蛋白质分离、纯化.ppt

第七章第七章 蛋白质的分离、纯化蛋白质的分离、纯化蛋白质分离、纯化主要依据蛋白质分离、纯化主要依据（1）蛋白质的分子大小）蛋白质的分子大小 透析、超滤、分子筛层析透析、超滤、分子筛层析（2）蛋白质的带电特性）蛋白质的带电特性 等电点沉淀、离子交换层析、等电点沉淀、离子交换层析、等电聚焦电泳等电聚焦电泳（3）蛋白质的溶解特性）蛋白质的溶解特性 硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级分离硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级分离 （一）材料（一）材料 1 1、选材、选材 2 2、破碎、破碎 3 3、混合物的分离、混合物的分离 （二）粗分级（二）粗分级 （三）细分级（三）细分级 采用简单的实验技术手段，比如盐析、采用简单的实验技术手段，比如盐析、等电点沉淀、透析、超速离心等对蛋等电点沉淀、透析、超速离心等对蛋白质粗提取液进行初步分离纯化，经白质粗提取液进行初步分离纯化，经浓缩后得到蛋白质粗制品。浓缩后得到蛋白质粗制品。蛋白质粗分级蛋白质粗分级一、盐析一、盐析盐析盐析：蛋白质在高浓度中性盐溶液中会沉淀析出。：蛋白质在高浓度中性盐溶液中会沉淀析出。常用常用硫酸铵硫酸铵进行沉淀。进行沉淀。分级沉淀分级沉淀：通过调节硫酸铵的浓度可以使不同的蛋：通过调节硫酸铵的浓度可以使不同的蛋 白质分阶段沉淀下来。白质分阶段沉淀下来。优点优点：价格便宜、蛋白质沉淀完全、溶解过程发热少等。：价格便宜、蛋白质沉淀完全、溶解过程发热少等。不足不足：沉淀后蛋白质中含有大量硫酸铵，对后续纯化过程：沉淀后蛋白质中含有大量硫酸铵，对后续纯化过程 产生不良影响。产生不良影响。v二、有机溶剂分级沉淀二、有机溶剂分级沉淀有机溶剂如有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮甲醇、乙醇、丙酮等（保持低等（保持低温），能温），能破坏蛋白质的水化层，使蛋白质破坏蛋白质的水化层，使蛋白质的溶解度降低而沉淀。的溶解度降低而沉淀。优点优点：蛋白质沉淀不用脱盐、有机溶剂去除容易。：蛋白质沉淀不用脱盐、有机溶剂去除容易。缺点缺点：容易引起蛋白质分子的变性，实验过程严格：容易引起蛋白质分子的变性，实验过程严格低温。低温。三、超速离心法三、超速离心法在强大的离心力的作用下，溶液中在强大的离心力的作用下，溶液中的不溶解的颗粒状物质会沉淀析出，的不溶解的颗粒状物质会沉淀析出，从而使溶液和沉淀物质分开。从而使溶液和沉淀物质分开。四、等电点沉淀法四、等电点沉淀法在一定的在一定的在一定的在一定的pHpHpHpH条件下，蛋白质所带的条件下，蛋白质所带的条件下，蛋白质所带的条件下，蛋白质所带的净电荷为零，净电荷为零，净电荷为零，净电荷为零，分子之间的静电排斥力最小，因而容易聚集形成分子之间的静电排斥力最小，因而容易聚集形成分子之间的静电排斥力最小，因而容易聚集形成分子之间的静电排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。该法适用于在等电点沉淀。该法适用于在等电点沉淀。该法适用于在等电点沉淀。该法适用于在等电点pHpHpHpH稳定的蛋白质。稳定的蛋白质。稳定的蛋白质。稳定的蛋白质。Protein的等电点（的等电点（PI）1、定义：使蛋白质分子所带正电荷与负电荷相等，即净电、定义：使蛋白质分子所带正电荷与负电荷相等，即净电荷为零时的溶液的荷为零时的溶液的pH值称为值称为PI(isoelectric point).2、当、当pH值值 PI 时，蛋白质带负电荷时，蛋白质带负电荷 当当pH值值PI 时，蛋白质带正电荷时，蛋白质带正电荷 当当pH值值=PI 时，蛋白质带净电荷为零时，蛋白质带净电荷为零电泳分离电泳分离正极移动正极移动负极移动负极移动不移动不移动五五 透透 析析按照分子大按照分子大小进行分离小进行分离.分离取决于分离取决于透析袋截留透析袋截留的分子量。的分子量。