间接免疫荧光实验.ppt
间接免疫荧光实验实验原理实验原理n n固定在载片上的灵长类肝组织和HEp-2细胞与适当稀释的待检血清反应后,如果待检血清中有ANA,就会与细胞核成分特异结合,加入FITC标记的的羊抗人IgG抗体又可与ANA结合,在荧光显微镜下可见细胞核部位呈现荧光。试剂与器材试剂与器材n n1.抗原片n n2.荧光标记的二抗n n3.PBS-Tween缓冲液n n4.阴、阳性参考血清n n5.封片介质:磷酸盐缓冲甘油n n6.盖玻片n n7.器材:荧光显微镜、摇床、脱色缸、吸管、试管等生物薄片生物薄片生生物物薄薄片片马马赛赛克克：将将包包被被有有不不同同基基质质的的生生物物薄薄片片固固定定在在一一个个载载片片反应区中，可同时检测多种抗不同组织或病原体的抗体。反应区中，可同时检测多种抗不同组织或病原体的抗体。滴定平板技术：滴定平板技术：滴定平板技术：滴定平板技术：使实验操作标准化使实验操作标准化使实验操作标准化使实验操作标准化 将将标标本本或或试试剂剂滴滴加加到到加加样样板板反反应应区区上上，然然后后把把生生物物薄薄片片载载片片盖盖在在加加样样板板的的凹凹槽槽里里，所所有有生生物物薄薄片片均均与与液液滴滴接接触触，反反应应同同时时开开始始.系系统统的的几几何何结结构构决决定定了了液液滴滴的的位置和高度位置和高度.荧光二抗荧光二抗荧光素荧光素荧光素荧光素发射的发射的发射的发射的荧光色荧光色荧光色荧光色激发波长激发波长激发波长激发波长（nmnm）发射波长发射波长发射波长发射波长（nmnm）异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素（FITCFITC）绿绿绿绿495495528528荧光素及其激发波长和发射波长荧光素及其激发波长和发射波长荧光显微镜荧光显微镜：主页产品应用价目表新产品资料库公司简介联系我们间接免疫荧光法原理操作流程录像ELISA原理操作流程放射免疫分析法免疫印迹法原理操作流程EUROSCAN软件欧蒙斑点法原理ENA谱操作流程欧蒙印迹法原理操作流程EUROLineScan欧蒙组合SANQUIN公司试剂血型试剂人IgG亚型流式细胞技术细胞因子ELISA和ELISPOTELISPOT分析仪四聚体工艺粒酶自身免疫性疾病抗核抗体（ANA）抗线粒体抗体（AMA）抗肝抗原抗体抗粒细胞浆抗体（ANCA）抗胃壁细胞（PCA）抗体抗甲状腺抗原抗体抗神经元抗原抗体抗肌内膜/麦胶蛋白抗体病原体血清学抗疏螺旋体抗体抗幽门螺杆菌抗体抗EBV抗体抗单纯疱疹病毒（HSV）抗体病原体血清学马赛克IgG/RF吸附剂变态反应性疾病订货信息查询间接免疫荧光法ELISA欧蒙斑点法欧蒙印迹法免疫印迹法间接免疫荧光法ELISA欧蒙斑点法欧蒙印迹法免疫印迹法RIA单页资料小册子资料索取公司简介分销商参考实验室地址行车路线E-Mail荧光模型判度支持载片生物薄片加样板PBS-TweenPBS-Tween甘油/PBS盖玻片落射式荧光显微镜落射式荧光显微镜不需要额外的聚光镜不需要额外的聚光镜可产生高对比度的暗视野可产生高对比度的暗视野同同时时进进行行明明视视野野、暗暗视视野野的抗原基质定位的抗原基质定位可观察两种不同的荧光可观察两种不同的荧光可改变荧光的强度可改变荧光的强度IIF操作步骤操作步骤准备准备准备准备：检查加样板是否反应区亲水而周边疏水。从试剂检查加样板是否反应区亲水而周边疏水。从试剂盒中取出载片，等平衡到室温时方可打开包装。注意不要盒中取出载片，等平衡到室温时方可打开包装。注意不要触及生物薄片。用笔编号、标记。触及生物薄片。用笔编号、标记。稀释稀释稀释稀释：用磷酸盐缓冲液用磷酸盐缓冲液1:1001:100稀释血清。注意：阳性和阴稀释血清。注意：阳性和阴性对照不需稀释，使用前要混匀性对照不需稀释，使用前要混匀加样加样加样加样：将加样板放在泡沫板上，按顺序分别滴加将加样板放在泡沫板上，按顺序分别滴加25ul25ul稀稀释后的血清至加样板的反应区中，避免产生气泡。滴加完释后的血清至加样板的反应区中，避免产生气泡。滴加完所有待测标本后才开始温育。所有待测标本后才开始温育。第一次温育第一次温育第一次温育第一次温育：将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在加将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在加样板的凹槽里，反应立即开始。