分子生物学第二章DNA结构与复制.ppt

2.2 DNA2.2 DNA的结构的结构核酸的结构及其功能核酸的结构及其功能 DNA-DNA-遗传的物质基础，基因是具有特定生遗传的物质基础，基因是具有特定生物功能的核苷酸序列，基因通过转录和翻译物功能的核苷酸序列，基因通过转录和翻译能够使亲代的性状准确地在子代表现出来。能够使亲代的性状准确地在子代表现出来。DNADNA的此种功能与其分子结构是密切相关。的此种功能与其分子结构是密切相关。2.2.1DNA的一级结构的一级结构1.DNA1.DNA的化学成分的化学成分2.DNA2.DNA和和RNARNA化学成分的比较化学成分的比较3.核苷酸的结构核苷酸的结构4.DNA的一级结构的一级结构（1 1）DNADNA一级结构的表示法一级结构的表示法（2）DNA碱基组成的碱基组成的Chargaff规则（规则（1949）（3）DNA和和RNA一级结构的比较一级结构的比较2.2.2DNA的二级结构的二级结构 DNA DNA DNA DNA的二级结构是指两条多核苷酸链反向平行的二级结构是指两条多核苷酸链反向平行的二级结构是指两条多核苷酸链反向平行的二级结构是指两条多核苷酸链反向平行盘绕所形成的双螺旋结构。盘绕所形成的双螺旋结构。盘绕所形成的双螺旋结构。盘绕所形成的双螺旋结构。在在在在DNADNA二级结构与二级结构与二级结构与二级结构与高级结构间或高级结高级结构间或高级结高级结构间或高级结高级结构间或高级结构的各种构象间存在构的各种构象间存在构的各种构象间存在构的各种构象间存在一个动力学平衡。一个动力学平衡。一个动力学平衡。一个动力学平衡。Z-DNAZ-DNA调控基因转录的两个模式调控基因转录的两个模式DNADNA的双螺旋结构的意义的双螺旋结构的意义 该该模模型型揭揭示示了了DNADNA作作为为遗遗传传物物质质的的稳稳定定性性特特征征，最最有有价价值值的的是是确确认认了了碱碱基基配配对对原原则则，这这是是DNADNA复复制制、转转录录和和反反转转录录的的分分子子基基础础，亦亦是是遗遗传传信信息息传传递递和和表表达达的的分子基础。分子基础。2.3DNA的复制的复制研究证明生命的遗传实际上是染色体研究证明生命的遗传实际上是染色体DNA自我复制的结自我复制的结果。而果。而DNA自我复制主要是通过半保留复制来实现的，是一自我复制主要是通过半保留复制来实现的，是一个以亲代个以亲代DNA分子为模板合成子代分子为模板合成子代DNA链的过程。即细胞分链的过程。即细胞分裂时，通过裂时，通过DNA自我复制将亲代细胞所含有遗传信息传递到自我复制将亲代细胞所含有遗传信息传递到子代细胞。子代细胞。双链双链DNA的复制包括的复制包括复制的起始复制的起始、延伸延伸和和终止终止三个阶段，三个阶段，并需要拓扑异构酶、解链酶、单链结合蛋白、引物合成酶、并需要拓扑异构酶、解链酶、单链结合蛋白、引物合成酶、DNA聚合酶及聚合酶及DNA连接酶等酶和蛋白质的参与。连接酶等酶和蛋白质的参与。2.3.1DNA2.3.1DNA的半保留复制的半保留复制的半保留复制的半保留复制 Watson和和Crick提出提出DNA双螺旋结构模型的同时对其复制双螺旋结构模型的同时对其复制过程进行了探讨。过程进行了探讨。DNA在复制过程中碱基间的氢键首先断开，每条链分别作在复制过程中碱基间的氢键首先断开，每条链分别作为模板合成新链，产生互补的两条链。为模板合成新链，产生互补的两条链。新合成新合成2条条DNA链的核苷酸序列和亲代链的核苷酸序列和亲代DNA链完全相同。链完全相同。因此，因此，每子代分子的一条链来自亲代每子代分子的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合，另一条链则是新合成的，成的，DNA这种复制方式叫做这种复制方式叫做DNA的半保留复制。的半保留复制。氯化铯密度梯度离心法：氯化铯密度梯度离心法：由于由于15N-DNA分子的密度比普通分子的密度比普通DNA的密度大，在氯化铯密的密度大，在氯化铯密度梯度离心时，这两种度梯度离心时，这两种DNA分子形成位置不同的区带。分子形成位置不同的区带。