脱分化和再分化.ppt

第四章影响植物细胞脱分化和再分化的因子 董 雯 生物技术教研室 植物离体培养中，影响植物细胞脱分化和植物离体培养中，影响植物细胞脱分化和再分化的因子有外因和内因两个方面。再分化的因子有外因和内因两个方面。外因外因环境条件环境条件营养条件营养条件天然复合物天然复合物有机物有机物植物激素植物激素无机盐无机盐温度温度酸碱度酸碱度渗透压渗透压光照光照湿度湿度内因内因 生理状态生理状态 遗传性遗传性4.1 培养基的影响培养基的影响4.1.1 培养基的营养成分（四大类）培养基的营养成分（四大类）无机盐混合物类无机盐混合物类有机物类有机物类植物激素类植物激素类天然复合物类天然复合物类无机盐混合物类：无机盐混合物类：提供植物细胞的无机营养，维提供植物细胞的无机营养，维持培养基的酸碱度和渗透压。持培养基的酸碱度和渗透压。（1）大量元素）大量元素 植物脱分化、再分化形态建成，需要量较大的植物脱分化、再分化形态建成，需要量较大的的一类元素。包括的一类元素。包括N、P、K、S、Ca、Mg等。等。硝态氮和铵态氮的应用比例，可根据植物的类硝态氮和铵态氮的应用比例，可根据植物的类别灵活调用。别灵活调用。（2）微量元素）微量元素 与植物代谢有密切关系。常用：与植物代谢有密切关系。常用：Fe、Mn、Zn等。用量虽少，但是作用不小。等。用量虽少，但是作用不小。有机物类：有机物类：（1）碳水化合物：细胞碳源和能源，也调节培）碳水化合物：细胞碳源和能源，也调节培养基的渗透压。养基的渗透压。（2）维生素类）维生素类（3）有机氮源：氨基酸和酰胺类，对细胞的脱）有机氮源：氨基酸和酰胺类，对细胞的脱分化、再分化器官建成都起重要作用。分化、再分化器官建成都起重要作用。植物激素类植物激素类1.常用激素：生长素、细胞分裂素、赤霉素常用激素：生长素、细胞分裂素、赤霉素（1）生长素类）生长素类 在组织培养中，在组织培养中，生长素主要被用于诱导愈生长素主要被用于诱导愈伤组织形成，诱导根的分化和促进细胞分裂、伤组织形成，诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。伸长生长。在促进生长方面，根对生长素最在促进生长方面，根对生长素最敏感。敏感。活性：活性：2，4D NAAIAA 浓度范围：浓度范围：0.115mg/L（2）赤霉素）赤霉素 主要用于刺激在培养中形成的不定胚发育成主要用于刺激在培养中形成的不定胚发育成小植株，促进幼苗茎的伸长生长。此外，赤小植株，促进幼苗茎的伸长生长。此外，赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化有霉素和生长素协同作用，对形成层的分化有影响，影响，当生长素赤霉素比值高时有利于木当生长素赤霉素比值高时有利于木质部分化，比值低时有利于韧皮部分化。质部分化，比值低时有利于韧皮部分化。此此外，赤霉素还用于外，赤霉素还用于打破休眠，促进种子、块打破休眠，促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发茎、鳞茎等提前萌发。一般在器官形成后，。一般在器官形成后，添加赤霉素可促进器官或胚状体的生长。添加赤霉素可促进器官或胚状体的生长。常用常用GA3（3）细胞分裂素类）细胞分裂素类 培养基中添加细胞分裂素有三个作用：培养基中添加细胞分裂素有三个作用：诱诱导芽的分化促进侧芽萌发生长导芽的分化促进侧芽萌发生长，细胞分裂素与，细胞分裂素与生长素相互作用，当组织内细胞分裂素生长生长素相互作用，当组织内细胞分裂素生长素的比值高时，诱导愈伤组织或器官分化出不素的比值高时，诱导愈伤组织或器官分化出不定芽。定芽。促进细胞分裂与扩大促进细胞分裂与扩大。