确保每一个标本均与生物样板的凹槽里，反应立即开始。确保每一个标本均与生物薄片接触，且标本间互不接触。室温温育薄片接触，且标本间互不接触。室温温育3030分钟。分钟。清洗清洗清洗清洗：用磷酸盐缓冲液流水冲洗载片用磷酸盐缓冲液流水冲洗载片1 1秒钟（注意水流秒钟（注意水流不要太急，不要直接对着基质冲），然后立即将其浸入装不要太急，不要直接对着基质冲），然后立即将其浸入装有磷酸盐缓冲液的脱色缸中浸洗有磷酸盐缓冲液的脱色缸中浸洗5 5分钟。分钟。加样加样加样加样：滴加：滴加20ul FITC20ul FITC标记的羊抗人标记的羊抗人IgGIgG至洁净加样板的至洁净加样板的反应区中，完全加完所有的二抗后，方可继续温育。注意：反应区中，完全加完所有的二抗后，方可继续温育。注意：标记的标记的IgGIgG使用前需混匀。使用前需混匀。第二次温育第二次温育第二次温育第二次温育：从磷酸盐缓冲液中取出一张载片，用吸水从磷酸盐缓冲液中取出一张载片，用吸水纸擦一下背面和边缘后，立即将载片覆有生物薄片的一面纸擦一下背面和边缘后，立即将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在加样板的凹槽里。朝下，盖在加样板的凹槽里。注意：为防止破坏基质，不注意：为防止破坏基质，不要擦拭反应区的间隙要擦拭反应区的间隙。检查生物薄片是否与液滴接触良好，。检查生物薄片是否与液滴接触良好，注意避免阳光直射载片。注意避免阳光直射载片。清洗清洗清洗清洗：同上。同上。封片封片封片封片：将盖玻片直接放在泡沫板的凹槽里。滴加将盖玻片直接放在泡沫板的凹槽里。滴加10ul10ul封封片介质至盖玻片每一反应区。从磷酸盐缓冲液中取出一张片介质至盖玻片每一反应区。从磷酸盐缓冲液中取出一张载片，用纸擦干背面和四边，载片，用纸擦干背面和四边，注意不要擦拭反应区间隙。注意不要擦拭反应区间隙。将载片覆有生物薄片的一面朝下放在已准备好的盖玻片上，将载片覆有生物薄片的一面朝下放在已准备好的盖玻片上，立即查看并轻轻调整使盖玻片嵌入到载片的凹槽里。立即查看并轻轻调整使盖玻片嵌入到载片的凹槽里。结果判断结果判断结果判断结果判断：荧光显微镜下观察特异的荧光模型。荧光显微镜下观察特异的荧光模型。以以HEp-2HEp-2细胞为基质检测细胞为基质检测ANAANA免疫荧光模式免疫荧光模式均质型均质型 颗粒型颗粒型核仁型核仁型 核膜型核膜型实验报告实验报告阴性：阴性：阴性：阴性：检测系统正常，待测标本在合适的起始稀释度下，实验基检测系统正常，待测标本在合适的起始稀释度下，实验基检测系统正常，待测标本在合适的起始稀释度下，实验基检测系统正常，待测标本在合适的起始稀释度下，实验基质没有明显的荧光染色（与阴性对照在同一水平），或没有可以质没有明显的荧光染色（与阴性对照在同一水平），或没有可以质没有明显的荧光染色（与阴性对照在同一水平），或没有可以质没有明显的荧光染色（与阴性对照在同一水平），或没有可以辨认的荧光模式辨认的荧光模式辨认的荧光模式辨认的荧光模式 阳性：阳性：阳性：阳性：检测系统正常，待检标本在合适的起始稀释度下，产生明检测系统正常，待检标本在合适的起始稀释度下，产生明检测系统正常，待检标本在合适的起始稀释度下，产生明检测系统正常，待检标本在合适的起始稀释度下，产生明显高于阴性对照的特异荧光，且有明显可以辨认的荧光模式显高于阴性对照的特异荧光，且有明显可以辨认的荧光模式显高于阴性对照的特异荧光，且有明显可以辨认的荧光模式显高于阴性对照的特异荧光，且有明显可以辨认的荧光模式 免疫荧光模式：免疫荧光模式：免疫荧光模式：免疫荧光模式：阳性结果应报告阳性结果应报告阳性结果应报告阳性结果应报告 滴度：滴度：滴度：滴度：与相同稀释倍数的阴性血清比较，能观测到特异性荧光反与相同稀释倍数的阴性血清比较，能观测到特异性荧光反与相同稀释倍数的阴性血清比较，能观测到特异性荧光反与相同稀释倍数的阴性血清比较，能观测到特异性荧光反应的最高稀释度，报告滴度利于病情监测应的最高稀释度，报告滴度利于病情监测应的最高稀释度，报告滴度利于病情监测应的最高稀释度，报告滴度利于病情监测n n阳性标本经系列稀释后可测出其滴度。最适稀释因子为3.162（10的平方根），这样，每隔一步就出现一个10的整数倍数（1:10、1:32、1:100、1:320、1:1000等）。【注意事项注意事项】1每次试验应该设阳性和阴性对照。2 应注意荧光抗体的质量。3 标本应及时检测，并避光保存。
