药物分析课件第十一章抗生素类药物的分析.ppt

第十一章第十一章抗生素类药物抗生素类药物的分析的分析第一节第一节 概述概述抗生素的定义抗生素的定义抗生素的来源抗生素的来源1.1.生物合成（发酵）生物合成（发酵）2.2.化学合成或半合成化学合成或半合成 是指是指“在低浓度情况下对某些生物的生命活在低浓度情况下对某些生物的生命活动有特异性抑制作用一类化学物质的总称动有特异性抑制作用一类化学物质的总称”抗生素质量的复杂性抗生素质量的复杂性 化学纯度低化学纯度低同系物多同系物多异构体多异构体多降解物多降解物多发酵过程不易控制发酵过程不易控制易受污染易受污染工艺复杂，活性组工艺复杂，活性组分易发生变异分易发生变异产品稳定性差产品稳定性差分子结构大多不稳定，降解后疗效分子结构大多不稳定，降解后疗效下降、失效或增加毒副作用下降、失效或增加毒副作用抗生素类药物的质量分析抗生素类药物的质量分析（一）鉴别试验（一）鉴别试验1 1、显色反应、显色反应特殊基团的反应特殊基团的反应2 2、光谱法、光谱法特征吸收特征吸收3 3、色谱法、色谱法保留行为保留行为4 4、生物学方法、生物学方法抗菌能力抗菌能力(二二)检查检查1 1、常规检查、常规检查水份、酸碱度等水份、酸碱度等2 2、有机和无机杂质检查、有机和无机杂质检查3 3、异常物质的检查、异常物质的检查异常毒性、热原等异常毒性、热原等4 4、其他检查、其他检查其他共存组分其他共存组分含量测定或效价测定含量测定或效价测定1、微生物检定法、微生物检定法稀释法稀释法比浊法比浊法管碟琼脂扩散法管碟琼脂扩散法抑菌圈抑菌圈灵敏度高、需用量少灵敏度高、需用量少适用范围广适用范围广纯品、不纯品、已知的和新的纯品、不纯品、已知的和新的可一次测定同类型抗生素的总效价可一次测定同类型抗生素的总效价无需分离纯化无需分离纯化与临床的应用要求一致与临床的应用要求一致操作繁琐、费时费力操作繁琐、费时费力误差较大误差较大效价效价:是指每是指每mlml或每或每mgmg中含有某种抗生中含有某种抗生素有效成分的多少素有效成分的多少是以抗生素对微生物的杀伤或是以抗生素对微生物的杀伤或抑制程度为指标来判断效价的抑制程度为指标来判断效价的一种方法一种方法是结构复杂和多组分抗生素效价测是结构复杂和多组分抗生素效价测定的首先方法定的首先方法2、物理化学法、物理化学法 HPLCLC-MSUV容量法容量法准确可靠、专属性高、操作简单、省时、样品准确可靠、专属性高、操作简单、省时、样品用量少用量少1、对结构已知或提纯的抗生素、对结构已知或提纯的抗生素2、需要标准品对照、需要标准品对照仪仪器器分分析析方方法法分类分类（按结构与性质）：（按结构与性质）：内酰胺类、氨基糖苷类、内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类、四环素类、大环内酯类、氯霉素类、多肽类、抗肿瘤类氯霉素类、多肽类、抗肿瘤类 林可霉素类、其他抗生素类林可霉素类、其他抗生素类第二节第二节 内酰胺类抗生素内酰胺类抗生素 青霉素类青霉素类一、结构与性质一、结构与性质AB头孢菌素类头孢菌素类AB青霉素青霉素（青霉素（青霉素G、苄青霉素）、苄青霉素）氨苄西林氨苄西林（氨苄青霉素）（氨苄青霉素）阿莫西林阿莫西林（羟氨苄青霉素）（羟氨苄青霉素）普鲁卡因青霉素普鲁卡因青霉素头孢氨苄头孢氨苄头孢拉定头孢拉定头孢噻吩钠头孢噻吩钠头孢羟氨苄头孢羟氨苄酸性酸性性质性质NaNa与碱金属与碱金属(Na+、K+)成盐成盐 （一）羧基（一）羧基 易溶于水易溶于水 与有机碱与有机碱(普鲁卡因普鲁卡因)成盐成盐 难溶于水难溶于水普鲁卡因普鲁卡因青霉素青霉素（二）手性（二）手性C (5%头孢唑啉钠溶液头孢唑啉钠溶液 1824)头孢菌素类头孢菌素类 C6 C7青霉素类青霉素类 C3 C5 C6 旋光性旋光性 （三）（三）头孢菌素类头孢菌素类 母核有母核有O=C-N-C=CO=C-N-C=C 青霉素类青霉素类 母核无明显母核无明显UV 多数有苯环取代基多数有苯环取代基 