细胞破碎分离.ppt

3 3 细细 胞胞 破破 碎碎（cell rupturecell rupture）常见的细胞壁结构细胞破碎技术本章的主要内容本章的主要内容细胞破碎（细胞破碎（cell rupturecell rupture）技术是）技术是指利指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内使细胞内物质包括目的产物成分释放出来的技术。物质包括目的产物成分释放出来的技术。3.1 3.1 细胞壁结构对破碎的影响细胞壁结构对破碎的影响Z微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。细胞膜。Z通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。细胞壁。Z不不同同细细胞胞壁壁的的结结构构和和组组成成不不完完全全相相同同，故故细细胞胞壁壁的的机机械械强强度度不不同同，细细胞胞破破碎碎的的难难易易程程度度也也就就不同不同。1.1.细菌细胞壁结构细菌细胞壁结构组成成分：组成成分：Z肽肽聚聚糖糖（peptidoglycanpeptidoglycan）:主主要要成成分分组组，它它是是难难溶溶性性的的聚聚糖糖链链；相相邻邻聚聚糖糖链链上上的的短短肽肽又又交交叉叉相相联联，构构成成了了细细胞胞壁的三维网状结构，包围在细胞周围；壁的三维网状结构，包围在细胞周围；Z氨基酸：氨基酸：D,L-D,L-丙氨酸；丙氨酸；D-D-谷氨酸；谷氨酸；L-L-赖氨酸赖氨酸Z磷磷壁壁酸酸：醛醛糖糖磷磷酸酸酯酯的的聚聚合合物物；仅仅在在革革兰兰氏氏阳阳性性菌菌中中存存在；在；Z糖：葡萄糖，半乳糖，甘露糖等糖：葡萄糖，半乳糖，甘露糖等Z脂质：不多，仅在于革兰氏阴性菌中脂质：不多，仅在于革兰氏阴性菌中Z破碎细菌的主要阻力：是来自于肽聚糖的网状结构。破碎细菌的主要阻力：是来自于肽聚糖的网状结构。2.酵母细胞壁的结构酵母细胞壁的结构u葡葡聚聚糖糖：它它构构成成了了细细胞胞壁壁的的骨骨架架，使使细细胞胞具具有有一一定定的的形形状；最里层。状；最里层。u糖蛋白糖蛋白:在葡聚糖上面在葡聚糖上面u甘甘露露聚聚糖糖：最最外外层层。由由1,6-1,6-磷磷酸酸二二酯酯键键连连接接成成网网状状。在在内部有甘露聚糖内部有甘露聚糖-酶的复合物。酶的复合物。u破破碎碎酵酵母母细细胞胞壁壁的的阻阻力力：主主要要决决定定于于壁壁结结构构交交联联的的紧紧密密程度和它的厚度。程度和它的厚度。3.3.真菌的细胞壁真菌的细胞壁l真菌的细胞壁较厚，主要由真菌的细胞壁较厚，主要由多糖，蛋白质多糖，蛋白质和脂类和脂类组成。组成。l大多数真菌的多糖壁是由大多数真菌的多糖壁是由几丁质和葡聚糖几丁质和葡聚糖构成构成，少数含，少数含纤维素纤维素。l红面包霉菌细胞壁结构：红面包霉菌细胞壁结构：l最最外外层层(a)(a)是是-和和-葡葡聚聚糖糖的的混合物，混合物，l第第2 2层层(b)(b)是糖蛋白的网状结构是糖蛋白的网状结构l第第3 3层层(c)(c)主要是蛋白质，主要是蛋白质，l最内层最内层(d)(d)主要是几丁质。主要是几丁质。真菌细胞壁的结构示意图真菌细胞壁的结构示意图l真真菌菌细细胞胞壁壁的的强强度度：主主要要决决定定于于聚聚合合物物的的网网状状结结构构，不不仅仅如如此此，它它还还含含有有几几丁丁质质或或纤纤维维素素的的纤纤维维状结构，所以强度更高状结构，所以强度更高。微生微生物物革兰氏革兰氏阳性细菌阳性细菌革兰氏革兰氏阴性细菌阴性细菌酵母菌酵母菌霉菌霉菌壁厚壁厚20-80 nm20-80 nm10-13 nm10-13 nm100-300nm100-300nm100-250nm100-250nm层次层次单层单层多层多层多层多层多层多层主要主要组成组成肽聚糖肽聚糖(40-90%)(40-90%)多糖多糖胞壁酸胞壁酸蛋白质蛋白质脂多糖脂多糖(1-4%)(1-4%)肽聚糖肽聚糖 (5-10%)(5-10%)脂蛋白脂蛋白脂多糖脂多糖(11-22%)(11-22%)磷脂磷脂蛋白质蛋白质葡聚糖葡聚糖(30-(30-40%)40%)甘露聚糖甘露聚糖(30%)(30%)蛋白质蛋白质(6-8%)(6-8%)脂类脂类(8.5-(8.5-13.5%)13.5%)多聚糖多聚糖(80-90%)(80-90%)脂类脂类蛋白质蛋白质微生微生物物革兰氏革兰氏阳性细菌阳性细菌革兰氏革兰氏阴性细菌阴性细菌酵母菌酵母菌真菌真菌壁厚壁厚20-80 