格。超过白色枪头的第一个格。实验操作二、实验操作二、PCR PCR 反应的进行反应的进行1 1、将样品放入、将样品放入 PCR PCR 仪中仪中2.PCR2.PCR反应条件反应条件 94 30 S DNA变性变性 (Denaturation)55 30 S 退火退火 (Annealing)72 45 S 延伸延伸 (Extension)上述温度变化进行上述温度变化进行 30 个循环个循环(cycles)。72 10 min(Further extension)。3.3.将同学们分成三组，分别观察将同学们分成三组，分别观察PCRPCR的温度循环。的温度循环。其它同学课间休息。其它同学课间休息。播放：有声课件播放：有声课件 （PCRPCR讲解讲解1 1）播放：有声课件播放：有声课件 （PCRPCR讲解讲解2 2）播放：播放：PCR PCR 动画动画实验操作实验操作 三、三、PCRPCR产物的电泳产物的电泳1.1.教师指导学生将琼脂糖凝胶（教师指导学生将琼脂糖凝胶（1%1%）放入胶床上。）放入胶床上。2.2.样品制备：样品制备：在在50 l PCRPCR产物中，加入产物中，加入 6 ul 上样液上样液，混匀。，混匀。（上样液上样液：10 Loading buffer 或 6 Loading buffer）3.3.上样：上样：将上述样品加入凝胶加样孔中。将上述样品加入凝胶加样孔中。注意：注意：DNA Marker。4.4.电泳：电泳：100 100 伏，伏，3030分钟。分钟。操作四、操作四、PCRPCR产物的电泳结果观察及分析产物的电泳结果观察及分析GAPDH gene 片段片段(746bp)750bp2000bp1000bp500bp250bp100bpMarker 1 2（2）此）此PCR 结果存在什么问题？结果存在什么问题？原因？你拟采用哪些措施解决上述问题？原因？你拟采用哪些措施解决上述问题？（1）观察：）观察：蓝色箭头指示的是何种蓝色箭头指示的是何种DNA？GAPDH gene 片段片段(746bp)750bp2000bp1000bp500bp250bp100bpMarker 1 2挤胶法回收挤胶法回收PCRPCR产物：产物：（1）在在UV灯灯下下，用用手手术术刀刀片片将将含含DNA片片段段的的琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶切切下，放入下，放入封口膜封口膜中中；（2）将将切切下下来来的的胶胶块块，标标记记好好姓名，姓名，-20冰箱中冰箱中。（3）放放在在封封口口膜膜内内直直接接挤挤压压，用用加加样样器器吸吸取取挤挤压压后后得得到到的的液液体。体。PCR电电泳泳结结果果 实验操作五、实验操作五、PCRPCR产物的回收产物的回收思考题：思考题：1.PCR反反应应的第几个循的第几个循环环开始出开始出现现符合符合预预期期长长度的度的目的目的DNA片段？片段？请请画画图说图说明。明。2.用用Taq DNA聚合聚合酶酶进进行行PCR时时，获获得的得的PCR产产物物的末端都有哪些情形？的末端都有哪些情形？T-A连连接的原理是什么？接的原理是什么？影响影响连连接效率的因素有哪些？接效率的因素有哪些？n实验结束后整理实验台实验结束后整理实验台,n值日生值日值日生值日!