结果证实：结果证实：无论原核还是真核生物无论原核还是真核生物DNADNA都是以半保留复制方式遗传的都是以半保留复制方式遗传的2.3.22.3.2复制的起点、方向和速度复制的起点、方向和速度复制的起点、方向和速度复制的起点、方向和速度DNA复制时，双链复制时，双链DNA要解开成两股链分别进行，所以，要解开成两股链分别进行，所以，这个复制起始点呈现叉子的形式，被称为复制叉。这个复制起始点呈现叉子的形式，被称为复制叉。DNA的复的复制是由固定的起始位点开始的。制是由固定的起始位点开始的。复复制制子子是生物体是生物体DNA复制的基本单位，一个复制子只含复制的基本单位，一个复制子只含一个复制起始位点。一个复制起始位点。复制叉复制叉从复制起点开始沿着从复制起点开始沿着DNA链连续移动，起始点可以链连续移动，起始点可以启动单向复制或者双向复制，这主要取决于在复制起点形成一启动单向复制或者双向复制，这主要取决于在复制起点形成一个还是两个复制叉。个还是两个复制叉。复制起始点的特点复制起始点的特点复制起始点的特点复制起始点的特点1.富含富含AT：测定细菌、酵母、线粒体和叶绿体：测定细菌、酵母、线粒体和叶绿体DNA中的复中的复制起始点核苷酸序列，发现复制起始点富含制起始点核苷酸序列，发现复制起始点富含AT序列，它可能序列，它可能有利于有利于DNA复制启动时双链的解开。复制启动时双链的解开。2.细菌、病毒和线粒体细菌、病毒和线粒体DNA分子只有一个复制起始点，即分子只有一个复制起始点，即只有一个复制子。只有一个复制子。3.真生物基因组真生物基因组DNA有多个复制起点，可以同时在多个复有多个复制起点，可以同时在多个复制起点上进行双向复制，其大小为制起点上进行双向复制，其大小为40-100kb/个。个。复制叉移动方向复制叉移动方向复制叉移动方向复制叉移动方向放射性自显影法：对于大基因组内的放射性自显影法：对于大基因组内的不确定区域，两次连续的放射脉冲可以不确定区域，两次连续的放射脉冲可以用来标记复制的移动。如果一个脉冲比用来标记复制的移动。如果一个脉冲比另一个脉冲强，我们可以用相对的标记另一个脉冲强，我们可以用相对的标记强度来区分，这些可用放射自显影观察。强度来区分，这些可用放射自显影观察。单向复制：单向复制：在复制眼的一端，一种类型在复制眼的一端，一种类型的标记后紧跟着另一种标记；的标记后紧跟着另一种标记；双向复制：双向复制：在复制眼的两端产生一种在复制眼的两端产生一种（对称的）模式。在真核生物中普遍存（对称的）模式。在真核生物中普遍存在。在。DNADNADNADNA链复制过程示意图链复制过程示意图链复制过程示意图链复制过程示意图2.2.3DNA复制的几种主要方式复制的几种主要方式生生物物体体内内DNA双双链链的的复复制制大大都都是是以以半半保保留留方方式式进进行行的的；但但是是不不同同生生物物DNA分分子子存存在在形形式式各各不不相相同同，如如大大小小、线线性性分分子子、环环状状分分子子、功功能能差差异异，因因而而反反映映在在复复制制方方式式上上的的差差异异。绝绝大大多多数数DNA复复制制是是以以复复制叉的形式进行的。制叉的形式进行的。线性线性DNA双链的复制双链的复制研究表明研究表明DNA聚合酶还是聚合酶还是RNA聚合聚合酶都只从聚合聚合酶都只从5端向端向3端移动；体内端移动；体内DNA复制时，由一段复制时，由一段RNA引物起始引物起始DNA合成，合成，起始后起始后RNA引物被切除，使子链短于母链。切除后的引物被切除，使子链短于母链。切除后的5端缺端缺口如何合成？这就提出了线性口如何合成？这就提出了线性DNA末端复制的问题。末端复制的问题。寿命缩短？寿命缩短？线性线性DNA末端复制的特殊机制末端复制的特殊机制（1）线性复制子转变为环状或多聚分子：）线性复制子转变为环状或多聚分子：T4噬菌体噬菌体DNA通过通过其末端的简并性使不同链的其末端的简并性使不同链的3端因互补而结合。端因互补而结合。DNA聚合酶作聚合酶作用填满其缺口，再经用填满其缺口，再经DNA连接酶作用生成二联体。连接酶作用生成二联体。（2）DNA末端形成发夹式结构，是该分子没有游离的末端。