nm20-80 nm10-13 nm10-13 nm100-300nm100-300nm100-250nm100-250nm层次层次单层单层多层多层多层多层多层多层主要主要组成组成肽聚糖肽聚糖(40-90%)(40-90%)多糖多糖胞壁酸胞壁酸蛋白质蛋白质脂多糖脂多糖(1-4%)(1-4%)肽聚糖肽聚糖 (5-10%)(5-10%)脂蛋白脂蛋白脂多糖脂多糖(11-22%)(11-22%)磷脂磷脂蛋白质蛋白质葡聚糖葡聚糖(30-(30-40%)40%)甘露聚糖甘露聚糖(30%)(30%)蛋白质蛋白质(6-8%)(6-8%)脂类脂类(8.5-(8.5-13.5%)13.5%)多聚糖多聚糖(80-90%)(80-90%)脂类脂类蛋白质蛋白质4.4.微生物不同细胞壁的组成和结构微生物不同细胞壁的组成和结构5.5.植物植物细细胞壁的胞壁的结结构构l对对于于已已生生长长结结束束的的植植物物细细胞胞壁壁可可分分为为初初生生壁壁和和次次生生壁两部分。壁两部分。l初生壁初生壁是细胞生长期形成的。初生壁一般较薄（是细胞生长期形成的。初生壁一般较薄（1 13m3m），富有弹性。），富有弹性。l初生壁的组成：初生壁的组成：主要是多糖和蛋白质；多糖主要成主要是多糖和蛋白质；多糖主要成分为纤维素、半纤维素和果胶类物质。许多纤维素分为纤维素、半纤维素和果胶类物质。许多纤维素形成微纤丝。形成微纤丝。l细胞壁的机械强度细胞壁的机械强度：主要来自于微纤丝。：主要来自于微纤丝。植物次生植物次生细细胞壁胞壁次次生生细细胞胞壁壁：植植物物细细胞胞生生长长停停止止后后，在在细细胞胞质质和和初初生细胞壁之间形成次生细胞壁。生细胞壁之间形成次生细胞壁。次生壁一般较厚次生壁一般较厚(4(4mm以上以上)，常有三层组成。，常有三层组成。在在次次生生壁壁中中，纤纤维维素素和和半半纤纤维维素素含含量量比比初初生生壁壁多多，纤纤维维素素的的微微纤纤丝丝排排列列得得更更紧紧密密和和有有规规则则，而而且且存在木质素的沉积。存在木质素的沉积。因因此此次次生生壁壁的的形形成成提提高高了了细细胞胞壁壁的的坚坚硬硬性性，使使植植物物细胞具有很高的机械强度。细胞具有很高的机械强度。木质素的网状结构显微镜图木质素的网状结构显微镜图纤维素纤维素半纤维素半纤维素分分 类类作作 用用 机机 理理适适 应应 性性机机械械法法研磨法研磨法固体剪切作用固体剪切作用可达较高破碎率，可较大规模操作；可达较高破碎率，可较大规模操作；大分大分子目的产物易失活，浆液分离困难子目的产物易失活，浆液分离困难高压匀浆法高压匀浆法液体剪切作用液体剪切作用可达较高破碎率，可大规模操作，可达较高破碎率，可大规模操作，不适合不适合丝状菌和革兰氏阳性菌丝状菌和革兰氏阳性菌超声破碎法超声破碎法液体剪切作用液体剪切作用对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，不适合大规模操作不适合大规模操作非非机机械械法法生物法生物法酶分解作用酶分解作用具有高度专一性，条件温和，浆液易分离；具有高度专一性，条件温和，浆液易分离；溶酶价格高，通用性差溶酶价格高，通用性差化学渗透法化学渗透法改变细胞膜的渗透性改变细胞膜的渗透性具一定选择性，浆液易分离；具一定选择性，浆液易分离；但释放率较但释放率较低，通用性差低，通用性差渗透压法渗透压法渗透压剧烈改变渗透压剧烈改变破碎率较低，常与其他方法结合使用破碎率较低，常与其他方法结合使用冻结融化法冻结融化法反复冻结反复冻结-融化融化破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产物破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产物干燥法干燥法改变细胞膜渗透性改变细胞膜渗透性条件变化剧烈，易引起大分子物质失活条件变化剧烈，易引起大分子物质失活3.2 3.2 常用的细胞破碎技术常用的细胞破碎技术机械破碎机械破碎捣碎法研磨法匀浆法超声法 物理破碎物理破碎温度差破碎法压力差破碎法化学破碎化学破碎有机溶剂：表面活性剂：酸碱生物法破碎生物法破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切通过机械运动产生的剪切力，使细胞破碎。