UV青霉素钠青霉素钠头孢氨苄头孢氨苄（四）（四）内酰胺环内酰胺环 的不稳定性的不稳定性 水溶液水溶液 不稳定不稳定 干燥纯净干燥纯净 稳定稳定 不稳定不稳定性因素性因素四元环张力大四元环张力大 酰胺键易水解酰胺键易水解 （某些金属离子）（某些金属离子）（温度）（温度）某些氧化剂某些氧化剂青霉素的降解途径青霉素的降解途径与与含含水水量量和和纯纯度度密密切切相相关关青霉素的降解产物青霉素的降解产物青霉素酶青霉素酶青霉噻唑酸青霉噻唑酸强酸性环境强酸性环境青霉酸青霉酸弱酸性环境弱酸性环境青霉烯酸青霉烯酸 强酸性强酸性-加热加热青霉醛青霉醛 强酸性强酸性-加热加热/青霉素酶青霉素酶-重金属重金属青霉胺青霉胺二、二、K+、Na+反应反应（一）（一）鉴别鉴别 焰色焰色鲜黄色鲜黄色 +醋酸氧铀锌醋酸氧铀锌黄黄 Na+焰色焰色紫色紫色 +0.1%四苯硼钠四苯硼钠+HAc白白 K+（二）呈色反应（二）呈色反应1.羟肟酸铁反应羟肟酸铁反应-内酰胺类内酰胺类NaOH呈色呈色Fe3+/3H+2、与与H2SO4-HNO3反应反应头孢菌素类头孢菌素类3.茚三酮茚三酮反应反应-氨基氨基4.双缩脲反应双缩脲反应-内酰胺类内酰胺类（开环分解）（开环分解）似肽键似肽键5.与变色酸与变色酸-硫酸反应硫酸反应活泼活泼“-CH2-”青霉素青霉素阿莫西林阿莫西林氨苄西林氨苄西林（分解）（分解）变色酸变色酸显色显色150（缩合）（缩合）6.与重氮苯磺酸反应与重氮苯磺酸反应（偶合）（偶合）酚羟基酚羟基头孢哌酮头孢哌酮7.与铜盐反应与铜盐反应橄榄绿色橄榄绿色NaOH专属反应专属反应（三）沉淀反应（三）沉淀反应1.遇酸遇酸在过量在过量HCl或或有机溶剂中溶解有机溶剂中溶解青霉素的青霉素的碱金属盐碱金属盐的溶解性的溶解性2.有机胺盐反应有机胺盐反应（1）重氮化）重氮化-偶合反应偶合反应 重氮化重氮化-偶合反应偶合反应芳伯氨基芳伯氨基普鲁卡因普鲁卡因普鲁卡因青霉素普鲁卡因青霉素（2）与三硝基苯酚反应）与三硝基苯酚反应 二苄基乙二胺二苄基乙二胺光谱法光谱法（四）（四）1、UV法法样品、分解产物样品、分解产物头孢氨苄头孢氨苄 max=262nm青霉素青霉素V钠钠 A280nm/A264nm=1.301.502、IR法法-内酰胺环内酰胺环酰胺酰胺3、NMR法法 利用不同结构的原子核在利用不同结构的原子核在D2O中有中有不同的不同的NMR光谱进行鉴别光谱进行鉴别JP以吸收峰频率对峰强度进行作图以吸收峰频率对峰强度进行作图 主要研究原子核的磁化性质及其在主要研究原子核的磁化性质及其在外磁场中的运动规律外磁场中的运动规律色谱法色谱法（五）（五）1、TLC法法对照品对照法对照品对照法2、HPLC法法三、杂质检查三、杂质检查 药物药物 检查项目检查项目 检查方法检查方法 头孢他啶头孢他啶 聚合物聚合物 HPLC HPLC法法 头孢曲松钠头孢曲松钠 头孢哌酮钠头孢哌酮钠 头孢噻肟钠头孢噻肟钠 头孢呋辛酯头孢呋辛酯 有关物质和异构体有关物质和异构体 HPLC HPLC法法 头孢氨苄头孢氨苄 有关物质有关物质 反相反相TLCTLC法法青霉素钾（钠）青霉素钾（钠）吸收度吸收度 紫外分光光度法紫外分光光度法 1.1.头孢他啶聚合物的测定头孢他啶聚合物的测定 固定相：葡聚糖凝胶固定相：葡聚糖凝胶G-10G-10（40 40120m 120m）流动相流动相A A：3.5%3.5%硫酸铵的硫酸铵的0.01mol/L0.01mol/L磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液 流动相流动相B B：水：水 对照品溶液：头孢他啶对照品对照品溶液：头孢他啶对照品 100g/ml 100g/ml1 1）系统适用性试验：）系统适用性试验：理论塔板数和拖尾因子用理论塔板数和拖尾因子用0.1mg/ml0.1mg/ml蓝色葡聚蓝色葡聚糖糖20002000、流动相、流动相A A测定；重复性用对照品溶液、测定；重复性用对照品溶液、流动相流动相B B测定。测定。