NK细胞杀伤活性检测-2013-7-5兼.ppt
NK细胞杀伤活性检测细胞杀伤活性检测 -乳酸脱氢酶释放法乳酸脱氢酶释放法石河子大学医学院免疫学教研室石河子大学医学院免疫学教研室2013-7-5目的要求目的要求n熟悉乳酸脱氢酶释放法测定熟悉乳酸脱氢酶释放法测定NK细胞杀伤细胞杀伤活性的检测方法。活性的检测方法。【原理】乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 (LDH)(LDH)是活细胞胞浆内含酶之一。是活细胞胞浆内含酶之一。正常情况下，正常情况下，LDHLDH不能透过细胞膜。当靶细胞受到效不能透过细胞膜。当靶细胞受到效应细胞的攻击而损伤时，细胞膜通透性改变，应细胞的攻击而损伤时，细胞膜通透性改变，LDHLDH可可释放至介质中。释放出来的释放至介质中。释放出来的LDHLDH在催化乳酸生成丙酮在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，使酸的过程中，使氧化型辅酶氧化型辅酶(NAD+)(NAD+)变成变成还原型辅还原型辅酶酶(NADH2)(NADH2)。后者再通过递氢体。后者再通过递氢体-吩嗪二甲酯硫酸吩嗪二甲酯硫酸盐盐 (PMS)(PMS)还原硝基氯化四氮唑蓝还原硝基氯化四氮唑蓝(NBT)(NBT)，形成，形成有色有色的甲臢类化合物，在的甲臢类化合物，在490nm490nm或或570nm570nm波长处有一高吸波长处有一高吸收峰。利用读取的收峰。利用读取的A A值，经过计算即可得知值，经过计算即可得知NKNK细胞杀细胞杀伤靶细胞的活性。伤靶细胞的活性。实验原理实验原理 效应细胞效应细胞 靶细胞靶细胞 释放释放LDH 丙酮酸丙酮酸乳酸乳酸乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶(LDH)NAD+NADH+H+PMSNBT 甲甲甲甲臢臢臢臢(OD570nm(OD570nm）吩嗪二甲酯硫酸盐吩嗪二甲酯硫酸盐硝基氯化四氮唑蓝硝基氯化四氮唑蓝【试剂】n1.靶细胞靶细胞 检测人的检测人的NK 细胞活性常用的靶细胞为体细胞活性常用的靶细胞为体 外传代细胞株外传代细胞株K562。n2.效应细胞效应细胞 从人外周血（肝素抗凝）分离的单个核从人外周血（肝素抗凝）分离的单个核 细胞。细胞。n3.1640 培养液培养液n4.LDH 底物溶液（临用前配制）底物溶液（临用前配制）NBT 硝基氯化四氮唑蓝硝基氯化四氮唑蓝 4mg NAD+I 氧化型辅酶氧化型辅酶I 10mg PMS 吩嗪二甲酯硫酸盐吩嗪二甲酯硫酸盐 1mg【试剂】加蒸馏水加蒸馏水2ml 溶解，混匀后取上清液溶解，混匀后取上清液1.6ml，加，加1mol/L 乳酸钠乳酸钠0.4ml，然后加入，然后加入0.1mol/L pH7.4 PBS 至至10ml。n5.1%NP40：取取1ml NP-40 加去离子水加去离子水99ml。n6.1mol/L 柠檬酸终止液柠檬酸终止液 取柠檬酸取柠檬酸21g 加去离子水加去离子水100ml实验步骤实验步骤效应细胞的制备（分离外周血单个核细胞）效应细胞的制备（分离外周血单个核细胞）靶细胞的制备靶细胞的制备效效-靶细胞相互作用靶细胞相互作用酶促反应酶促反应结果判读结果判读 取培养取培养2448hr的靶细胞的靶细胞(K562),洗涤洗涤3次（次（1000rpm10min）,最后用最后用完全完全RPMI-1640培养液调整细胞浓度培养液调整细胞浓度至至1105/ml,备用。备用。