力，使细胞破碎。通过各种物理因素的作用，通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎而达到细胞破碎细胞破碎方法及其原理细胞破碎方法及其原理1.1.机械法机械法机械破碎法又可分为机械破碎法又可分为高压匀浆破碎法（高压匀浆破碎法（homogenizationhomogenization）高速研磨破碎法（高速研磨破碎法（bead grindingbead grinding）超声波破碎法（超声波破碎法（ultrasonicationultrasonication）作用机理：高压液体剪切力作用机理：高压液体剪切力1 1）高压匀浆法）高压匀浆法（High-pressure homogenizationHigh-pressure homogenization）细胞悬浮液从细胞悬浮液从高压室针高压室针形阀形阀喷出，高速喷出的喷出，高速喷出的浆液又浆液又射到静止的撞击射到静止的撞击环上环上，被迫改变方向从，被迫改变方向从出口管流出。出口管流出。细胞在这一系列高速运细胞在这一系列高速运动过程中经历了高速剪动过程中经历了高速剪切、碰撞及压力骤降，切、碰撞及压力骤降，造成细胞破碎。造成细胞破碎。高压匀浆机高压匀浆机高压匀浆法适用的范围高压匀浆法适用的范围适用于大规模细胞破碎适用于大规模细胞破碎高压匀浆法适用的范围：高压匀浆法适用的范围：酵母和大多数细菌细胞的破碎；酵母和大多数细菌细胞的破碎；料液细胞浓度可以很高，料液细胞浓度可以很高，20%20%左右。左右。不宜使用高压匀浆法。不宜使用高压匀浆法。易造成堵塞的团状或丝状真菌，易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性菌较小的革兰氏阳性菌l操作压力：升高压力有利于破碎，操作压力：升高压力有利于破碎，减少细胞的循减少细胞的循环次数，甚至一次通过匀浆阀就可达到几乎完全的环次数，甚至一次通过匀浆阀就可达到几乎完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不至过小。破碎，这样就可避免细胞碎片不至过小。l细菌种类：破碎性能还随菌体种类和生长环境的细菌种类：破碎性能还随菌体种类和生长环境的不同而不同不同而不同大肠杆菌的细胞比酵母细胞容易破碎，大肠杆菌的细胞比酵母细胞容易破碎，生长在简单的合成培养基上的大肠杆菌比生长在生长在简单的合成培养基上的大肠杆菌比生长在复杂培养基上容易破碎。复杂培养基上容易破碎。影响高压匀浆器细胞破碎因素影响高压匀浆器细胞破碎因素影响高压匀浆器细胞破碎因素影响高压匀浆器细胞破碎因素被破碎的细胞分率符合如下公式：被破碎的细胞分率符合如下公式：ln1/(1-R)=K N Pln1/(1-R)=K N P 式中式中 R R 破碎率破碎率 N-N-循环次数循环次数K K 与温度有关的常数与温度有关的常数P P 操作压力操作压力 与微生物种类有关的常数与微生物种类有关的常数2 2）研磨法）研磨法 bead millbead millu作用机理：固体剪切力作用机理：固体剪切力u细胞悬浮液与细小的玻璃小细胞悬浮液与细小的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于剂（直径小于1mm1mm）一起快速）一起快速搅拌或研磨。搅拌或研磨。研磨剂、珠子与细胞之间的互研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。释放出内含物。u在工业规模的破碎中，常采在工业规模的破碎中，常采用高速研磨机用高速研磨机WSKWSK卧式高效全能研磨机卧式高效全能研磨机研磨机破碎作用方程研磨机破碎作用方程u破碎作用符合下列公式：破碎作用符合下列公式：ln1/(1-R)=K t ln1/(1-R)=K t R R 破碎率；破碎率；K K一一 速度常数；速度常数；t t一一 时间。时间。uK K与搅拌转速、细胞悬浮液浓度，循环速度，与搅拌转速、细胞悬浮液浓度，循环速度，研磨剂量，颗粒大小，以及温度等相关。研磨剂量，颗粒大小，以及温度等相关。3 3）超声波破碎）超声波破碎l作用机理：液体剪切力作用机理：液体剪切力l超声波破碎法超声波破碎法（Ultrasonication)Ultrasonication)利用超声利用超声波振荡器发射的波振荡器发射的15-25kHz15-25kHz（千（千赫）的超声波探头处理细胞悬赫）的超声波探头处理细胞悬浮液。