末端形成发夹式结构，是该分子没有游离的末端。如草履虫线粒体如草履虫线粒体DNA。（3 3）某种蛋白启动复制）某种蛋白启动复制）某种蛋白启动复制）某种蛋白启动复制腺病毒腺病毒腺病毒腺病毒DNADNA分别在分子两端分别在分子两端分别在分子两端分别在分子两端启动复制，并通过链取代法使之启动复制，并通过链取代法使之启动复制，并通过链取代法使之启动复制，并通过链取代法使之延伸。延伸。延伸。延伸。末端蛋白的作用下，在真正的末端蛋白的作用下，在真正的末端蛋白的作用下，在真正的末端蛋白的作用下，在真正的末端上启动复制。末端上启动复制。末端上启动复制。末端上启动复制。（1）-复制复制（2）滚环复制滚环复制（3）D-环复制环复制2.2.环状环状DNADNA的复制的复制（1）-复制复制E.coli基基因因组组的的复复制制原原点点位位于于天天冬冬酰酰胺胺合合酶酶和和ATP合合酶酶操操纵纵子子之之间间，全全长长=45bp，称称为为oriC。OriC富富含含AT，并并含含有有多多个个短短的的重重复复序序列列，能能够够被被复复制制起起始始点点结结合合蛋蛋白白所所识识别别。复复制制的的起起始始：涉涉及及DNA双双链链的的解解旋旋和和松松开开，形形成成两两个个方方向向相相反反的的复复制制叉叉。前前导导链链还还是是复复制制前前，复复制制原原点点的的核核酸酸序列被转录生成短的序列被转录生成短的RNA链，作为起始链，作为起始DNA复制的引物。复制的引物。（2）滚环复制（）滚环复制（replicationbyrollingcyclesstructure）这这是是单单向向复复制制的的一一种种特特殊殊形形式式。X174噬噬菌菌体体由由一一个个单单链链环环状状DNA组组成成，这这条条链链称称为为正正（+）链链；合合成成的的互互补补链链称称为为负负（-）链。双链体的复制以滚环复制方式进行。）链。双链体的复制以滚环复制方式进行。(3)D-环型（环型（D-loop）：）：这也是一种单向复制的特殊方式。这种方式首先在动物线粒体这也是一种单向复制的特殊方式。这种方式首先在动物线粒体DNA的的复制中被发现。双链环在固定点解开进行复制。但两条链的合成是高度复制中被发现。双链环在固定点解开进行复制。但两条链的合成是高度不对称的，一条链上迅速合成出互补链，另一条链则成为游离的单链环不对称的，一条链上迅速合成出互补链，另一条链则成为游离的单链环（即（即D-环）。环）。2.4DNA2.4DNA复制的特点复制的特点复制的特点复制的特点2.4.12.4.1原核生物原核生物原核生物原核生物E.coliE.coli DNADNA复制的特点复制的特点复制的特点复制的特点基因组基因组DNA是双链环状；复制起始区位于其遗传图的是双链环状；复制起始区位于其遗传图的84min附近；附近；OriC含有含有3个个13bp和和4个个9bp的两个保守序列。复制起始后形成的两个复制叉沿着的两个保守序列。复制起始后形成的两个复制叉沿着整个基因组双向等速移动，整个基因组双向等速移动，DNA复制中间产物呈一个复制中间产物呈一个。1.DNA1.DNA双螺旋的解旋双螺旋的解旋双螺旋的解旋双螺旋的解旋研究证实多种蛋白质及酶参与研究证实多种蛋白质及酶参与DNA双链的解开过程。如拓双链的解开过程。如拓扑异构酶扑异构酶I、DNA解链酶及解链酶及SSB蛋白等。蛋白等。（1 1）DNADNA解链酶解链酶解链酶解链酶DNAhelicase是经水解是经水解ATP获得能量来解开双链获得能量来解开双链DNA，大大部分部分DNAhelicase沿着随后链模板沿着随后链模板53方向及沿着复制叉的方向及沿着复制叉的前进而移动。前进而移动。研究证明：研究证明：Rep蛋白和特定的蛋白和特定的DNA解链酶分别在解链酶分别在DNA两条链两条链上协调作用，以解开双链上协调作用，以解开双链DNA。（2 2）单链结合蛋白）单链结合蛋白）单链结合蛋白）单链结合蛋白(SSB(SSB蛋白）蛋白）蛋白）蛋白）发现噬菌体发现噬菌体T4的的基因基因32蛋白蛋白可以在远低于解链温度时使可以在远低于解链温度时使双链双链DNA分开，并牢牢地结合在单链分开，并牢牢地结合在单链DNA上，后来发现许多上，后来发现许多生物中都有这类蛋白。