2023年肝糖原的提取.鉴定与定量肝糖原的提取与鉴定.docx

2023年肝糖原的提取.鉴定与定量肝糖原的提取与鉴定 生物化学试验报告 姓 名： 学 号： 3130010071 专业年级： 2023级临床医学 组 别： 第2试验室 生物化学与分子生物学试验教学中心 试验名称 肝糖原的提取、鉴定、分别 试验日期 2023-12-25 合作者 评分 陈海玲 老师签名 试验地点 第2试验室 指导老师 朱利娜 批改日期 一、试验目的 1、驾驭组织样品的制备方法，了解其留意事项。 2、了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和留意事项，驾驭其操作方法。 3、正确操作运用刻度吸管和可调微量取液器。 4、娴熟运用溶液混匀的各种方法。 5、正确驾驭溶液转移的操作。 6、正确操作运用分光光度计。 二、试验原理 肝糖原的提取 糖原储存于细胞内，采纳沉没匀浆等方法可使细胞破裂，低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清液中，从而使糖原与蛋白质等其他成分分别开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水，故先用95%乙醇将绿叶中糖原沉淀，再溶于热水中。 糖原的鉴定 糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可判定肝组织中糖原的的存在。 CuSO 4 + 2NaOH = Na2SO 4 + Cu(OH)2Cu(OH)2 + C6H 12O 6 = 2CuOH + 氧化型葡萄糖 + H2O 2CuOH = H20 + Cu2红色) Cu(OH)2 = H2黑色) 肝糖原的定量 糖原在浓酸中可水解为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物5-羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在620nm 处有最大汲取。糖含量在10100mg 范围内，溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量的标准溶液比色，通过标准比照法即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中特别稳定，故在显色之前，肝组织先置于浓碱中加热，以破坏其他成分，而保留肝糖原。 三、试验材料 仪器： 1、一般离心机，室温-100恒温水浴箱（x2），722型分光光度计，精度为 10mg 级电子天平 2、剪刀、镊子、研钵 3、试管架，离心管，试管 4、刻度吸量管（2ml ,5ml），1000l 微量可调取液器 5、100ml 容量瓶 6、白瓷反应板 试剂： 鸡肝、95%乙醇、0.31mol/L(5%)三氯醋酸溶液、0.15mol/L NaCl溶液、浓HCl 、 12.5mol/L(50%)NaOH、碘试剂、班氏试剂、30%KOH溶液、标准葡萄糖液（50mg/L） 蒽酮显色剂 四、试验步骤 肝糖原的提取 鸡肝约1.5g ，剪碎 +5%CClCOOH 1ml 3 研磨至乳状 +5%CCl3COOH 3ml 研磨成肝匀浆 全部转入离心管中，离心3min （4000r/min） 取上清液 +5ml 95%乙醇，混匀，静置10min 离心5min （ 4000r/min） 取沉淀 +蒸馏水2ml 沸水浴2min ，溶解沉淀 +浓HCl 0.2ml 15min ，冷却 糖原溶液0.1ml 呈色对比 +班氏试剂0.2ml(4d) 混匀 沸水浴，视察改变 留意事项： 1、提取肝糖原时，向上清液中加入等量的95%乙醇后，必需混匀。由于上清液为水溶液，比重大于95%乙醇，溶液分成两层。加之上清液已4ml 多，加上等量 乙醇，总量接近9ml ，混匀操作比较困难，最好用倾倒混匀，或用玻璃棒搅拌混匀。 2、糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基数的多少有关。葡萄糖残基在20个以下的会使碘呈现红色，20-30个之间使碘呈现紫色，60个以上的会使碘呈现蓝色。淀粉中分支链较长，故呈蓝色，而肝糖原分枝中的葡萄糖残基在20个以下（通常8-12个葡萄糖残基），吸附碘后呈现红棕色。 3、糖原水解液中鉴定葡萄糖时，加班氏试剂不能过量，否则反应液呈黑色浑浊，视察不到应有的结果。 肝糖原定量测定 鸡肝 0.15 g +30% KOH 1.5ml 沸水浴15min 冷却，全部转入100ml 容量瓶中 加水至标线，细致混匀，获得糖原提取液 取3支干净的试管，按下表操作： 试剂（ml ） 空白管 蒸馏水 标准葡萄糖溶液 糖原提取液 0.2%蒽酮溶液 1.0 2.5 标准管 1.0 2.5 样品管 1.0 2.5 混匀，沸水浴10min ，冷却。在722型或721型分光光度计620nm 波特长，用空 白管溶液调零，测定各管溶液的吸光度（A ）. 计算： 肝糖原（g/100g肝组织）= 100A 测定100 X 0.05 X X X 1.11 A 标准肝组织重（g ）1000 五、试验现象与结果探讨 糖原水解液加班氏试剂沸水浴后无明显改变。 糖原溶液加碘试剂后呈红棕色，但与碘试剂原来颜色区分不大。 鸡肝加碱沸水浴后分层，上层为红棕色，下层无色。 加入蒽酮溶液并且水浴过后的空白管、标准管、样品管（由左至右）对比 将空白管在620nm 处的A 值设定为0，测得标准管、样品管的A 值如下： 1 2 3 平均值 空白管 0 0 0 0 标准管 0.610 0.612 0.616 0.613 样品管 0.085 0.085 0.091 0.087 肝糖原（g/100g肝组织）= 100A 测定100 X 0.05 X X X 1.11 A 标准肝组织重（g ）1000 0.525 从肝糖原的定量试验中可知鸡肝样品中含有糖原，但在定性试验中结果不明显，可推断试验所采纳的鸡肝样品含糖原量比较少，造成鸡肝糖原量少的缘由可能是用于试验的鸡处于饥饿状态，糖原分解以维持血糖稳定，因此使肝中剩余的糖原量少于非饥饿状态下的鸡的肝糖原含量。