浮液。l超声波的细胞破碎效率与细胞超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的频率有种类、浓度和超声波的频率有关。关。超声波破碎的机理超声波破碎的机理(一般认为在超声波作用下液体发生空化作用一般认为在超声波作用下液体发生空化作用（cavitation),cavitation),(液体中局部空穴的形成、增大和闭合产生极大液体中局部空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，引起的粘滞性旋涡在细胞的冲击波和剪切力，引起的粘滞性旋涡在细胞上造成了剪切力，使细胞内液体发生流动，从上造成了剪切力，使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。而使细胞破碎。(操作过程产生大量的热，因此操作需在冰水或操作过程产生大量的热，因此操作需在冰水或外部冷却的容器中进行。外部冷却的容器中进行。超声波破碎的适用范围超声波破碎的适用范围超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于高浓超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于高浓度微生物的破碎。度微生物的破碎。一般杆菌比球菌易破碎，一般杆菌比球菌易破碎，G-G-细菌比细菌比G+G+细菌易破细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。碎，对酵母菌的效果较差。缺点：缺点：超声波产生的化学自由基能使某些敏感性活性超声波产生的化学自由基能使某些敏感性活性物质失活。物质失活。对冷却的要求非常高，所以不易放大，但在实对冷却的要求非常高，所以不易放大，但在实验室小规模细胞破碎中常用。验室小规模细胞破碎中常用。技术技术原理原理效果效果 成本成本举例举例匀浆法匀浆法(孔型孔型)使细胞受到液体剪使细胞受到液体剪切力而破碎切力而破碎剧烈剧烈 适中适中细胞悬浮液大规模细胞悬浮液大规模处理处理研磨破碎研磨破碎法法细胞被玻璃珠或铁细胞被玻璃珠或铁珠捣碎珠捣碎剧烈剧烈 便宜便宜细胞悬浮液和植物细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理细胞的大规模处理超声波法超声波法 使细胞受到液体剪使细胞受到液体剪切力而破碎切力而破碎适中适中 昂贵昂贵细胞悬浮液小规模细胞悬浮液小规模处理处理不同机械破碎方法的比较不同机械破碎方法的比较2.2.非机械法非机械法非机械方法很多非机械方法很多1)1)生物法生物法-酶溶解酶溶解（enzyme lysisenzyme lysis）2)2)化学法溶胞化学法溶胞（chemical treatmentchemical treatment）3)3)物理法物理法渗透压冲击渗透压冲击（osmotic shockosmotic shock）冻结和融化冻结和融化（freezing and thawingfreezing and thawing）干燥法干燥法其中酶溶解法和化学溶胞应用最广其中酶溶解法和化学溶胞应用最广 1)1)生物法（酶溶法生物法（酶溶法 Enymatic lysis)Enymatic lysis)生物法是利用溶解细胞壁的酶处理细胞，使细胞生物法是利用溶解细胞壁的酶处理细胞，使细胞壁受到破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏壁受到破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜。细胞膜。A.A.外加酶法外加酶法常用的溶酶常用的溶酶溶菌酶、溶菌酶、-1-1，3-3-葡聚糖酶、葡聚糖酶、-1-1，6-6-葡聚糖酶、葡聚糖酶、蛋白酶、蛋白酶、甘露糖酶、甘露糖酶、糖苷酶、糖苷酶、肽键内切酶、肽键内切酶、壳多糖酶壳多糖酶特点是专一性强，因此在选择酶系统时，必须根据细胞特点是专一性强，因此在选择酶系统时，必须根据细胞的结构和化学组成来选择。的结构和化学组成来选择。