生物中都有这类蛋白。原核生物：原核生物：SSB蛋白与蛋白与DNA结合时还表现协同效应，如第结合时还表现协同效应，如第1个个SSB蛋白结合蛋白结合DNA的能力为的能力为1，第，第2个个SSB蛋白的结合力可蛋白的结合力可达达103。真核生物。真核生物SSB蛋白与单链蛋白与单链DNA结合时，不表现协同效结合时，不表现协同效应。应。SSB蛋白蛋白:保证被解链酶解开的保证被解链酶解开的ssDNA在复制完成之前能在复制完成之前能保持单链结构，保持单链结构，SSB蛋白以四聚体形式存在于复制叉处，他蛋白以四聚体形式存在于复制叉处，他没有解链作用。没有解链作用。（3 3）DNADNA拓扑异构酶（拓扑异构酶（拓扑异构酶（拓扑异构酶（DNAtopoisomeraseDNAtopoisomerase）DNA复制过程中，随着复制过程中，随着DNA解旋，双螺旋的盘绕数解旋，双螺旋的盘绕数T减减少，而超螺旋数少，而超螺旋数W增加，使正超螺旋增加，未解链部分的缠增加，使正超螺旋增加，未解链部分的缠绕更加紧密，形成的压力使解链不能继续进行。绕更加紧密，形成的压力使解链不能继续进行。DNA拓扑异构酶作用拓扑异构酶作用它能够消除解链造成的正超螺旋堆积，消除阻碍解链继它能够消除解链造成的正超螺旋堆积，消除阻碍解链继续进行的此种压力，使续进行的此种压力，使DNA复制得以延伸。复制得以延伸。2.DNA2.DNA复制的引发复制的引发复制的引发复制的引发研究发现：研究发现：所有所有DNA复制是由一个固定的起始位点开始；复制是由一个固定的起始位点开始；DNA聚合酶都只能延长已存在的聚合酶都只能延长已存在的DNA链，而不能从头链，而不能从头合成合成DNA链。链。问题：一个新链问题：一个新链DNA的复制怎样开始的呢？的复制怎样开始的呢？研研研研究究究究发发发发现现现现：所所有有DNA聚聚合合酶酶都都从从脱脱氧氧核核苷苷酸酸3-OH端端起起始始DNA合合成成，所所以以，DNA复复制制时时，由由引引发发酶酶(特特殊殊RNA聚聚合合酶酶)在在DNA模模板板上上合合成成一一段段RNA链链，它它提提供供引引发发末末端端（引引物物），接接着着由由DNA聚聚合合酶酶从从RNA引引物物的的3-OH端端开开始始合合成成新新的的DNA链链。无无论论前前导导链链还是后随链开始还是后随链开始DNA合成时，都需要合成时，都需要RNA引物。引物。参与参与参与参与DNADNA复制的蛋白质：复制的蛋白质：复制的蛋白质：复制的蛋白质：后随链的引发由引发体来完成。引发体由后随链的引发由引发体来完成。引发体由后随链的引发由引发体来完成。引发体由后随链的引发由引发体来完成。引发体由n n，n n，n n，DnaBDnaB、C C和和和和I I等等等等6 6种蛋白质共同组成。种蛋白质共同组成。种蛋白质共同组成。种蛋白质共同组成。DnaADnaA：结合：结合：结合：结合OriOri区，具区，具区，具区，具ATPATP酶活性，促进酶活性，促进酶活性，促进酶活性，促进DnaBDnaB形成起始复合物形成起始复合物形成起始复合物形成起始复合物DnaBDnaB：DNADNA解链酶，有解旋和解链作用解链酶，有解旋和解链作用解链酶，有解旋和解链作用解链酶，有解旋和解链作用DnaCDnaC：形成起始复合物，运输：形成起始复合物，运输：形成起始复合物，运输：形成起始复合物，运输DnaBDnaBDnaGDnaG：DNADNA引发酶由引发酶由引发酶由引发酶由dnaGdnaG基因编码，在特定环境下发挥作用基因编码，在特定环境下发挥作用基因编码，在特定环境下发挥作用基因编码，在特定环境下发挥作用 的的的的RNARNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶HuHu：促进起始复合物形成促进起始复合物形成促进起始复合物形成促进起始复合物形成回旋酶：松驰正超螺旋，促进单链回旋酶：松驰正超螺旋，促进单链回旋酶：松驰正超螺旋，促进单链回旋酶：松驰正超螺旋，促进单链DANDAN产生产生产生产生SSBSSB：促进促进促进促进DNADNA解链，稳定单链解链，稳定单链解链，稳定单链解链，稳定单链DNADNA性性3.3.