N N不低于不低于900900，拖尾因子，拖尾因子0.0.751.5.5，峰面积，峰面积的的RSDRSD应小于应小于5.0%5.0%。2 2）测定方法）测定方法 进样供试液，用流动相进样供试液，用流动相A A；进样对照液，；进样对照液，用流动相用流动相B B。以外标法计算，含头孢他啶聚合。以外标法计算，含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得超过物以头孢他啶计不得超过0.3%0.3%。2.2.头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查 固定相：固定相：ODSODS 流动相：流动相：0.2mol/L0.2mol/L磷酸二氢铵磷酸二氢铵-甲醇（甲醇（62:3862:38）1 1）头孢呋辛酯）头孢呋辛酯2 2-异构体的制备异构体的制备：头孢呋辛酯：头孢呋辛酯对照品对照品+流动相流动相 头孢呋辛酯头孢呋辛酯2 2-异构体异构体。2 2）系统适用性试验：）系统适用性试验：各异构体之间的各异构体之间的R1.5R1.5，以，以 头孢呋辛酯头孢呋辛酯A A异构体计算异构体计算n1500n1500。3 3）异构体：）异构体：相对保留时间相对保留时间 1-1-被测物被测物 2-2-标准物标准物异构体异构体 相对保留时间相对保留时间 判断判断B B异构体异构体 0.85 0.85 供试液谱图中供试液谱图中A A异构体的峰面积异构体的峰面积A A异构体异构体 1.0 1.0 与与A A、B B异构体峰面积和之比应异构体峰面积和之比应 为为0.480.480.550.55。异构体异构体A A异构体异构体B B头孢呋辛头孢呋辛3.3.头孢氨苄中有关物质的检查头孢氨苄中有关物质的检查-反相反相TLCTLC法法 固定相：活化后的硅胶固定相：活化后的硅胶G G板置板置5%5%（V/VV/V）正十四）正十四 烷的正己烷溶液中，展至顶部，凉干烷的正己烷溶液中，展至顶部，凉干 展开剂：展开剂：0.1mol/L0.1mol/L枸橼酸枸橼酸-0.2mol/L-0.2mol/L磷酸氢二磷酸氢二 钠钠-丙酮（丙酮（120120：8080：3 3）供试液：本品供试液：本品 50mg/ml 50mg/ml 对照液（对照液（1 1）：本品）：本品 0.5 mg/ml 0.5 mg/ml 对照液（对照液（2 2）：）：-苯甘氨酸苯甘氨酸 0.5 mg/ml 0.5 mg/ml 对照液（对照液（3 3）：）：7-7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸氨基去乙酰氧基头孢烷酸 0.5 mg/ml 0.5 mg/ml结果判断结果判断：供试液如显杂质斑点，与对照液：供试液如显杂质斑点，与对照液（2 2）（）（3 3）位置相同上所的斑点比较，其颜色）位置相同上所的斑点比较，其颜色不得更深；如显其他杂质斑不得更深；如显其他杂质斑 点，与对照液点，与对照液（1 1）所显的主斑点比较，其颜色不得更深。）所显的主斑点比较，其颜色不得更深。4.4.青霉素钠（钾）的吸收度检查：青霉素钠（钾）的吸收度检查：供试液供试液 1.80mg/ml 1.80mg/ml，结果判断：结果判断：A A280280不得大于不得大于0.100.10三、三、含量测定含量测定HPLCHPLC、碘碘量量法法、汞汞量量法法、酸酸碱碱滴滴定定法法、可可见紫外分光光度法等见紫外分光光度法等（水解）（水解）碘量法碘量法（一）（一）1.原理原理水解产物水解产物定量过量定量过量剩余剩余-内酰胺类内酰胺类反应分两步进行：反应分两步进行：1.水解反应水解反应 (按化学计算量进行按化学计算量进行)2.