2023年原代细胞培养和传代培养的方法及其-细胞培养和传代.docx

2023年原代细胞培养和传代培养的方法及其:细胞培养和传代 初代培育 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培育基中培育，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培育。 仪器、材料及试剂 仪器：培育箱（调整至37），培育瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37） 材料：动物组织块 试剂：1640培育基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hanks液，碘酒 初代消化培育法 1. 打算：取各种已消毒的培育用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。起先工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗23次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中3060分钟。 4. 剪切：用眼科剪把组织切成23毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多3050倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化：或用恒温水浴，或置于37温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分别：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下视察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，马上终止消化，随即通过相宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（5001000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培育液。 7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培育液调整后，分装入培育瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.27.4范围，培育液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。 8. 培育：置于36.5温箱培育，如用CO2温箱培育，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时须要换新塞。 初代组织块培育法 1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培育瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培育瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培育瓶底可摆布2030块。 3. 轻轻翻转培育瓶，另瓶底向上，留意翻瓶时勿另组织小块流淌，塞好瓶塞，置36.5温箱培育2小时左右（勿超过4小时），使小块微干枯。 4. 培育：从微箱中取出培育瓶，开塞，46度斜持培育瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培育液少许，然后缓缓再把培育瓶翻转过来，让培育液渐渐覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培育。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培育液。 传代培育法 原理 细胞在培育瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能接着生长，同时 也将细胞数量扩大，就必需进行传代（再培育）。 传代培育也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培育细胞进行各种试验的必经过程。悬浮型细胞干脆分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 材料和试剂 1. 细胞：贴壁细胞株 2. 试剂：0.25胰酶、1640培育基（含10小牛血清） 3. 仪器和器材：倒置显微镜，培育箱、培育瓶、吸管、废液缸等 操作步骤 1. 吸除培育瓶内旧培育液。 2. 向瓶内加入胰蛋白酶和EDTA混合液少许，以能覆满瓶底为限。 3. 置温箱中25分钟，当发觉细胞质回缩，细胞间隙增大后，马上终止消化。 4. 吸除消化液，向瓶内注入Hanks液数毫升，轻轻转动培育瓶，把残余消化液冲掉。留意加Hanks液冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动的细胞冲掉流失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用Hanks液冲洗，干脆加入培育液。 5. 用吸管吸取养分液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。 6. 计数板计数后，把细胞悬液分成等份分装入数个培育瓶中，置温箱中培育。 无菌操作留意事项 1. 操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。 2. 点燃酒精灯，操作在火焰旁边进行，耐热物品要常常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过养分液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。 3. 操作动作要精确灵敏，但又不能太快，以防空气流淌，增加污染机会。 4. 不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。 5. 瓶子开口后要尽量保持45斜位。 6. 吸溶液的吸管等不能混用。 初代培育 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培育基中培育，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培育。 仪器、材料及试剂 仪器：培育箱（调整至37），培育瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37） 材料：动物组织块 试剂：1640培育基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hanks液，碘酒 初代消化培育法 1. 打算：取各种已消毒的培育用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。起先工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗23次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中3060分钟。 4. 剪切：用眼科剪把组织切成23毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多3050倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化：或用恒温水浴，或置于37温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分别：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下视察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，马上终止消化，随即通过相宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（5001000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培育液。 7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培育液调整后，分装入培育瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.27.4范围，培育液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。 8. 培育：置于36.5温箱培育，如用CO2温箱培育，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时须要换新塞。 初代组织块培育法 1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培育瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培育瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培育瓶底可摆布2030块。 3. 轻轻翻转培育瓶，另瓶底向上，留意翻瓶时勿另组织小块流淌，塞好瓶塞，置36.5温箱培育2小时左右（勿超过4小时），使小块微干枯。 4. 培育：从微箱中取出培育瓶，开塞，46度斜持培育瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培育液少许，然后缓缓再把培育瓶翻转过来，让培育液渐渐覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培育。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培育液。 传代培育法 原理 细胞在培育瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能接着生长，同时 也将细胞数量扩大，就必需进行传代（再培育）。 传代培育也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培育细胞进行各种试验的必经过程。悬浮型细胞干脆分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 材料和试剂 1. 细胞：贴壁细胞株 2. 试剂：0.25胰酶、1640培育基（含10小牛血清） 3. 仪器和器材：倒置显微镜，培育箱、培育瓶、吸管、废液缸等 操作步骤 1. 吸除培育瓶内旧培育液。 2. 向瓶内加入胰蛋白酶和EDTA混合液少许，以能覆满瓶底为限。 3. 置温箱中25分钟，当发觉细胞质回缩，细胞间隙增大后，马上终止消化。 4. 吸除消化液，向瓶内注入Hanks液数毫升，轻轻转动培育瓶，把残余消化液冲掉。留意加Hanks液冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动的细胞冲掉流失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用Hanks液冲洗，干脆加入培育液。 5. 用吸管吸取养分液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。 6. 计数板计数后，把细胞悬液分成等份分装入数个培育瓶中，置温箱中培育。 无菌操作留意事项 1. 操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。 2. 点燃酒精灯，操作在火焰旁边进行，耐热物品要常常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过养分液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。 3. 操作动作要精确灵敏，但又不能太快，以防空气流淌，增加污染机会。 4. 不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。 