冈崎片段与半不连续复制冈崎片段与半不连续复制冈崎片段与半不连续复制冈崎片段与半不连续复制dsDNA两条链是反向平行的，因此在复制叉附近的两条链是反向平行的，因此在复制叉附近的DNA链一条是链一条是53，另一条是，另一条是35，即两条模板极性不同。，即两条模板极性不同。而而DNA聚合酶：聚合酶：DNA合成方向是合成方向是53，而不是，而不是35。无法解释无法解释DNA两条链是如何能够同时进行复制？两条链是如何能够同时进行复制？日本科学家日本科学家Okazaki通过含通过含3H-dTTP培养基培养大肠菌标培养基培养大肠菌标记其记其DNA，提出，提出DNA的半不连续复制模型。的半不连续复制模型。原核生物冈崎片段原核生物冈崎片段真核生物冈崎片段真核生物冈崎片段Okazakifragment：10002000b。冈崎片段与冈崎片段与DNA的半不连续复制模型的半不连续复制模型前导链连续复制，而后随链不连续复制。前导链连续复制，而后随链不连续复制。4.4.复制的终止复制的终止复制的终止复制的终止Tus蛋白参与蛋白参与DNA复制的终止，而不需要太多蛋白质的参复制的终止，而不需要太多蛋白质的参与。终止子序列由与。终止子序列由22个碱基的重复序列的个碱基的重复序列的Ter组成。当复制叉组成。当复制叉迁移到迁移到Ter时，时，Ter-Tus复合物能使复合物能使DnaB不能再将不能再将DNA解链，解链，阻挡复制叉的继续迁移，而为复制的阻挡复制叉的继续迁移，而为复制的50-100bp经修复方式填补。经修复方式填补。拓扑异构酶拓扑异构酶IV的作用下使复制叉解体，释放子链的作用下使复制叉解体，释放子链DNA。5.DNA聚合酶聚合酶(1)大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶的种类及其功能聚合酶的种类及其功能Klenow片段片段:ThisenzymeispurifiedfromE.colicellsinwhichthe3-endtwo-thirdsoftheE.coliDNApolymeraseIgeneiscloned.Thus,ithas35exonucleaseactivity,butnot53exonucleaseactivity.68kD35kDDNA聚合酶聚合酶其有其有53聚合酶活性，但活性低，其酶活性是聚合酶活性，但活性低，其酶活性是DNA聚合聚合酶酶的的5%。通过其通过其3 5核酸外切酶活性可起校正作用。核酸外切酶活性可起校正作用。DNA聚合酶聚合酶其有其有53聚合酶活性，聚合酶活性，3 5核酸外切酶活性。该酶活核酸外切酶活性。该酶活性为性为DNA聚合酶聚合酶的的15倍，倍，DNA聚合酶聚合酶的的300倍。倍。即即5万个核苷酸万个核苷酸/min速度合成新速度合成新DNA链。链。其他其他DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶和和分别由分别由dinB和和umuD 2C基因编码，主要基因编码，主要在在SOS修复过程中发挥作用。修复过程中发挥作用。2.4.2真核生物真核生物DNA复制的特点复制的特点（1）DNA分子上出现多复制起始位点；分子上出现多复制起始位点；（2）真核生物染色体在全部完成复制前，各个起始点上）真核生物染色体在全部完成复制前，各个起始点上DNA复制不能再开始；复制不能再开始；（3）真核生物）真核生物DNA复制只在其细胞周期复制只在其细胞周期S期进行；期进行；（4）真核生物复制子大小约为）真核生物复制子大小约为40100kb。真核生物真核生物DNA复合起始区特点：复合起始区特点：酵酵母母复复制制起起始始区区长长度度约约为为150bp，包包括括数数个个复复制制起起始始必必须须的的保保守守区区，将将克克隆隆该该DNA片片段段构构建建环环状状DNA分分子子，它它在在酵酵母母中自主复制的。中自主复制的。酵酵母母复复制制起起始始位位点点成成为为自自主主复复制制序序列列(autonomouslyreplicatingsequences,ARS）。