l溶菌酶（溶菌酶（lysozyme)lysozyme)能专一性地分解细胞壁上能专一性地分解细胞壁上肽聚糖肽聚糖分分子的子的-1,4-1,4糖苷键，因此主要用于细菌类细胞壁的裂糖苷键，因此主要用于细菌类细胞壁的裂解。解。l革兰氏阳性菌悬浮液中加入革兰氏阳性菌悬浮液中加入溶菌酶溶菌酶，很快就产生溶壁，很快就产生溶壁现象。现象。l放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为主要成分，所以也能采用溶菌酶，为主要成分，所以也能采用溶菌酶，l酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、几丁质等，常用几丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。等。l植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维纤维素酶和素酶和半纤维素酶半纤维素酶裂解。裂解。有时采用几种酶的混合物会产生更好的效果，加入有时采用几种酶的混合物会产生更好的效果，加入时需确定相应的次序。时需确定相应的次序。对酵母细胞采用酶法破碎时对酵母细胞采用酶法破碎时（1 1）先加入）先加入蛋白酶蛋白酶溶解蛋白质溶解蛋白质-甘露聚糖结构，甘露聚糖结构，（2 2）再加入）再加入葡聚糖酶溶解葡聚糖酶溶解葡聚糖层，葡聚糖层，（3 3）最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透）最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释出胞内产物。压变化，则细胞膜破裂，释出胞内产物。B.B.自溶作用自溶作用 l 自溶作用是酶溶解的另一种方法，自溶作用是酶溶解的另一种方法，利用生物体自身利用生物体自身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶。l在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水解在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去。细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去。l改变其生长环境（温度、缓冲液），可以诱改变其生长环境（温度、缓冲液），可以诱发产生过剩的酶或激发产生其它的自溶酶，以达到发产生过剩的酶或激发产生其它的自溶酶，以达到自溶目的。自溶目的。l缺点是缺点是：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。浮液粘度增大，过滤速度下降。某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素等，可以改变细胞壁或膜的渗透性剂、抗生素等，可以改变细胞壁或膜的渗透性，从而使胞内物质有选择地渗透出来。性，从而使胞内物质有选择地渗透出来。2)2)化学渗透法（化学渗透法（Chemical permeationChemical permeation）n酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸，通酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸，通常采用常采用6mol/L HCl6mol/L HCl。n碱能溶解细胞壁上脂类物质，使某些组碱能溶解细胞壁上脂类物质，使某些组分从细胞内渗漏出来。分从细胞内渗漏出来。优点：成本低，反应激烈、速度快优点：成本低，反应激烈、速度快缺点：不具选择性。缺点：不具选择性。A.A.酸、碱处理法酸、碱处理法细胞破碎常用的表面活性剂：细胞破碎常用的表面活性剂：十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDSSDS，阴离子型）；，阴离子型）；非离子型如非离子型如Triton X-100Triton X-100和吐温（和吐温（TweenTween）等）等B.B.