透析液透析液浓缩的蛋白浓缩的蛋白混合样品混合样品 透析袋透析袋 开始透析开始透析处于平衡状态处于平衡状态一般用于除盐类和小分子杂质一般用于除盐类和小分子杂质一般用于除盐类和小分子杂质一般用于除盐类和小分子杂质五、透五、透 析析六、超滤六、超滤除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质加加压压蛋白质溶液蛋白质溶液半透膜半透膜支持膜的栅板支持膜的栅板超滤液超滤液采用采用分子筛层析、离子交换层析、亲和层分子筛层析、离子交换层析、亲和层析析等手段结合多种电泳技术，包括等手段结合多种电泳技术，包括聚丙烯聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳等进一步对等进一步对蛋白质粗制品分离纯化，以获得高纯度的蛋白质粗制品分离纯化，以获得高纯度的蛋白质样品，用于蛋白质结构、功能及其蛋白质样品，用于蛋白质结构、功能及其应用研究。应用研究。蛋白质细分级蛋白质细分级一、凝胶层析一、凝胶层析又叫分子筛层析。又叫分子筛层析。又叫分子筛层析。又叫分子筛层析。分子筛是具有三维空间网状结构的物质，分子筛是具有三维空间网状结构的物质，分子筛是具有三维空间网状结构的物质，分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天然的，也可人工合成。根据网孔不同可制有天然的，也可人工合成。根据网孔不同可制有天然的，也可人工合成。根据网孔不同可制有天然的，也可人工合成。根据网孔不同可制成不同规格成不同规格成不同规格成不同规格。凝胶层析凝胶层析 原理：原理：原理：原理：1 1 1 1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物质迁移速度快；质迁移速度快；质迁移速度快；质迁移速度快；2 2 2 2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部，、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部，、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部，、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部，所以小分子物质迁移速度慢。所以小分子物质迁移速度慢。所以小分子物质迁移速度慢。所以小分子物质迁移速度慢。具备条件：具备条件：1 1惰性，惰性，2 2水不溶性，水不溶性，3 3能高度水能高度水化。化。常用分子筛：常用分子筛：葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶（SephadexSephadex）型号：型号：型号：型号：G200G200G200G200、G150 G150 G150 G150、G100 G100 G100 G100、G75 G75 G75 G75、G50G50G50G50、G25 G25 G25 G25、G15 G15 G15 G15 分离大蛋白质、小蛋白质，除盐分离大蛋白质、小蛋白质，除盐分离大蛋白质、小蛋白质，除盐分离大蛋白质、小蛋白质，除盐 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶（瑞典（瑞典SepharoseSepharose、美国、美国Bio-GelABio-GelA）孔径大，用于分离大分子物质孔径大，用于分离大分子物质孔径大，用于分离大分子物质孔径大，用于分离大分子物质 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶（Bio-GelP Bio-GelP）带网孔的带网孔的葡聚糖珠葡聚糖珠小分子进入小分子进入葡聚糖珠内葡聚糖珠内大分子不大分子不能进入珠能进入珠内，经珠内，经珠之间缝隙之间缝隙流出流出凝胶过滤层析过程示意图凝胶过滤层析过程示意图 凝胶的前处理凝胶的前处理溶胀：溶胀：称取适量凝胶干粉，用约称取适量凝胶干粉，用约1010倍蒸馏水浸泡倍蒸馏水浸泡2424小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上层小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上层悬浮物及蒸馏水。悬浮物及蒸馏水。