抑制根的分抑制根的分化化。因此，细胞分裂素多用于诱导不定芽的分。因此，细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化、茎、苗的增殖，而避免在生根培养时使用。化、茎、苗的增殖，而避免在生根培养时使用。活性：活性：ZTBAKT 浓度范围：浓度范围：0.110mg/L 2.激素的应用规律：激素的应用规律：离体培养时，在生长素存在的条件下，细胞分离体培养时，在生长素存在的条件下，细胞分裂素的作用有加强的趋势，不过两者在使用上有裂素的作用有加强的趋势，不过两者在使用上有一定的顺序关系，由于处理的顺序不同，会影响一定的顺序关系，由于处理的顺序不同，会影响培养物器官发生的方向。培养物器官发生的方向。先生长素，后分裂素处理有利于细胞的分裂，但先生长素，后分裂素处理有利于细胞的分裂，但细胞不分化。细胞不分化。先分裂素再生长素处理，细胞也分化。先分裂素再生长素处理，细胞也分化。两者同时处理时，分化频率提高。但是两者同时两者同时处理时，分化频率提高。但是两者同时处理时用量比值会改变形态建成的方向。处理时用量比值会改变形态建成的方向。总总 之之自然界植物的种类、品种繁多；离体培养时自然界植物的种类、品种繁多；离体培养时取材也是形形色色；培养目的也不尽相同，取材也是形形色色；培养目的也不尽相同，要想使植物激素的应用技巧要想使植物激素的应用技巧“得心应手得心应手”使使不容易的，唯一的办法就是多实践不容易的，唯一的办法就是多实践离体培养时，离体培养时，在使用外源激素时，还受到内在使用外源激素时，还受到内源激素的干扰。源激素的干扰。目前对内源激素的测定尚无目前对内源激素的测定尚无准确、简便的方法，故对能源激素难以做到准确、简便的方法，故对能源激素难以做到定量、定性分析。因此在外源激素的应用上，定量、定性分析。因此在外源激素的应用上，还处于比较盲目的阶段。还处于比较盲目的阶段。天然复合物天然复合物 成分比较复杂，大多含氨基酸、激素、酶等成分比较复杂，大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。它一些复杂化合物。它对细胞和组织的增殖与分对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用，但对器官的分化作用不化有明显的促进作用，但对器官的分化作用不明显。明显。它的它的成分大多不清楚成分大多不清楚，所以一般应尽量，所以一般应尽量避免使用，特别是新的生长调节物质不断产生，避免使用，特别是新的生长调节物质不断产生，更缩小了它的使用范围。可是由于其对一些难更缩小了它的使用范围。可是由于其对一些难以生长培养材料的特殊作用，所以在一些试验以生长培养材料的特殊作用，所以在一些试验中还常常应用它。中还常常应用它。4.1.2 培养基的渗透压培养基的渗透压 调节渗透压的意义调节渗透压的意义 渗透压是由培养基中的渗透压是由培养基中的各种物质的总浓度决各种物质的总浓度决定的定的。也就是说，是由培养基中各种无机盐和。也就是说，是由培养基中各种无机盐和有机物的总浓度决定的。有机物的总浓度决定的。培养细胞是通过细胞渗透来吸取来吸取营养培养细胞是通过细胞渗透来吸取来吸取营养的，当培养材料和培养基之间处于的，当培养材料和培养基之间处于等渗时等渗时，或，或者培养材料的渗透压略者培养材料的渗透压略低于低于培养基渗透压时，培养基渗透压时，培养材料才能从培养基里汲取养分和水分。培养材料才能从培养基里汲取养分和水分。4.1.2.2 渗透压调节物质渗透压调节物质 糖糖对培养基渗透压起决定性作用。对培养基渗透压起决定性作用。