氧氧化化-还还原原反反应应 (无无固固定定的的量量关关系系，受受温温度度、PH值值和和时时间间等等因因素素影影响响，应应严严格格控控制制反反应应条条件件并并采采用标准品平行对照测定用标准品平行对照测定)例例注射用普鲁卡因青霉素注射用普鲁卡因青霉素 含量测定含量测定 取装量差异项下的内容物，精密称取装量差异项下的内容物，精密称取约取约0.12g，置，置100ml量瓶中，加水使溶量瓶中，加水使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置碘瓶中，置碘瓶中，加加1mol/L氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液1ml放置放置20分钟，再加分钟，再加1mol/L盐酸溶液盐酸溶液1ml与醋酸与醋酸-醋酸钠缓冲液醋酸钠缓冲液(pH4.5)5ml，精密，精密加入碘滴定液加入碘滴定液(0.01mol/L)15ml，密塞，密塞，摇匀，在摇匀，在2025暗处放置暗处放置20分钟，用分钟，用硫代硫酸钠滴定液（硫代硫酸钠滴定液（0.01mol/L）滴定，）滴定，至近终点时加淀粉指示液，继续滴定并至近终点时加淀粉指示液，继续滴定并强力振摇，至蓝色消失；另精密量取供强力振摇，至蓝色消失；另精密量取供试品溶液试品溶液5ml，置碘瓶中，加醋酸，置碘瓶中，加醋酸-醋酸醋酸钠缓冲液（钠缓冲液（pH4.5）5ml，精密加入碘滴，精密加入碘滴定液（定液（0.01mol/L）15ml，密塞，摇匀，密塞，摇匀，在暗处放置在暗处放置20分钟，用硫代硫酸钠滴定分钟，用硫代硫酸钠滴定液（液（0.01mol/L）滴定，作为空白。同时）滴定，作为空白。同时用青霉素钠对照品同法测定作对照，算用青霉素钠对照品同法测定作对照，算出供试品的含量。出供试品的含量。V样空样空V样样对照液对照液+缓冲液缓冲液+碘液碘液+回滴回滴+碱碱+酸酸+缓冲液缓冲液+碘液碘液+回滴回滴 V对空对空V对对2.方法方法供试液供试液+缓冲液缓冲液+碘液碘液+回滴回滴+碱碱+酸酸+缓冲液缓冲液+碘液碘液+回滴回滴 空白试验空白试验A A、消除样品已降解产物的干扰、消除样品已降解产物的干扰B B、消除样品中其他消耗碘的杂质的干扰、消除样品中其他消耗碘的杂质的干扰C C、消除碘挥发造成的误差、消除碘挥发造成的误差 以未经水解的样品作空白测定以未经水解的样品作空白测定空白空白样品样品I2Na2S2O3I-I2 采用标准品平行对照测定采用标准品平行对照测定A A、可消除温度、可消除温度、pHpH、操作、环境等条件、操作、环境等条件的影响的影响B B、使本法测定结果与微生物检定法一致、使本法测定结果与微生物检定法一致3.条件条件（1）弱酸性）弱酸性 pH4.5碱碱 I2 IO3-+I-酸酸 普鲁卡因与碘在酸性条件普鲁卡因与碘在酸性条件 下会产生复盐沉淀下会产生复盐沉淀（2）温度）温度 2426温度温度38 未水解的供试品亦消耗碘未水解的供试品亦消耗碘（3）水解时间）水解时间以水解以水解20分钟后的分钟后的耗碘量最大耗碘量最大（4）反应时间）反应时间反应反应20分钟后，分钟后，耗碘量随时间的耗碘量随时间的变化较小，可减小含量测定的误变化较小，可减小含量测定的误差差4.特点特点（1）灵敏度高）灵敏度高样品样品:碘碘 =1:8（2）反应条件、实验操作要求高）反应条件、实验操作要求高V对对、V对空对空V样样、V样空样空1份含量份含量加试剂次序、反应时间、滴定速度相同加试剂次序、反应时间、滴定速度相同5.计算计算原料原料汞量法汞量法（二）（二）1.原理原理（水解）（水解）青霉素族青霉素族碱性水解产物碱性水解产物青霉噻唑酸，青霉噻唑酸，进一步水解产进一步水解产物青霉胺物青霉胺2.方法方法醋酸盐缓冲液醋酸盐缓冲液pH4.6滴定滴定水解水解pH4.6滴定滴定样样品品 以未经水解的样品作空白测定以未经水解的样品作空白测定例例青霉素钠青霉素钠 含量测定含量测定 取本品约取本品约50mg，精密称定，加水，精密称定，加水5ml溶解后，加溶解后，加1mol/L氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液5ml，摇匀，放置，摇匀，放置15分钟，加分钟，加1mol/L硝酸溶硝酸溶液液5ml，醋酸盐缓冲液，醋酸盐缓冲液(pH4.6)20ml及水及水20ml，摇匀，照电位滴定法，摇匀，照电位滴定法(附录附录 A),用铂电极为指示电极，汞用铂电极为指示电极，汞-硫酸亚汞电极硫酸亚汞电极为参比电极，在为参比电极，在3540，用硝酸汞滴，用硝酸汞滴定液定液(0.02mol/L)缓慢滴定，缓慢滴定，（控制滴定过程约为（控制滴定过程约为15分钟），不计第分钟），不计第一个等当点，计算第二个等当点时消耗一个等当点，计算第二个等当点时消耗滴定液的量。