碱洗：碱洗：用用0.5 M NaOH 0.5 M NaOH 溶液浸泡半个小时，然后溶液浸泡半个小时，然后用蒸馏水洗至中性。用蒸馏水洗至中性。酸洗：酸洗：用用0.5 M HCl 0.5 M HCl 溶液浸泡半个小时，然后用溶液浸泡半个小时，然后用蒸馏水洗至中性。蒸馏水洗至中性。平衡：平衡：用起始缓冲液浸泡凝胶，直至凝胶液用起始缓冲液浸泡凝胶，直至凝胶液pHpH与与起始缓冲液相同。起始缓冲液相同。1.1.将层析柱垂直固定，加入适将层析柱垂直固定，加入适量溶剂排走空气。量溶剂排走空气。2.2.将平衡好的凝胶搅匀，连续将平衡好的凝胶搅匀，连续倾入柱中，待其自然沉降至倾入柱中，待其自然沉降至1/41/31/41/3高时打开下端出口，高时打开下端出口，让溶剂慢慢流出，继续侵入让溶剂慢慢流出，继续侵入凝胶至沉降到所需高度。装凝胶至沉降到所需高度。装柱时要注意操作压。柱时要注意操作压。3.3.用用3-53-5倍柱床体积的起始缓冲倍柱床体积的起始缓冲液走柱，使交换剂充分平衡，液走柱，使交换剂充分平衡，柱床稳定。柱床稳定。装装 柱柱样品上柱、洗脱、收集样品上柱、洗脱、收集 1.1.如图装好层析装置，打开下端出如图装好层析装置，打开下端出口，使溶液流出至刚好达到凝胶胶口，使溶液流出至刚好达到凝胶胶面面2.2.沿柱壁缓慢加入沿柱壁缓慢加入2ml2ml样品，打开下样品，打开下端出口，使样品溶液流出至刚好达端出口，使样品溶液流出至刚好达到凝胶胶面，再取少量起始缓冲液到凝胶胶面，再取少量起始缓冲液洗涤柱壁。洗涤柱壁。3.3.打开起始缓冲液阀门，连续洗脱。打开起始缓冲液阀门，连续洗脱。4.4.用自动部分收集器自动或手动收用自动部分收集器自动或手动收集，合并同一高峰各管。集，合并同一高峰各管。凝胶的再生及保存凝胶的再生及保存再生再生 用过的凝胶经用过的凝胶经0.5M的的NaOH和和HCl溶溶液分别处理后可以恢复其性能液分别处理后可以恢复其性能凝胶的保存方法凝胶的保存方法 0.02%叠氮钠叠氮钠 或或0.002%双氯苯双胍己烷双氯苯双胍己烷二、离子交换层析二、离子交换层析蛋白质是由氨基酸聚合形成的聚合物，所以蛋白质也蛋白质是由氨基酸聚合形成的聚合物，所以蛋白质也存在等电点（存在等电点（pIpI），蛋白质在溶液中带电状况同氨基），蛋白质在溶液中带电状况同氨基酸相同，取决于所处溶液的酸相同，取决于所处溶液的pH pH 值。值。当当pI pHpI pH pI pH时，蛋白质带净正电荷。时，蛋白质带净正电荷。注意注意：阳离子交换剂本身带负电荷，阴离子交换剂本身带正电荷。：阳离子交换剂本身带负电荷，阴离子交换剂本身带正电荷。离子交换层析离子交换层析可分为阳离子交换与阴离子交换。可分为阳离子交换与阴离子交换。1 1、树脂类：分离氨基酸，孔径小；、树脂类：分离氨基酸，孔径小；2 2、纤维素类：分离蛋白质，孔径大。、纤维素类：分离蛋白质，孔径大。通过改变盐浓度，辅助改变通过改变盐浓度，辅助改变pHpH值进行梯度洗脱。值进行梯度洗脱。阳阳离离子子交交换换层层析析过过程程离子交离子交换树脂换树脂蛋白质蛋白质低离子低离子强度洗强度洗脱液洗脱液洗高离子高离子强度洗强度洗脱液洗脱液洗加加样样平平衡衡液液洗洗收集收集离子交换层析离子交换层析三、亲和层析三、亲和层析 原理：原理：依赖于依赖于蛋白质蛋白质和它的和它的配体（配体（ligandligand）之间的专一）之间的专一识别并结合的特性来分离蛋白质。识别并结合的特性来分离蛋白质。配体配体通常指的是能与另一个分子或原子结合（一般是非共价结合）通常指的是能与另一个分子或原子结合（一般是非共价结合）的分子、基团、离子、或原子。但在亲和层析中，配体是通过共价键先的分子、基团、离子、或原子。但在亲和层析中，配体是通过共价键先与基质结合，配体可以是酶结合的一个反应物或产物，或是一种可以识与基质结合，配体可以是酶结合的一个反应物或产物，或是一种可以识别靶蛋白的抗体别靶蛋白的抗体.含配体溶液含配体溶液收集目的蛋白收集目的蛋白 洗下未结合的蛋白洗下未结合的蛋白混合蛋白样品混合蛋白样品平衡液平衡液带有配体的树脂带有配体的树脂珠（或胶粒）珠（或胶粒）电泳法电泳法类型：类型：1 1、区带电泳、区带电泳 纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、细纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、细纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、细纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳、凝胶电泳。