表面活性剂表面活性剂表面活性剂是都是两性的，既能和水作用也能和脂表面活性剂是都是两性的，既能和水作用也能和脂作用；作用；对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏磷脂层，使某些胞内物质释放出来。磷脂，破坏磷脂层，使某些胞内物质释放出来。能与细胞壁上的脂蛋白结合，形成微泡，使膜的能与细胞壁上的脂蛋白结合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶解。通透性增加或溶解。能分解细胞壁中的磷脂，使细胞结构破坏，胞内物能分解细胞壁中的磷脂，使细胞结构破坏，胞内物质被释放出来。质被释放出来。有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等 C.C.有机溶剂有机溶剂u通用性差；通用性差；u时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%50%；u有些化学试剂有毒。有些化学试剂有毒。u化学试剂的加入常会给随后产物的纯化带来困难，化学试剂的加入常会给随后产物的纯化带来困难，并影响最终产物纯度并影响最终产物纯度化学渗透法特点：化学渗透法特点：缺点缺点l对产物释放有一定的选择性对产物释放有一定的选择性可使一些较小分子量的物质（多肽和小分子的酶蛋可使一些较小分子量的物质（多肽和小分子的酶蛋白）透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；白）透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；l细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。分离和进一步提取。优点优点3)3)物理法物理法u渗透压冲击法渗透压冲击法u冻结冻结-融化法融化法u干燥法干燥法A.A.渗透压冲击法渗透压冲击法 渗透压冲击是较温和的一种破碎方法渗透压冲击是较温和的一种破碎方法将细胞放在高渗透压的溶液中（如一定浓度的将细胞放在高渗透压的溶液中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），使细胞脱水收缩；再放入甘油或蔗糖溶液），使细胞脱水收缩；再放入水或缓冲液中，使细胞快速膨胀破裂。水或缓冲液中，使细胞快速膨胀破裂。仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。B.B.冻结冻结-融化法融化法 将细胞放在低温下冷冻（约将细胞放在低温下冷冻（约-15-15），然后在），然后在室温中融化，反复多次而达到破壁作用。室温中融化，反复多次而达到破壁作用。作用机理：一方面能使细胞膜的疏水键结构破作用机理：一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能，另一方面胞内裂，从而增加细胞的亲水性能，另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂。水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂。适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。蛋白质变性。使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。提出来。气流干燥主要适用于酵母菌，一般在气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25-3025-30的气流中吹干；的气流中吹干；真空干燥多用于细菌。真空干燥多用于细菌。冷冻干燥适用于不稳定的生化物质冷冻干燥适用于不稳定的生化物质C.C.干燥法干燥法气流干燥气流干燥真空干燥真空干燥喷雾干燥喷雾干燥冷冻干燥冷冻干燥选择破碎方法的依据：选择破碎方法的依据：u细胞处理量；细胞处理量；u细胞壁强度和结构细胞壁强度和结构(高聚物交联程度、种高聚物交联程度、种类和壁厚度类和壁厚度)；u目标产物对破碎条件的敏感性；目标产物对破碎条件的敏感性；u破碎程度；破碎程度；u目标产物的选择性释放目标产物的选择性释放破碎率的测定破碎率的测定细细胞胞破破碎碎后后，大大量量带带电电荷荷的的内内含含物物被被释释放放到到水水相相，使导电率上升。