靶细胞的制备：靶细胞的制备：效应细胞的制备效应细胞的制备（分离外周血单个核细胞）（分离外周血单个核细胞）采集静脉血采集静脉血4 ml，加，加0.2ml肝素溶液（肝素溶液（125-250U/ml）抗凝）抗凝分别吸取分别吸取2ml淋巴细胞分层液置淋巴细胞分层液置10ml离心管中，离心管中，将管倾斜将管倾斜45，沿管壁缓缓注入抗凝血，沿管壁缓缓注入抗凝血离心离心2000rpm20min密度梯度离心分离淋巴细胞亚群密度梯度离心分离淋巴细胞亚群用完全用完全RPMI-1640定容细胞，计数后调整细胞浓度定容细胞，计数后调整细胞浓度（加入（加入0.2ml完全完全RPMI-1640，混匀，混匀，1x 107）将所得将所得PBMC用用5倍体积的倍体积的1640洗涤一次洗涤一次2000rpm10 min用毛细吸管轻轻吸去上层的血浆、稀释液及血小板，用毛细吸管轻轻吸去上层的血浆、稀释液及血小板，再用另一支毛细吸管仔细吸取单个核细胞（灰白色层）再用另一支毛细吸管仔细吸取单个核细胞（灰白色层）计数计数PBMCPBMC1.1.计数计数4 4个大方格中（即个大方格中（即6464个小方格）所有细胞个小方格）所有细胞数数2.2.计数原则：数上不数下，数左不数右。计数原则：数上不数下，数左不数右。3.3.总数除以总数除以4 4，所得数据，所得数据10104 4即为即为1ml1ml液体中的液体中的细胞总数细胞总数4.4.每每mlml健康成人血可分离出健康成人血可分离出1 110106 62 210106 6个个单个核细胞单个核细胞 计数计数PBMCPBMC举例举例n数数4 4个大方格细胞数分别为：个大方格细胞数分别为：8787，7979，9191，8585n总数为：总数为：87+79+91+85=34287+79+91+85=342n一个大方格的平均数为：一个大方格的平均数为：342/4=85.5342/4=85.5n1ml1ml液体中细胞量为：液体中细胞量为：85.585.510104 4n如果用染液稀释后计数，则细胞数为该数据如果用染液稀释后计数，则细胞数为该数据的的2 2倍。倍。效效-靶细胞作用靶细胞作用 将效应细胞和靶细胞各将效应细胞和靶细胞各0.1ml(E/T=100:1)加入加入96孔细胞培养板的孔中孔细胞培养板的孔中,每份标本设每份标本设2个复孔个复孔,同时设靶细胞自然释放对照组同时设靶细胞自然释放对照组 (0.1ml靶细胞靶细胞+0.1ml RPMI-1640液液)最大释放对照组最大释放对照组 (0.1ml靶细胞靶细胞+0.1ml1NP-40液液),1000r/min,2min后后,置置37、5CO2温箱温箱中孵育中孵育2-4h。A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 实验组实验组 自然释放组自然释放组 最大释放组最大释放组 1 2 3 4 5 6 效应细胞（效应细胞（100l）+-靶细胞（靶细胞（100l）+RPMI1640（100l）-+-1%NP-40（100l）-+【操作方法】n酶促反应酶促反应：从：从37温箱中取出培养物，吸取温箱中取出培养物，吸取各孔上清各孔上清0.1ml 加于另一培养板孔中。加于另一培养板孔中。酶促反应酶促反应置置37预温预温10min,加入新鲜配制的底物溶液加入新鲜配制的底物溶液0.1ml,37避光反应避光反应1015min。终止酶促反应终止酶促反应（用毛细吸管滴一滴（用毛细吸管滴一滴1mol/L柠檬酸柠檬酸30l）A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12结果计算结果计算 用酶标检测仪在用酶标检测仪在570nm波长下读取各孔波长下读取各孔OD值值,并计算并计算NK细胞活性。细胞活性。实验组实验组OD值值-自然释放对照组自然释放对照组OD值值NK细胞活性细胞活性（%）最大释放对照组最大释放对照组OD值值-自然释放对照组自然释放对照组OD值值=100%1、无论采用何种试验方法、无论采用何种试验方法,靶细胞的质量是影响细靶细胞的质量是影响细 胞标记率、自然释放率及实验稳定性的重要因胞标记率、自然释放率及实验稳定性的重要因 素。