丝电泳、凝胶电泳。丝电泳、凝胶电泳。丝电泳、凝胶电泳。凝胶电泳包括：琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅胶凝胶电泳包括：琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅胶凝胶电泳包括：琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅胶凝胶电泳包括：琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅胶凝胶、聚丙烯酰胺凝胶。凝胶、聚丙烯酰胺凝胶。凝胶、聚丙烯酰胺凝胶。凝胶、聚丙烯酰胺凝胶。聚丙烯酰胺凝胶包括：垂直板电泳、盘状电泳、聚丙烯酰胺凝胶包括：垂直板电泳、盘状电泳、聚丙烯酰胺凝胶包括：垂直板电泳、盘状电泳、聚丙烯酰胺凝胶包括：垂直板电泳、盘状电泳、等电聚焦电泳、梯度电泳、免疫电泳。等电聚焦电泳、梯度电泳、免疫电泳。等电聚焦电泳、梯度电泳、免疫电泳。等电聚焦电泳、梯度电泳、免疫电泳。2 2、自由界面电泳、自由界面电泳：支持物为溶液，很少用。支持物为溶液，很少用。支持物为溶液，很少用。支持物为溶液，很少用。1 1原理原理聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶是是由由单单体体丙丙烯烯酰酰胺胺(简简称称Acr)Acr)和和交交联联剂剂N,N-N,N-甲甲叉叉双双丙丙烯烯酰酰胺胺(简简称称Bis)Bis)在在加加速速剂剂N N，N N-四四甲甲基基乙乙二二胺胺(简简称称TEMED)TEMED)和和催催化化剂剂过过硫硫酸酸铵铵(简简称称AP)AP)的的作作用用下下聚聚合合交交联联成成三三维维网网状状结结构构的的凝凝胶胶，以以此此凝凝胶胶为为支支持持物物的的电电泳泳称称为为聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶电泳胶电泳(简称简称PAGE)PAGE)。聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶优点聚丙烯酰胺凝胶优点1)1)化学性能稳定，对化学性能稳定，对pHpH和温度变化不敏感；和温度变化不敏感；2)2)重复性好；重复性好；3)3)灵敏度高，可达灵敏度高，可达1010-6-6 g g；4)4)分辨率高。分辨率高。分子量范围分子量范围 适用的凝胶浓度适用的凝胶浓度/(%)/(%)10104 4 20-30 20-30 1-410 1-4104 4 15-20 15-20 1-510 1-5104 4-110-1105 5 10-15 10-15 110 1105 5 5-10 5-10 5105105 5 2-5 2-5分子量范围与凝胶浓度的关系分子量范围与凝胶浓度的关系凝胶浓度的选择与被分离物质分子量密切相关凝胶浓度的选择与被分离物质分子量密切相关垂直板电泳垂直板电泳垂直板电泳垂直板电泳垂直板电泳垂直板电泳蛋白质微型电泳系统蛋白质微型电泳系统SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 1 1 1 1、由于、由于、由于、由于SDSSDS是阴离子，使多肽表面覆盖的负电荷远远是阴离子，使多肽表面覆盖的负电荷远远是阴离子，使多肽表面覆盖的负电荷远远是阴离子，使多肽表面覆盖的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了原来的电荷超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了原来的电荷超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了原来的电荷超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了原来的电荷差异。