使导电率上升。1)1)直接测定法直接测定法2)2)目的产物测定法目的产物测定法3)3)导电率测定法导电率测定法采用染色法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。采用染色法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。如：采用革兰氏染色法染色酵母破碎液，完整的细胞如：采用革兰氏染色法染色酵母破碎液，完整的细胞呈紫色，而受损害的细胞呈亮红色。呈紫色，而受损害的细胞呈亮红色。将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中目的产物含量将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中目的产物含量或活性，并与或活性，并与100%100%破碎率的标准值比较，计算其破碎率。破碎率的标准值比较，计算其破碎率。用巴氏染色液（中性红）染色用巴氏染色液（中性红）染色破碎技术的研究方向破碎技术的研究方向多种破碎方法相结合多种破碎方法相结合化学法、酶法、机械法相结合。化学法、酶法、机械法相结合。酶法与高压匀浆、超声波震荡、渗透压法结合酶法与高压匀浆、超声波震荡、渗透压法结合如用溶解酶预处理面包酵母，然后高压匀浆，如用溶解酶预处理面包酵母，然后高压匀浆，95MPa95MPa压压力下匀浆力下匀浆4 4次，总破碎率接近次，总破碎率接近100%100%。而单独采用高压匀。而单独采用高压匀浆法，同样条件下破碎率只有浆法，同样条件下破碎率只有32%32%。与上游过程相结合与上游过程相结合v在发酵培养过程中，培养基、生长期、操作参数（如在发酵培养过程中，培养基、生长期、操作参数（如pHpH、温度、通气量、搅拌转速、稀释率等）等因素都对细胞壁温度、通气量、搅拌转速、稀释率等）等因素都对细胞壁膜的结构与组成有一定的影响。膜的结构与组成有一定的影响。v在生长后期，加入某些能抑制或阻止细胞壁物质合成的抑在生长后期，加入某些能抑制或阻止细胞壁物质合成的抑制剂制剂(如青霉素如青霉素)，继续培养一段时间后，新分裂的细胞其，继续培养一段时间后，新分裂的细胞其细胞壁有缺陷，利于破碎；细胞壁有缺陷，利于破碎；v用基因工程的方法对菌种进行改造，如在细胞内引进噬菌用基因工程的方法对菌种进行改造，如在细胞内引进噬菌体基因，培养结束后，控制一定条件（如温度等），激活体基因，培养结束后，控制一定条件（如温度等），激活噬菌体基因，使细胞自内向外溶解，释放出内含物。噬菌体基因，使细胞自内向外溶解，释放出内含物。讨论题：青霉素酰化酶细胞破碎的研究讨论题：青霉素酰化酶细胞破碎的研究 一一.化学法化学法 20%(W/V)20%(W/V)大肠杆菌悬浮液大肠杆菌悬浮液 +丁酯丁酯 3737搅拌搅拌 高速离心高速离心 测上清液酶活。测上清液酶活。1.1.处理时间处理时间 R%3h3h2.2.丁酯用量丁酯用量条件：条件：37 37，搅拌，搅拌3 3小时小时适宜的适宜的B.AB.A加量为加量为12%12%，释放率释放率R=55%R=55%12%55%R12%2.03U/mg比活二二.化学法化学法冻融法结合冻融法结合 加加B.A(12%,37B.A(12%,37搅拌搅拌3h3h）菌悬液菌悬液 冻融冻融(冻结冻结14h 14h 融化融化)释放率释放率70%70%；比活；比活2.69 u/mg2.69 u/mg 三三.化学化学超声波振荡法结合超声波振荡法结合 先丁酯处理，再超声波（先丁酯处理，再超声波（9090秒），秒），释放率释放率72%72%小型设备，不能工业大规模生产。小型设备，不能工业大规模生产。四四.高压匀浆法高压匀浆法 20%(W/V)20%(W/V)菌悬液，菌悬液，P=P=50MPa50MPa。释放率释放率R=38.4%R=38.4%，原因原因:细胞破碎后细胞破碎后,仍有较多酶吸附在细胞碎片上。仍有较多酶吸附在细胞碎片上。五五.高压匀浆高压匀浆化学法结合化学法结合 先高压匀浆，再加先高压匀浆，再加10%10%丁酯，丁酯，3737搅拌搅拌3h3h，高速离心，高速离心(3(3万万rpm)rpm)，释放率释放率：R=60%R=60%六六.研磨研磨 直径直径0.4mm0.4mm玻璃珠。玻璃珠。释放率释放率：R=95%R=95%