不不同同ARS共共同同特特征征是是具具有有一一个个11个个A-T碱基对的保守序列。碱基对的保守序列。ORC（originrecognitioncomplex）识识别别并并结结合合ARS序序列列，ORC有有6种蛋白组成的起动复合物。种蛋白组成的起动复合物。人人类类基基因因组组DNA上上每每隔隔30000300000bp序序列列有有一一个个复复制制起起始始位位点点。真真核核生生物物DNA复复制制叉叉的的移移动动速速度度为为50bp/sec，E.coli的的1/20。真核生物真核生物DNA聚合酶聚合酶哺乳动物主要有哺乳动物主要有5种种DNA聚合酶，其特性见表聚合酶，其特性见表2-12.2.4.3DNA复制的调控复制的调控1.1.大肠杆菌基因组大肠杆菌基因组大肠杆菌基因组大肠杆菌基因组DNADNA的复制调控的复制调控的复制调控的复制调控v原核细胞的生长和增殖速度取决于培养条件，但在生长增殖速原核细胞的生长和增殖速度取决于培养条件，但在生长增殖速度不同的细胞中度不同的细胞中DNA链延伸的速度几乎是恒定的，只是复制链延伸的速度几乎是恒定的，只是复制叉的数量不同。叉的数量不同。v细胞内复制叉的多少决定了复制起始频率的高低，这可能是原细胞内复制叉的多少决定了复制起始频率的高低，这可能是原核细胞复制的调控机制。复制起始频率的核细胞复制的调控机制。复制起始频率的直接调控因子是蛋直接调控因子是蛋白质和白质和RNA。v大肠杆菌染色体大肠杆菌染色体DNA复制调控复制调控染色体的复制与细胞分裂一般是同步的，但复制与细胞分裂染色体的复制与细胞分裂一般是同步的，但复制与细胞分裂不直接耦联。复制起始不依赖于细胞分裂，而复制的终止则不直接耦联。复制起始不依赖于细胞分裂，而复制的终止则能引发细胞分裂。能引发细胞分裂。v复制子与转录的操纵子相似，由起始物位点和复制起点两部复制子与转录的操纵子相似，由起始物位点和复制起点两部分组成。起始物位点编码复制调节蛋白质，复制起点与调节分组成。起始物位点编码复制调节蛋白质，复制起点与调节蛋白质相互作用并启动复制。起始物位点突变使复制停止并蛋白质相互作用并启动复制。起始物位点突变使复制停止并导致细胞死亡。导致细胞死亡。v大肠杆菌的复制起点有大肠杆菌的复制起点有OriC和和OriH两种，其中两种，其中OriC是首选是首选的复制起点，而的复制起点，而OriH是在是在RNaseH缺失突变株中发现的一系缺失突变株中发现的一系列复制起点。列复制起点。调控主要表现在复制的起始水平上调控主要表现在复制的起始水平上E.coli 细胞分裂周期细胞分裂周期依营养条件变化依营养条件变化 DNA复制周期基本保持复制周期基本保持30-40min/cycle 37葡萄糖（葡萄糖（C源）源）45min/cellcycle琥珀酸（琥珀酸（C源）源）70min/cellcycleCstarved10hrs/cellcycle Csuffice21min/cellcycle ButDNAreplication40minmoreorlessbyprematureinitiation 2 2、ColE1ColE1质粒质粒质粒质粒DNADNA复制调控复制调控复制调控复制调控ColE1质粒：质粒：6646bp的小质粒的小质粒拷拷贝贝数：数：2030/cellColE1质粒：不依赖于其本身编码的蛋白质，而完全依靠宿质粒：不依赖于其本身编码的蛋白质，而完全依靠宿主主DNA聚合酶聚合酶I质粒编码：两个负调控因子质粒编码：两个负调控因子Rop蛋白和反义蛋白和反义RNA（RNA1），），Rop蛋白和蛋白和RNA1控制控制DNA合成所需的引物。合成所需的引物。RNA1通过与引物通过与引物RNA前体互补作用，阻止前体互补作用，阻止RNaseH加工引物前体，加工引物前体，使其不能转化为有活性的引物，而对使其不能转化为有活性的引物，而对DNA复制起负调控作用。复制起负调控作用。Rop蛋白能提高蛋白能提高RNA1与引物前体的互补，增强了与引物前体的互补，增强了RNA1的负调控的负调控作用。作用。primer（555nts）3.3.