差异。差异。差异。2 2 2 2、改变了蛋白质单体分子的构象，不同蛋白质的、改变了蛋白质单体分子的构象，不同蛋白质的、改变了蛋白质单体分子的构象，不同蛋白质的、改变了蛋白质单体分子的构象，不同蛋白质的SDSSDSSDSSDS复合物的短轴长度都相同，长轴长度随其复合物的短轴长度都相同，长轴长度随其复合物的短轴长度都相同，长轴长度随其复合物的短轴长度都相同，长轴长度随其分子量的分子量的分子量的分子量的大小成正比大小成正比大小成正比大小成正比变化。变化。变化。变化。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳实验方法：实验方法：变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）聚丙烯酰胺凝胶的制备聚丙烯酰胺凝胶的制备 蛋白质样品准备蛋白质样品准备 点样点样 电泳电泳 染色与脱色染色与脱色 样品回收样品回收 等电聚焦等电聚焦（Isoelectric focusing）(1)(1)(1)(1)以不同蛋白质的以不同蛋白质的以不同蛋白质的以不同蛋白质的等电点的差异等电点的差异等电点的差异等电点的差异分离。分离。分离。分离。(2)(2)(2)(2)凝胶中含有蛋白质样品和载体两性电解质。凝胶中含有蛋白质样品和载体两性电解质。凝胶中含有蛋白质样品和载体两性电解质。凝胶中含有蛋白质样品和载体两性电解质。(3)(3)(3)(3)载体两性电解质：载体两性电解质：载体两性电解质：载体两性电解质：a a a a 是一系列物质的混合物。此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不是一系列物质的混合物。此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不是一系列物质的混合物。此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不是一系列物质的混合物。此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不能相差太大（小数点后能相差太大（小数点后能相差太大（小数点后能相差太大（小数点后2 2 2 2位）；最常用为范围，还有、。位）；最常用为范围，还有、。位）；最常用为范围，还有、。位）；最常用为范围，还有、。b b b b 混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证能顺序排列；混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证能顺序排列；混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证能顺序排列；混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证能顺序排列；c c c c 混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、多羧基的脂肪族化合物；多羧基的脂肪族化合物；多羧基的脂肪族化合物；多羧基的脂肪族化合物；d d d d 要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离。要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离。要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离。要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离。等电聚焦等电聚焦（Isoelectric focusing）通电后，在介质中由于通电后，在介质中由于通电后，在介质中由于通电后，在介质中由于H H H H+与与与与OHOHOHOH-的相向移动，形的相向移动，形的相向移动，形的相向移动，形成了从的一系列成了从的一系列成了从的一系列成了从的一系列pHpHpHpH梯度。当载体两性电解质移动到梯度。当载体两性电解质移动到梯度。