每滴定液的量。每1ml硝酸汞滴定液硝酸汞滴定液(0.02mol/L)相当于相当于7.128mg的总青霉素的总青霉素(按按C16H17N2NaO4S计算计算)。另取本品约另取本品约0.5g，精密称定，加水，精密称定，加水与上述醋酸盐缓冲液各与上述醋酸盐缓冲液各25ml，振摇使完，振摇使完全溶解，在室温下，立即用硝酸汞滴定全溶解，在室温下，立即用硝酸汞滴定液液(0.02mol/L)滴定，终点判断方法同上滴定，终点判断方法同上.每每1ml硝酸汞滴定液（硝酸汞滴定液（0.02mol/L）相当于）相当于7.128mg的降解物（按的降解物（按C16H17N2NaO4S计算）。计算）。总青霉素的百分含量与降解物的百分含量总青霉素的百分含量与降解物的百分含量之差值即为青霉素的含量。之差值即为青霉素的含量。3、讨论讨论（1）以第二次滴定突跃为终点以第二次滴定突跃为终点 电位法指示终点电位法指示终点 （2）反应摩尔比反应摩尔比 1:1（3）空白试验空白试验 消除已降解产物干扰消除已降解产物干扰（4）优点优点 不需标准品不需标准品4、计算计算 精密称取含水量为精密称取含水量为0.5%的青霉素的青霉素钠钠0.0502g，按药典方法测定总青霉素含，按药典方法测定总青霉素含量时，用去硝酸汞滴定液量时，用去硝酸汞滴定液(0.02009mol/L)6.97ml。另精密称取上述样品。另精密称取上述样品0.5013g，按药典方法测定降解物含量时，用去硝按药典方法测定降解物含量时，用去硝酸汞滴定液酸汞滴定液(0.02009mol/L)1.33ml。以干。以干燥品计算，求样品中青霉素的含量。燥品计算，求样品中青霉素的含量。例例青霉素钠青霉素钠 含量测定含量测定酸碱滴定法酸碱滴定法（三）（三）1、原理原理（钠盐）（钠盐）-内酰胺类内酰胺类-内酰胺内酰胺环的不稳环的不稳定性定性2、方法方法中和中和加加NaOHNaOH中和中和3、讨论讨论（1）水解前先中和溶剂和样品水解前先中和溶剂和样品（2）加热时避免吸收加热时避免吸收CO2不能使酚酞变红不能使酚酞变红（3）空白试验校正空白试验校正(消除消除Na2CO3干扰干扰)（4）特点特点 简便快速简便快速 不适用于有残留酯的产品不适用于有残留酯的产品（四）可见（四）可见-紫外分光光度法紫外分光光度法原理：利用青霉素的降解产物青霉烯酸在原理：利用青霉素的降解产物青霉烯酸在320 nm320 nm360 nm360 nm处有强烈吸收特性，并且处有强烈吸收特性，并且该降解产物与该降解产物与CuCu2+2+或或HgHg2+2+形成稳定并易于测形成稳定并易于测定的配位化合物，从紫外分光光度法测定。定的配位化合物，从紫外分光光度法测定。硫醇汞盐法硫醇汞盐法酸水解铜盐法酸水解铜盐法羟肟酸比色法羟肟酸比色法（水解）（水解）1、酸水解法（铜盐法）酸水解法（铜盐法）（1）原理）原理稳定剂稳定剂JP青霉素族青霉素族酸性降酸性降解产物解产物（2）方法）方法H+（3）特点）特点实验条件随各药物稳定性不同而定实验条件随各药物稳定性不同而定标准品对照法标准品对照法2、硫醇汞盐法硫醇汞盐法（1）原理）原理（咪唑）（咪唑）青霉素族青霉素族催化剂催化剂（2）方法）方法对照品法对照品法pH 9（3）讨论）讨论a.咪唑催化的水解产率高，硫咪唑催化的水解产率高，硫 醇汞盐稳定（醇汞盐稳定（3h）b.