4.1.2.3 糖的种类与糖浓度糖的种类与糖浓度种类：蔗糖、葡萄糖、果糖等种类：蔗糖、葡萄糖、果糖等浓度控制：浓度控制：植物材料不同植物材料不同 不同培养目的不同培养目的 培养方式不同培养方式不同4.1.3 培养基的酸碱度培养基的酸碱度4.1.3.1 调节培养基酸碱度意义调节培养基酸碱度意义 植物是自养的，它有自体调节机制。而离体植物是自养的，它有自体调节机制。而离体的材料失去了这一能力，只能人工调节。的材料失去了这一能力，只能人工调节。方法：方法：1）用）用pH测定计直接测定测定计直接测定 2）用）用pH试纸比色测定试纸比色测定培养基培养基pHpH调节的依据调节的依据 1 1）按照植物长期生活所处环境的酸碱度）按照植物长期生活所处环境的酸碱度进行调节进行调节 2 2）依据培养基硬度来决定）依据培养基硬度来决定 一般来说当一般来说当pHpH高于高于6.56.5时，培养基全变时，培养基全变硬硬；低于低于5 5时，琼脂时，琼脂不能不能很好地凝固很好地凝固 3 3）依据培养基中某些物质的稳定性（）依据培养基中某些物质的稳定性（FeFe、赤霉素等）赤霉素等）不同植物的最适不同植物的最适p p值值种种 类类最适最适PHPH值值种种 类类最适最适PHPH值值杜杜 鹃鹃4 40 0月月 季季5 58 8越越 桔桔4 45 5胡胡萝萝卜、卜、石刁柏石刁柏6 60 0蚕蚕 豆豆5 55 5桃桃7 70 0番茄、葡番茄、葡萄萄5 57 74.2 环境条件环境条件4.2.1 湿度条件湿度条件 湿度的影响包括培养容器和环境的湿度条件。湿度的影响包括培养容器和环境的湿度条件。容器内主要受容器内主要受培养基水分含量和封口材料的影培养基水分含量和封口材料的影响。响。前者又受琼脂含量的影响。在冬季应适当前者又受琼脂含量的影响。在冬季应适当减少琼脂用量，否则将使培养基干硬，以致不减少琼脂用量，否则将使培养基干硬，以致不利于外植体接触或插进培养基，利于外植体接触或插进培养基，导致生长发育导致生长发育受阻。封口材料直接影响容器内湿度情况，但受阻。封口材料直接影响容器内湿度情况，但封闭度较高的封口材料易引起通透性受阻，也封闭度较高的封口材料易引起通透性受阻，也导致生长发育受影响。导致生长发育受影响。主要是主要是培养瓶以外环境的相对湿度培养瓶以外环境的相对湿度存在的间存在的间接影响。当外界相对湿度低于接影响。当外界相对湿度低于6060时，培养时，培养基容易干涸，会改变培养基的渗透压。相反，基容易干涸，会改变培养基的渗透压。相反，当外界湿度过高时，培养室潮湿，具备了细当外界湿度过高时，培养室潮湿，具备了细菌和霉菌的滋长条件，会造成培养基和培养菌和霉菌的滋长条件，会造成培养基和培养材料的污染。材料的污染。一般要求一般要求70708080的相对湿度，的相对湿度，常用加湿器或经常洒水的方法来调节湿度。常用加湿器或经常洒水的方法来调节湿度。4.2.2 温度条件温度条件 离体培养下，培养温度与植物细胞脱分化、离体培养下，培养温度与植物细胞脱分化、细胞分裂和再分化有着密切的关系。大多数植细胞分裂和再分化有着密切的关系。大多数植物都是在物都是在2327之间进行，一般采用之间进行，一般采用252。低于。低于15时培养，植物组织会表现时培养，植物组织会表现生长停止，高于生长停止，高于35时对植物生长不利。时对植物生长不利。但是，不同的植物材料对不同的温度反应是但是，不同的植物材料对不同的温度反应是不一样的。不同培养目标采用的培养温度也不不一样的。不同培养目标采用的培养温度也不同。同。离体培养条件下温度控制的原则离体培养条件下温度控制的原则 主要依据：植物的起源和生态类型主要依据：植物的起源和生态类型喜温性植物：喜温性植物：2628 冷凉性植物：冷凉性植物：1822 或或25 再细胞进行脱分化阶段（诱导期）和愈伤组再细胞进行脱分化阶段（诱导期）和愈伤组织增殖期（分裂期），对温度的要求较高；织增殖期（分裂期），对温度的要求较高；而在器官发阶段（分化期）要求低些。