真核细胞真核细胞真核细胞真核细胞DNADNA的复制调控的复制调控的复制调控的复制调控v真核细胞的生活周期包括真核细胞的生活周期包括G1、S、G2和和M等等4个期。个期。vG1:复复制制预预备备期期，S:复复制制期期，G2:有有丝丝分分裂裂准准备备期期，M:有有丝丝分分裂期。裂期。vDNA复制只发生在复制只发生在S期。期。v真核生物真核生物DNA复制有复制有3个水平的调控：个水平的调控：(1)细胞生活周期水平调控细胞生活周期水平调控决定细胞停留在决定细胞停留在G1期还是进入期还是进入S期。许多外部因素和细胞因期。许多外部因素和细胞因子参与限制调控。子参与限制调控。如促细胞分裂剂、致癌剂、外科切除等都可以诱导细胞由如促细胞分裂剂、致癌剂、外科切除等都可以诱导细胞由G1期进入期进入S期。期。(2)染色体水平调控染色体水平调控决定不同染色体或同一染色体不同部位的复制子按一决定不同染色体或同一染色体不同部位的复制子按一定顺序在定顺序在S期起始复制，这种有序复制机制还不清楚？期起始复制，这种有序复制机制还不清楚？（3）复制子水平调控）复制子水平调控决定复制的起始与否。这种调控从单细胞生物到高等决定复制的起始与否。这种调控从单细胞生物到高等生物是高度保守的。生物是高度保守的。此外，真核生物复制起始还包括转录活化、复制起始此外，真核生物复制起始还包括转录活化、复制起始复合物的合成和引物合成等阶段。许多参与复制起始蛋白复合物的合成和引物合成等阶段。许多参与复制起始蛋白的功能与原核生物中相类似的功能与原核生物中相类似2.5DNA的修复的修复一一个个物物种种能能够够一一代代一一代代地地遗遗传传下下去去，是是因因为为DNA能能够够稳稳定定复复制制。如如果果DNA不不能能稳稳定定地地复复制制，那那么么，物物种种就就不不存存在在了了。但但，在在进进化化过过程程中中，受受到到各各种种因因素素的的影影响响，导导致致DNA复复制制的的差差错错或或碱基突变，使生物具有多样性。碱基突变，使生物具有多样性。DNA复复制制过过程程中中，发发生生的的差差错错，可可以以引引起起突突变变。同同时时，还还会会受受到到一一些些化化学学反反应应、物物理理反反应应、生生物物反反应应造造成成DNA分分子子损损伤伤，引起引起DNA突变。突变。DNADNA突变的主要因素突变的主要因素突变的主要因素突变的主要因素碱基脱落碱基脱落碱基脱落碱基脱落:形成形成形成形成APAP位点；碱基的改变位点；碱基的改变位点；碱基的改变位点；碱基的改变;电离辐射等物理因素；电离辐射等物理因素；电离辐射等物理因素；电离辐射等物理因素；硫酸二甲酯、甲烷磺酸甲酯等化学因素；：硫酸二甲酯、甲烷磺酸甲酯等化学因素；：硫酸二甲酯、甲烷磺酸甲酯等化学因素；：硫酸二甲酯、甲烷磺酸甲酯等化学因素；：DNADNA病毒和病毒和病毒和病毒和RNARNA病病病病毒感染、质粒转移、基因重组、转座子的转位等生物因素均能毒感染、质粒转移、基因重组、转座子的转位等生物因素均能毒感染、质粒转移、基因重组、转座子的转位等生物因素均能毒感染、质粒转移、基因重组、转座子的转位等生物因素均能使使使使DNADNA发生突变。发生突变。发生突变。发生突变。1.错配修复错配修复经错配修复系统识别新合成链中的错配并加以校正。经错配修复系统识别新合成链中的错配并加以校正。（1）发现碱基错配）发现碱基错配;（2）在水解）在水解ATP作用下作用下,MutS、MutL与碱基错配位点与碱基错配位点的的DNA双链结合；（双链结合；（3）MutS-MutL在在DNA双链上移动，发现甲基化双链上移动，发现甲基化DNA后由后由MutH切开非甲基化的子链。切开非甲基化的子链。2.2.切除修复切除修复切除修复切除修复（1 1）碱基切除修复）碱基切除修复）碱基切除修复）碱基切除修复研究发现，所有细胞中都有不同类型研究发现，所有细胞中都有不同类型的能识别受损伤核苷酸位点的的能识别受损伤核苷酸位点的糖苷水解酶糖苷水解酶，它能特异性切除受损核苷酸上的它能特异性切除受损核苷酸上的N-糖苷糖苷键键，在，在DNA上形成去嘌呤或去嘧啶位点，上形成去嘌呤或去嘧啶位点，成为成为AP位点。位点。