侧链有侧链有-NH2时，需加醋酐先时，需加醋酐先 将其乙酰化后才能发生上述将其乙酰化后才能发生上述 反应反应（4）特点）特点A、简便快速、简便快速B、用标准品对照，重现性良、用标准品对照，重现性良 好，好，RSD1%3、羟肟酸比色法羟肟酸比色法Fe3+/3H+红色红色-内酰胺类内酰胺类HPLCHPLC法法（五）（五）内标法校正因子内标法校正因子外标法外标法特点特点 快速、高效、灵敏快速、高效、灵敏 专属性强、重现性好专属性强、重现性好 一法多用（鉴别、检查、含测）一法多用（鉴别、检查、含测）哌拉西宁哌拉西宁 原料药原料药 含量测定含量测定色谱条件色谱条件 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇0.2mol/L0.2mol/L磷酸二氢钠溶液磷酸二氢钠溶液1010氢氧化四乙基铵氢氧化四乙基铵溶液溶液水（水（40040050503 3547547）用磷酸调节）用磷酸调节pHpH值至值至5.55.5为流动相。检测波长为为流动相。检测波长为254nm254nm。生物样本中生物样本中-内酰胺类抗生素的分析内酰胺类抗生素的分析血浆血浆尿样尿样唾液唾液胆汁胆汁生生物物样样本本色谱柱色谱柱：Hypersil ODS C18(200 mm4.6 mm,I.D.5m)样品制备样品制备：取血浆取血浆200L，加入内标，加入内标5L，再加入，再加入HCLO4，窝旋提取窝旋提取Internal standard IS第三节第三节 氨基糖苷类抗生素氨基糖苷类抗生素链霉素链霉素 双氢链霉素双氢链霉素新霉素新霉素 卡那霉素卡那霉素庆大霉素庆大霉素 巴龙霉素巴龙霉素一、结构与性质一、结构与性质链霉素链霉素链霉胍链霉胍+链霉糖链霉糖+N-甲基甲基-L-葡萄糖胺葡萄糖胺 苷元苷元糖糖链霉双糖胺链霉双糖胺链霉素：链霉素：链霉胍链霉胍链霉糖链霉糖N-甲基甲基-L-葡萄糖胺葡萄糖胺巴龙霉素巴龙霉素D-D-葡萄糖胺葡萄糖胺+脱氧链霉胺脱氧链霉胺+D-+D-核糖核糖+巴龙霉糖巴龙霉糖巴龙胺巴龙胺苷元苷元巴龙二糖胺巴龙二糖胺 糖糖 庆大霉素庆大霉素 糖糖 苷元苷元绛红糖胺绛红糖胺 +脱氧链霉胺脱氧链霉胺 +加洛糖胺加洛糖胺 糖糖 绛红糖胺绛红糖胺紫素胺紫素胺2-脱氧链霉胺脱氧链霉胺加洛糖胺加洛糖胺N-甲基甲基-3-去氧去氧-4-甲甲基戊糖胺基戊糖胺庆大霉素庆大霉素C复合物复合物 庆大霉素庆大霉素C1 R=H R1、R2=CH3 庆大霉素庆大霉素C2 R=R2=H R1=CH3 庆大霉素庆大霉素C1a R、R1、R2=H 庆大霉素庆大霉素C2a R=CH3 R1=R2=H 庆大霉素庆大霉素C2b R=R1=H R2=CH3性质：性质：多与硫酸成盐多与硫酸成盐链霉素链霉素 3 3个个庆大霉素庆大霉素 5 5个个碱性中心碱性中心碱性碱性（一）（一）水溶性水溶性溶解性溶解性（二）（二）巴龙霉素巴龙霉素 4个个链霉素链霉素 pH57.5庆大霉素庆大霉素 pH212 稳定稳定UV（三）（三）稳定性稳定性（四）（四）链霉素水解产物反应链霉素水解产物反应（五）（五）二、二、鉴别鉴别 茚三酮反应茚三酮反应（一）（一）羟基胺结构羟基胺结构N-甲基葡萄糖胺反应甲基葡萄糖胺反应（二）（二）乙酰丙酮乙酰丙酮 OH-吡咯衍生物吡咯衍生物对二甲氨基苯甲醛对二甲氨基苯甲醛H+樱桃红色樱桃红色（Elson-Morgan反应）反应）麦芽酚反应麦芽酚反应（三）（三）链霉素特有反应链霉素特有反应H+分子重排分子重排（四）（四）Molisch反应反应 具有五碳糖或六碳糖的氨基糖苷类抗生素经酸水解具有五碳糖或六碳糖的氨基糖苷类抗生素经酸水解后，在盐酸作用下脱水生成后，在盐酸作用下脱水生成糠醛糠醛或或羟甲基糠醛羟甲基糠醛，加，加入入 萘酚萘酚（红紫色红紫色）或）或蒽酮蒽酮（蓝紫色蓝紫色）（五）坂口反应（五）坂口反应链霉胍的特有反应链霉胍的特有反应 向链霉素的水解产物链霉胍与向链霉素的水解产物链霉胍与NaBrO2反应得产物反应得产物1；8-羟基喹啉羟基喹啉也和也和NaBrO2反应得产物反应得产物2。产物。产物1和产物和产物2再相互作用再相互作用生成生成橙红色橙红色化合物化合物。