当载体两性电解质移动到梯度。当载体两性电解质移动到各自的等电点时，就停止移动，不带电荷，并维持各自的等电点时，就停止移动，不带电荷，并维持各自的等电点时，就停止移动，不带电荷，并维持各自的等电点时，就停止移动，不带电荷，并维持pHpHpHpH梯度（电导、缓冲能力）。梯度（电导、缓冲能力）。梯度（电导、缓冲能力）。梯度（电导、缓冲能力）。即：即：即：即：pHpHpHpH梯度由梯度由梯度由梯度由H H H H+与与与与OHOHOHOH-建立，而由载体两性电解建立，而由载体两性电解建立，而由载体两性电解建立，而由载体两性电解质来维持。当蛋白质移动到相应的质来维持。当蛋白质移动到相应的质来维持。当蛋白质移动到相应的质来维持。当蛋白质移动到相应的pHpHpHpH值处，结束。值处，结束。值处，结束。值处，结束。注意事项注意事项注意事项注意事项：1 1 1 1、时间相对长对分离有利；、时间相对长对分离有利；、时间相对长对分离有利；、时间相对长对分离有利；2 2 2 2、也可用来测定蛋白质的等电点。、也可用来测定蛋白质的等电点。、也可用来测定蛋白质的等电点。、也可用来测定蛋白质的等电点。等电聚焦等电聚焦（Isoelectric focusing）蛋白质含量测定与蛋白质鉴定蛋白质含量测定与蛋白质鉴定 在蛋白质工程的相关研究中，不仅需要经常测定蛋白质在蛋白质工程的相关研究中，不仅需要经常测定蛋白质在蛋白质工程的相关研究中，不仅需要经常测定蛋白质在蛋白质工程的相关研究中，不仅需要经常测定蛋白质含量，而且要对目标蛋白质进行鉴定。含量，而且要对目标蛋白质进行鉴定。含量，而且要对目标蛋白质进行鉴定。含量，而且要对目标蛋白质进行鉴定。蛋白质含量测定有很多方法蛋白质含量测定有很多方法凯氏定氮法凯氏定氮法 双缩脲法双缩脲法 福林福林-酚法酚法 考马斯亮蓝比色法考马斯亮蓝比色法 紫外吸收法紫外吸收法 蛋白质鉴定包括很多内容，蛋白质鉴定包括很多内容，蛋白质分子量与等电点蛋白质分子量与等电点的测定的测定 蛋白质氨基酸组成及顺蛋白质氨基酸组成及顺序的分析序的分析 蛋白质结晶与结构分析蛋白质结晶与结构分析 蛋白质生物活性及功能蛋白质生物活性及功能测定测定 蛋白质含量测定蛋白质含量测定 最经典的蛋白质含量测定方法是凯氏定氮法，其基本依最经典的蛋白质含量测定方法是凯氏定氮法，其基本依据是蛋白质平均含氮量为据是蛋白质平均含氮量为16%16%，假设测得样品中的含氮量为，假设测得样品中的含氮量为1 1 g g，所有的氮以蛋白质的形式存在，则蛋白质含量为，所有的氮以蛋白质的形式存在，则蛋白质含量为1/16%=6.25 g1/16%=6.25 g。紫外吸收差法是最简单便捷的蛋白质含量测定方法，分紫外吸收差法是最简单便捷的蛋白质含量测定方法，分别测定样品在别测定样品在280nm280nm和和260nm260nm的光吸收值，利用经验公式，蛋的光吸收值，利用经验公式，蛋白质浓度（白质浓度（mgmgmLmL）1.45A1.45A280 280 nmnm0.74A0.74A260260 nm nm，很容，很容易计算出样品的蛋白质含量。易计算出样品的蛋白质含量。分光光度法是主要的蛋白质含量测定方法，首先将蛋白分光光度法是主要的蛋白质含量测定方法，首先将蛋白质样品与特定的显色剂反应，反应产物在特定波长的光吸收质样品与特定的显色剂反应，反应产物在特定波长的光吸收与蛋白质含量成正比，利用标准曲线即可查得样品的蛋白质与蛋白质含量成正比，利用标准曲线即可查得样品的蛋白质含量。含量。蛋白质鉴定蛋白质鉴定蛋白质鉴定主要包括以下几个方面：蛋白质鉴定主要包括以下几个方面：蛋白质纯度鉴定蛋白质纯度鉴定 蛋白质分子量及等电点测定蛋白质分子量及等电点测定蛋白质氨基酸组成及顺序分析蛋白质氨基酸组成及顺序分析 蛋白质结晶与结构分析蛋白质结晶与结构分析 蛋白质免疫印迹（蛋白质免疫印迹（Western-blottingWestern-blotting）鉴定）鉴定 蛋白质生物活性及功能测定蛋白质生物活性及功能测定 （一）蛋白质纯度鉴定：（一）蛋白质纯度鉴定：目目前前最最常常用用的的蛋蛋白白质质纯纯度度鉴鉴定定为为电电泳泳法法，电电泳泳后后的的凝凝胶胶经经过过染染色色脱脱色色后后，用用目目标标蛋蛋白白质质条条带带占占整整个个泳泳道道蛋蛋白白质质条条带带的的百百分比来表示目标蛋白的纯度。