一般要求靶细胞的自然释放率素。一般要求靶细胞的自然释放率10。2、分离、分离PBMC时，应用毛细吸管尽可能吸取灰白时，应用毛细吸管尽可能吸取灰白 层，切勿搅动各层。层，切勿搅动各层。3、吸取细胞培养上清时、吸取细胞培养上清时,应尽可能不吸动沉淀的细应尽可能不吸动沉淀的细 胞。胞。4、用此法测得、用此法测得NK活性的正常值范围在活性的正常值范围在10-40%。注意事项注意事项:实验报告实验报告1.1.记录记录NKNK细胞杀伤实验的原理、方法、细胞杀伤实验的原理、方法、结果。结果。T淋巴细胞检查淋巴细胞检查1T细胞检查细胞检查（1）T细胞花环形成试验细胞花环形成试验 （Erythrocyte Erythrocyte rosette rosette formation formation test,test,ERFTERFT）E E花环形成试验花环形成试验（Erythrocyte rosette formation test,ERFTErythrocyte rosette formation test,ERFT）【目的要求】【目的要求】1.1.掌握掌握T T淋巴细胞淋巴细胞E E花环试验的原理、正常值，花环试验的原理、正常值，了解其方法和用途。了解其方法和用途。2.2.熟悉光镜下熟悉光镜下E E花环的形态和计数方法。花环的形态和计数方法。【实验原理】【实验原理】T T细细胞胞表表面面具具有有能能与与绵绵羊羊红红细细胞胞（SRBCSRBC）表表面面糖糖肽肽结结合合的的受受体体，称称为为E E受受体体（CD2CD2）。已已证证实实E E受受体体是是人人类类T T细细胞胞所所特特有有的的表表面面标标志志。当当T T细细胞胞与与SRBCSRBC混混合合后后，SRBCSRBC便便粘粘附附于于T T细细胞胞表表面面，呈呈现现花花环环状状。通通过过花花环环形形成成检检查查T T细细胞胞的的方方法法，称称为为E E花环形成试验花环形成试验。根根据据花花环环形形成成的的多多少少，可可测测知知T T细细胞胞的的数数目目，从从而而间间接接了了解解机机体体细细胞胞免免疫疫功功能能状状态态，判判断断疾病的预后，考核药物疗效等。疾病的预后，考核药物疗效等。【实验方法】【实验方法】淋巴细胞与淋巴细胞与SRBC按一定比例按一定比例(1:10)混合混合 37 5分钟，分钟，420分钟分钟 取样涂片取样涂片瑞氏瑞氏染色、镜检。染色、镜检。计数计数E花环数，算出总花环形成率。花环数，算出总花环形成率。正常值为正常值为60%80%。【结果观察】【结果观察】高高高高倍倍倍倍镜镜镜镜检检检检查查查查：淋淋淋淋巴巴巴巴细细细细胞胞胞胞呈呈呈呈蓝蓝蓝蓝色色色色，SRBCSRBCSRBCSRBC呈呈呈呈红红红红色色色色围围围围绕绕绕绕淋淋淋淋巴巴巴巴细细细细胞胞胞胞形形形形成成成成花花花花环环环环，凡凡凡凡表表表表面面面面粘粘粘粘附附附附有有有有3 3 3 3个个个个或或或或3 3 3 3个个个个以以以以上上上上SRBCSRBCSRBCSRBC者为花环形成细胞（即者为花环形成细胞（即者为花环形成细胞（即者为花环形成细胞（即E E E E阳性细胞）。阳性细胞）。阳性细胞）。阳性细胞）。计计计计数数数数200200200200个个个个淋淋淋淋巴巴巴巴细细细细胞胞胞胞，算算算算出出出出花花花花环环环环形形形形成成成成百百百百分分分分率率率率，并并并并推推推推测测测测其其其其T T T T淋巴细胞百分率。正常值为：淋巴细胞百分率。正常值为：淋巴细胞百分率。正常值为：淋巴细胞百分率。正常值为：5050505080%80%80%80%。花环形成百分率花环形成百分率花环形成百分率花环形成百分率%=%=%=%=花环形成细胞花环形成细胞花环形成细胞花环形成细胞+不形成花环细胞不形成花环细胞100%花环形成细胞花环形成细胞