（六）（六）反应反应H+庆大霉素无庆大霉素无UV吸收吸收（七）（七）UV法法（八）色谱法（八）色谱法 1 1、TLCTLC法：硫酸庆大霉素的鉴别法：硫酸庆大霉素的鉴别 点样：供试液：展开、凉干、碘蒸气中显色点样：供试液：展开、凉干、碘蒸气中显色 对照液对照液 判断：供试液与对照液所显斑点的颜色与位判断：供试液与对照液所显斑点的颜色与位 置应一致。置应一致。点样：供试液点样：供试液 对照液对照液：硫酸链霉素标准品：硫酸链霉素标准品 对照液对照液：硫酸链霉素标准品：硫酸链霉素标准品+硫酸硫酸 新霉素标准品新霉素标准品+硫酸卡那霉素标准品硫酸卡那霉素标准品 判定法：供试液中主斑点的位置、颜色、大小判定法：供试液中主斑点的位置、颜色、大小 应与对照液应与对照液 相同，相同，对照液对照液应显示分离清晰的应显示分离清晰的3 3个斑点个斑点 否则试验无效。否则试验无效。2 2、HPLCHPLC法：硫酸庆大霉素的鉴别法：硫酸庆大霉素的鉴别 比较供试液与对照液各组分的保留时间比较供试液与对照液各组分的保留时间三、特殊杂质的检查三、特殊杂质的检查1 1、链霉素中链霉素、链霉素中链霉素B B的检查的检查TLCTLC法法硅胶硅胶G G板（板（使用前需活化使用前需活化）、展开剂）、展开剂 甲苯甲苯-冰乙冰乙酸酸-甲醇甲醇（50:25:2550:25:25）、）、0.20.2二羟萘的乙醇二羟萘的乙醇2020硫酸混合液硫酸混合液色谱柱、流动相、检测波长、衍生化条件的摸索色谱柱、流动相、检测波长、衍生化条件的摸索 对微生物的活性无明显差异对微生物的活性无明显差异毒副作用和耐药性不同毒副作用和耐药性不同发酵菌种不同发酵菌种不同工艺差别工艺差别C C组分比例组分比例不一致不一致规定控制各组分的相对百分含量规定控制各组分的相对百分含量2 2、庆大霉素庆大霉素C C组分的测定组分的测定衍生化后衍生化后HPLCHPLC组分组分C C的毒副作用的毒副作用和耐药性与庆大和耐药性与庆大霉素有差异，导霉素有差异，导致产品的效价和致产品的效价和临床疗效临床疗效max=330nm（1 1）衍生化原理）衍生化原理 或电化学检测器或电化学检测器或蒸发光散射检测器或蒸发光散射检测器RPHPLC（2 2）方法）方法 规定规定 C1 2550%C1a 1540%C2a+C2 2050%（3 3）计算）计算 峰面积归一化法峰面积归一化法四、四、含量测定含量测定链霉素、庆大霉素链霉素、庆大霉素微生物检定法微生物检定法 本法系利用抗生素在琼脂培养本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用量反应平行线原理基内的扩散作用量反应平行线原理的设计，比较标准品与供试品两者的设计，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。，以测定供试品效价的一种方法。第四节第四节 四环素类抗生素四环素类抗生素一、结构与性质一、结构与性质123456789101112性质性质 两性两性（一）（一）1.与酸、碱均能成盐与酸、碱均能成盐2.强酸或强碱中溶解度强酸或强碱中溶解度 C C1010酚羟基、烯醇型羟基酚羟基、烯醇型羟基 弱酸性弱酸性C C4 4二甲胺基二甲胺基 弱碱性弱碱性吸湿性吸湿性（二）（二）多含结晶水多含结晶水与金属离子生成有色配位化合物与金属离子生成有色配位化合物Ca2+Mg2+Fe3+Al3+UV具有共轭双键体系（吸收波长为长波方向）具有共轭双键体系（吸收波长为长波方向）（三）（三）与金属离子络合与金属离子络合（四）（四）pH3 7.5 荧光荧光 酚羟基、酚羟基、烯醇基烯醇基不稳定性不稳定性（四）（四）差向异构化差向异构化淡黄淡黄黑黑蓝色荧光蓝色荧光弱酸性环境弱酸性环境ETC差向四环素差向四环素强酸性环境强酸性环境ATC脱水四环素脱水四环素 碱性下降解碱性下降解（荧光）（荧光）碱性环境碱性环境EATC异四环素异四环素差向脱水四环素差向脱水四环素二、二、鉴别试验鉴别试验H2SO4反应反应（一）（一）FeCl3反应反应（二）（二）含有酚羟基含有酚羟基Cl-反应反应（三）（三）溶剂：溶剂：1mol/L盐酸盐酸-甲醇甲醇浓度：浓度：0.01mg/mlUV法法（四）（四）荧光法荧光法（五）（五）UV绿色荧光绿色荧光H+UV具有共具有共轭双键轭双键TLC法法（六）（六）正相分配薄层正相分配薄层 