DNA糖苷水解酶具有特异性，如尿嘧糖苷水解酶具有特异性，如尿嘧啶核苷水解酶能特意性识别啶核苷水解酶能特意性识别DNA链中胞嘧链中胞嘧啶自发脱氨形成的尿嘧啶。啶自发脱氨形成的尿嘧啶。AP核酸内切酶能切开损伤核苷酸的糖核酸内切酶能切开损伤核苷酸的糖苷苷-磷酸键，移去包括磷酸键，移去包括AP位点核苷酸在内位点核苷酸在内的的DNA小片段，小片段，DNApolyI合成新的片段，合成新的片段，DNA连接酶连接。连接酶连接。脱氨基反应脱氨基反应脱氨基反脱氨基反应应（2 2 2 2）核苷酸切除修复）核苷酸切除修复）核苷酸切除修复）核苷酸切除修复DNA切割酶切割酶3.3.重组修复或复制后修复重组修复或复制后修复重组修复或复制后修复重组修复或复制后修复机体细胞对在复制起始时尚未修复的机体细胞对在复制起始时尚未修复的DNA损伤部位可以先复损伤部位可以先复制再修复，即先跳过该损伤部位，在新合成链中留下一个对应制再修复，即先跳过该损伤部位，在新合成链中留下一个对应于损伤序列的缺口。于损伤序列的缺口。4.DNA4.DNA的直接修复的直接修复的直接修复的直接修复将损伤的碱基回复到原状态的将损伤的碱基回复到原状态的一种修复系统。一种修复系统。DNA光解酶光解酶将在紫外线照射形将在紫外线照射形成的环丁烷胸腺嘧啶二体及成的环丁烷胸腺嘧啶二体及6-4光化物还原成为单体的过程。光化物还原成为单体的过程。O6-甲基转移酶甲基转移酶从从O6-甲基鸟嘌甲基鸟嘌呤核苷酸中移去甲基，以防止形呤核苷酸中移去甲基，以防止形成成G-T的配对。的配对。5.SOS5.SOS修复修复修复修复SOSSOS反应是国际上通用的反应是国际上通用的反应是国际上通用的反应是国际上通用的紧急呼救信号紧急呼救信号紧急呼救信号紧急呼救信号。SOSSOS修复是指修复是指修复是指修复是指DNADNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种DNADNA修复方修复方修复方修复方式，修复结果只是能维持基因组的完整性式，修复结果只是能维持基因组的完整性式，修复结果只是能维持基因组的完整性式，修复结果只是能维持基因组的完整性。SOSSOS修复是在修复是在修复是在修复是在DNADNA分子受到重大损伤时诱导产生的一种应急分子受到重大损伤时诱导产生的一种应急分子受到重大损伤时诱导产生的一种应急分子受到重大损伤时诱导产生的一种应急反应，它使细胞内源修复酶合成量增加，甚至产生新的修复酶反应，它使细胞内源修复酶合成量增加，甚至产生新的修复酶反应，它使细胞内源修复酶合成量增加，甚至产生新的修复酶反应，它使细胞内源修复酶合成量增加，甚至产生新的修复酶来修复损伤的来修复损伤的来修复损伤的来修复损伤的DNADNA。LexALexA蛋白是一种阻遏蛋白，在正常情况下，阻遏蛋白是一种阻遏蛋白，在正常情况下，阻遏蛋白是一种阻遏蛋白，在正常情况下，阻遏蛋白是一种阻遏蛋白，在正常情况下，阻遏SOSSOS系统系统系统系统各种基因的大量表达。各种基因的大量表达。各种基因的大量表达。各种基因的大量表达。在正常情况下，在正常情况下，在正常情况下，在正常情况下，umuCumuC和和和和umuDumuD基因被基因被基因被基因被LexALexA阻遏。当阻遏。当阻遏。当阻遏。当DNADNA受损时，受损时，受损时，受损时，LexALexA子体切割后，解除阻遏作用。子体切割后，解除阻遏作用。子体切割后，解除阻遏作用。子体切割后，解除阻遏作用。umuCumuC和和和和umuDumuD基因表达。基因表达。基因表达。基因表达。当当当当RecARecA结合并促进结合并促进结合并促进结合并促进LexALexA自体切割时，也促进自体切割时，也促进自体切割时，也促进自体切割时，也促进umuDumuD的子体切割，称为的子体切割，称为的子体切割，称为的子体切割，称为umuDumuD子切体。随后，子切体。随后，子切体。随后，子切体。随后，umuCumuC和和和和umuDumuD蛋白帮助蛋白帮助蛋白帮助蛋白帮助DNApolDNApol跨过损伤而完跨过损伤而完跨过损伤而完跨过损伤而完成染色体成染色体成染色体成染色体DNADNA的复制和细胞分裂。的复制和细胞分裂。的复制和细胞分裂。的复制和细胞分裂。