5. 瓶子开口后要尽量保持45斜位。 6. 吸溶液的吸管等不能混用。 初代培育 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培育基中培育，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培育。 仪器、材料及试剂 仪器：培育箱（调整至37），培育瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37） 材料：动物组织块 试剂：1640培育基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hanks液，碘酒 初代消化培育法 1. 打算：取各种已消毒的培育用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。起先工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗23次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中3060分钟。 4. 剪切：用眼科剪把组织切成23毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多3050倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化：或用恒温水浴，或置于37温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分别：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下视察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，马上终止消化，随即通过相宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（5001000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培育液。 7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培育液调整后，分装入培育瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.27.4范围，培育液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。 8. 培育：置于36.5温箱培育，如用CO2温箱培育，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时须要换新塞。 初代组织块培育法 1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培育瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培育瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培育瓶底可摆布2030块。 3. 轻轻翻转培育瓶，另瓶底向上，留意翻瓶时勿另组织小块流淌，塞好瓶塞，置36.5温箱培育2小时左右（勿超过4小时），使小块微干枯。 4. 培育：从微箱中取出培育瓶，开塞，46度斜持培育瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培育液少许，然后缓缓再把培育瓶翻转过来，让培育液渐渐覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培育。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培育液。 传代培育法 原理 细胞在培育瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能接着生长，同时 也将细胞数量扩大，就必需进行传代（再培育）。 传代培育也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培育细胞进行各种试验的必经过程。悬浮型细胞干脆分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 材料和试剂 1. 细胞：贴壁细胞株 2. 试剂：0.25胰酶、1640培育基（含10小牛血清） 3. 仪器和器材：倒置显微镜，培育箱、培育瓶、吸管、废液缸等 操作步骤 1. 吸除培育瓶内旧培育液。 2. 向瓶内加入胰蛋白酶和EDTA混合液少许，以能覆满瓶底为限。 3. 置温箱中25分钟，当发觉细胞质回缩，细胞间隙增大后，马上终止消化。 4. 吸除消化液，向瓶内注入Hanks液数毫升，轻轻转动培育瓶，把残余消化液冲掉。留意加Hanks液冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动的细胞冲掉流失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用Hanks液冲洗，干脆加入培育液。 5. 用吸管吸取养分液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。 6. 计数板计数后，把细胞悬液分成等份分装入数个培育瓶中，置温箱中培育。 无菌操作留意事项 1. 操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。 2. 点燃酒精灯，操作在火焰旁边进行，耐热物品要常常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过养分液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。 3. 操作动作要精确灵敏，但又不能太快，以防空气流淌，增加污染机会。 4. 不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。 5. 瓶子开口后要尽量保持45斜位。 6. 吸溶液的吸管等不能混用。 初代培育 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培育基中培育，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培育。 仪器、材料及试剂 仪器：培育箱（调整至37），培育瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37） 材料：动物组织块 试剂：1640培育基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hanks液，碘酒 初代消化培育法 1. 打算：取各种已消毒的培育用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。起先工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗23次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中3060分钟。 4. 剪切：用眼科剪把组织切成23毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多3050倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化：或用恒温水浴，或置于37温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分别：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下视察，如组织已分散成细胞 团或单个细胞，马上终止消化，随即通过相宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（5001000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培育液。 7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培育液调整后，分装入培育瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.27.4范围，培育液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。 8. 培育：置于36.5温箱培育，如用CO2温箱培育，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时须要换新塞。 初代组织块培育法 1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培育瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培育瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培育瓶底可摆布2030块。 3. 轻轻翻转培育瓶，另瓶底向上，留意翻瓶时勿另组织小块流淌，塞好瓶塞，置36.5温箱培育2小时左右（勿超过4小时），使小块微干枯。 4. 培育：从微箱中取出培育瓶，开塞，46度斜持培育瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培育液少许，然后缓缓再把培育瓶翻转过来，让培育液渐渐覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培育。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培育液。 传代培育法 原理 细胞在培育瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能接着生长，同时 也将细胞数量扩大，就必需进行传代（再培育）。 传代培育也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培育细胞进行各种试验的必经过程。悬浮型细胞干脆分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 材料和试剂 1. 细胞：贴壁细胞株 2. 试剂：0.25胰酶、1640培育基（含10小牛血清） 3. 仪器和器材：倒置显微镜，培育箱、培育瓶、吸管、废液缸等 操作步骤 1. 吸除培育瓶内旧培育液。 2. 向瓶内加入胰蛋白酶和EDTA混合液少许，以能覆满瓶底为限。 3. 置温箱中25分钟，当发觉细胞质回缩，细胞间隙增大后，马上终止消化。 4. 吸除消化液，向瓶内注入Hanks液数毫升，轻轻转动培育瓶，把残余消化液冲掉。留意加Hanks液冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动的细胞冲掉流失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用Hanks液冲洗，干脆加入培育液。 5. 用吸管吸取养分液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。 6. 计数板计数后，把细胞悬液分成等份分装入数个培育瓶中，置温箱中培育。 无菌操作留意事项 1. 操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。 2. 点燃酒精灯，操作在火焰旁边进行，耐热物品要常常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过养分液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。 3. 操作动作要精确灵敏，但又不能太快，以防空气流淌，增加污染机会。 4. 不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。 5. 瓶子开口后要尽量保持45斜位。 6. 吸溶液的吸管等不能混用。