色谱色谱IR法法（五）（五）加入加入EDTA 克服痕量金属造成的克服痕量金属造成的 拖尾现象拖尾现象三、检查三、检查 4-4-差向四环素（差向四环素（ETCETC）脱水四环素（脱水四环素（ATCATC）差向脱水四环素（差向脱水四环素（EATCEATC）盐酸金霉素（盐酸金霉素（CTCCTC）（一）有关物质（一）有关物质TLCTLC法（法（19951995版）版）HPLCHPLC法（法（20052005版）版）标准品对照法标准品对照法盐酸四环素盐酸四环素四环素有关物质四环素有关物质TLCTLC图图I.I.供试液供试液(5(5 mg/ml)mg/ml)II.II.ETCETCIII.III.(0.2 mg/ml)III.III.ATC ATCIV.(0.025 mg/ml)IV.EATC IV.EATC (0.025 mg/ml)V.V.CTCCTCVI.VI.(0.1 mg/ml)VI.VI.混合液混合液4 40.50.50.50.52 2（二）杂质吸收度（二）杂质吸收度杂质吸收度杂质吸收度四、四、含量测定含量测定HPLCHPLC法（外标法）法（外标法）盐酸四环素的测定盐酸四环素的测定系统适用性试验：盐酸四环素、有关物系统适用性试验：盐酸四环素、有关物质及质及ATCATC峰间的分离度均应符合要求峰间的分离度均应符合要求 第五节第五节 抗生素类药物中高分子杂质的检查抗生素类药物中高分子杂质的检查1.1.高分子杂质高分子杂质 分子量大于药物本身的杂质总称。分子量大于药物本身的杂质总称。蛋白、多肽、多糖或抗生素与蛋白、蛋白、多肽、多糖或抗生素与蛋白、多肽、多糖的结合物。主要来自于发酵工艺，致多肽、多糖的结合物。主要来自于发酵工艺，致敏，如青霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽。敏，如青霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽。药物的自身聚合物，来自于生产、药物的自身聚合物，来自于生产、贮存过程。可引发过敏贮存过程。可引发过敏外源性杂质外源性杂质内源性杂质内源性杂质2 2、基本特点、基本特点对青霉素而言对青霉素而言青霉噻唑多肽青霉噻唑多肽外源性的（外源性的（24003500）青霉素聚合物青霉素聚合物内源性的（聚合度）内源性的（聚合度）母核参与的聚合反应母核参与的聚合反应N N型聚合反应型聚合反应 侧链参与的聚合反应侧链参与的聚合反应L L型聚合反应型聚合反应分分类类特点：特点：（1 1）生产过程中的任何蛋白或碎片都可带入产品中，）生产过程中的任何蛋白或碎片都可带入产品中，易与药物形成多肽类杂质易与药物形成多肽类杂质（2 2）形成的聚合物也可发生不同程度的降解）形成的聚合物也可发生不同程度的降解（3 3）异构体之间可以相互聚合）异构体之间可以相互聚合L-L、D-D、L-D（4 4）高分子杂质与生产工艺密切相关）高分子杂质与生产工艺密切相关高分子杂质的控制方法高分子杂质的控制方法（1 1）高效液相色谱法）高效液相色谱法（2 2）凝胶色谱）凝胶色谱自身对照外标法自身对照外标法 Sephadex G-10（3 3）离子交换色谱）离子交换色谱凝胶色谱法：凝胶色谱法：利用凝胶的分子筛作用，让药利用凝胶的分子筛作用，让药物分子自由的进入到凝胶颗粒内部，而高分物分子自由的进入到凝胶颗粒内部，而高分子杂质被排阻的原理进行的。故此大分子则子杂质被排阻的原理进行的。故此大分子则先流出色谱柱，小分子后出峰而得以分离。先流出色谱柱，小分子后出峰而得以分离。高分子杂质的分析方法高分子杂质的分析方法（1）蓝色葡聚糖在高分子分离中的）蓝色葡聚糖在高分子分离中的 N2500/m，拖尾因子，拖尾因子0.751.5（2）峰面积的）峰面积的RSD5色色谱谱适适用用性性条条件件HPLCHPLC系统系统简单测定系统简单测定系统分分析析方方法法