分比来表示目标蛋白的纯度。（二）蛋白质分子量及等电点测定：（二）蛋白质分子量及等电点测定：蛋白质分子量测定有多种方法，聚丙蛋白质分子量测定有多种方法，聚丙烯酰胺凝胶电泳法是最常用的方法之一。烯酰胺凝胶电泳法是最常用的方法之一。采用采用IEFIEF可测定蛋白质等电点。可测定蛋白质等电点。（三）蛋白质氨基酸组成及顺序分析（三）蛋白质氨基酸组成及顺序分析 1 1蛋白质氨基酸组成分析蛋白质氨基酸组成分析 首首先先将将蛋蛋白白质质水水解解为为氨氨基基酸酸，通通常常情情况况下下采采用用酸酸水水解解，蛋蛋白白质质水水解解后后的的氨氨基基酸酸混混合合物物可可通通过过全全自自动动氨氨基基酸酸分分析析仪仪或或高高效效液液相相色色谱谱进进行行测测定。定。2 2蛋白质氨基酸顺序分析蛋白质氨基酸顺序分析 主要是对纯化的蛋白质进行氨基主要是对纯化的蛋白质进行氨基酸组成分析，然后采用末端分析法酸组成分析，然后采用末端分析法测定其测定其N-N-端和端和C-C-端氨基酸，采用蛋端氨基酸，采用蛋白酶或化学法裂解成若干有重叠的白酶或化学法裂解成若干有重叠的肽段后采用肽段后采用EdmanEdman降解法测定每一肽降解法测定每一肽段的氨基酸顺序，再利用重叠肽组段的氨基酸顺序，再利用重叠肽组建整个多肽的氨基酸序列。最后确建整个多肽的氨基酸序列。最后确定二硫键的位置。定二硫键的位置。（四）蛋白质结晶与结构分析（四）蛋白质结晶与结构分析 蛋白质在一定条件下会形成结蛋白质在一定条件下会形成结构均一的构均一的晶体晶体，蛋白质结晶不仅是蛋，蛋白质结晶不仅是蛋白质纯度鉴定的一个指标，也是蛋白白质纯度鉴定的一个指标，也是蛋白质活性鉴定的一个指标。质活性鉴定的一个指标。蛋白质三维结构分析的主要方蛋白质三维结构分析的主要方法有法有X-X-射线晶体衍射法射线晶体衍射法和和核磁共振法核磁共振法 ，此外，此外，圆二色谱法圆二色谱法可以测定蛋白质可以测定蛋白质中不同二级结构的比例。例如，原核中不同二级结构的比例。例如，原核表达并纯化了豌豆肌动蛋白异型体表达并纯化了豌豆肌动蛋白异型体I I（376376个氨基酸），用圆二色谱仪法个氨基酸），用圆二色谱仪法测定了其圆二色谱如右图测定了其圆二色谱如右图豌豆肌动蛋白异型体豌豆肌动蛋白异型体I I圆二色谱圆二色谱 （五）蛋白质免疫印迹（五）蛋白质免疫印迹（五）蛋白质免疫印迹（五）蛋白质免疫印迹（Western-blottingWestern-blotting）鉴定）鉴定）鉴定）鉴定 蛋白质免疫印迹主要包括三蛋白质免疫印迹主要包括三个步骤：第一步是凝胶电泳；第个步骤：第一步是凝胶电泳；第二步是转膜，把凝胶上的蛋白质二步是转膜，把凝胶上的蛋白质条带转移固定到薄膜上；第三步条带转移固定到薄膜上；第三步是抗原抗体显色反应。是抗原抗体显色反应。蛋白质转膜方法主要有两种蛋白质转膜方法主要有两种类型，一种是半干转移，另外一类型，一种是半干转移，另外一种是湿转移，需要的转移缓冲液种是湿转移，需要的转移缓冲液多，湿转移应用较多。多，湿转移应用较多。蛋白质免疫印迹装置蛋白质免疫印迹装置上面为三明治结构侧面观，下面为三明治结构顶面观上面为三明治结构侧面观，下面为三明治结构顶面观 电转移结束后，取出硝酸纤电转移结束后，取出硝酸纤维素滤膜，进行抗原抗体显色反维素滤膜，进行抗原抗体显色反应。硝酸纤维素滤膜上的抗原抗应。硝酸纤维素滤膜上的抗原抗体反应原理如图体反应原理如图 ：蛋白质免疫印迹原理蛋白质免疫印迹原理1.1.转膜；转膜；2.2.封闭；封闭；3.3.一抗反应；一抗反应；4.4.二抗反应；二抗反应；5.5.显色显色（六）蛋白质生物活性及功能测定（六）蛋白质生物活性及功能测定 不同的蛋白质具有不同的生不同的蛋白质具有不同的生物学功能，因此有不同的测定方物学功能，因此有不同的测定方法。比如肌动蛋白，它具有聚合法。比如肌动蛋白，它具有聚合成丝的特性，可以通过聚合解聚成丝的特性，可以通过聚合解聚来判断其活性。来判断其活性。采用有机溶剂丙酮从鸡骨骼采用有机溶剂丙酮从鸡骨骼肌中提取肌动蛋白，制成肌动蛋肌中提取肌动蛋白，制成肌动蛋白丙酮粉，然后用超速离心法纯白丙酮粉，然后用超速离心法纯化肌动蛋白，纯化后的球状肌动化肌动蛋白，纯化后的球状肌动蛋白体外能够聚合成丝状肌动蛋蛋白体外能够聚合成丝状肌动蛋白，如图白，如图 ：鸡骨骼肌肌动蛋白丝鸡骨骼肌肌动蛋白丝