而在器官发阶段（分化期）要求低些。培养周期中的昼夜温差培养周期中的昼夜温差 恒温培养恒温培养还是还是变温培养变温培养？低温处理低温处理 在花药离体培养前后，实施低温预处理，在花药离体培养前后，实施低温预处理，可以促进细胞的脱分化和再分化。现已成为可以促进细胞的脱分化和再分化。现已成为一种有效的诱导措施。特别是一种有效的诱导措施。特别是在花药和花粉在花药和花粉培养培养方面。方面。光照条件光照条件 光的影响包括：光的影响包括：光周期（黑暗与光照交替的时间）光周期（黑暗与光照交替的时间）光量（光照强度）光量（光照强度）光质（光的波长）光质（光的波长）4.2.3.1 光周期光周期 试管苗培养时要选用一定的光暗周期来进行试管苗培养时要选用一定的光暗周期来进行组织培养，组织培养，最常用的周期是最常用的周期是16小时的光照，小时的光照，小时的黑暗，研究表明，小时的黑暗，研究表明，对短日照敏感的品对短日照敏感的品种的器官组织，种的器官组织，在短日照下易分化，而在长日在短日照下易分化，而在长日照下产生愈伤组织，有时需要暗培养，照下产生愈伤组织，有时需要暗培养，尤其是尤其是一些植物的愈伤组织在暗下比在光下更好。一些植物的愈伤组织在暗下比在光下更好。是否需要光周期调节是根据不同的植物及不是否需要光周期调节是根据不同的植物及不同培养目的来进行选择的。同培养目的来进行选择的。愈伤组织诱导阶段愈伤组织诱导阶段器官发生阶段器官发生阶段 4.2.3.2 光量光量 光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响，从目前的研究情况看，光照强有重要影响，从目前的研究情况看，光照强度对外植物体、细胞的最初分裂有明显的影度对外植物体、细胞的最初分裂有明显的影响。一般来说，光照强度较强，幼苗生长的响。一般来说，光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而光照强度较弱幼苗容易徒长。粗壮，而光照强度较弱幼苗容易徒长。光质光质 光质对愈伤组织诱导，培养组织的增殖以光质对愈伤组织诱导，培养组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响。及器官的分化都有明显的影响。离体培养中根芽分化的有效光谱成分不同。离体培养中根芽分化的有效光谱成分不同。芽的分化有效光谱：蓝紫光芽的分化有效光谱：蓝紫光419540nm根的分化有效光谱：红光根的分化有效光谱：红光600680nm4.3 供体遗传性和生理状态供体遗传性和生理状态4.3.1 供体植物的遗传性与器官发生供体植物的遗传性与器官发生 基因型不同，形态建成能力有差异。这种基因型不同，形态建成能力有差异。这种差异表现在：差异表现在：种与种之间种与种之间同一种的不同亚种之间同一种的不同亚种之间纯种与杂种之间纯种与杂种之间4.3.2 供体生理状态供体生理状态1.生理年龄：生理年龄：年龄较幼的外植体，不仅易于诱导形年龄较幼的外植体，不仅易于诱导形成愈伤组织，而且也容易诱导分化成植株。成愈伤组织，而且也容易诱导分化成植株。2.保存时间：保存时间：及时转移已形成的愈伤组织进行分化及时转移已形成的愈伤组织进行分化培养，可大大提高苗的分化频率培养，可大大提高苗的分化频率 3.继代次数：继代次数：继代次数越多，器官建成能力下降继代次数越多，器官建成能力下降作作 业业愈伤组织：愈伤组织：胚状体：胚状体：脱分化：脱分化：再分化：再分化：培养基由哪些部分组成，如何配制？为什么培养基由哪些部分组成，如何配制？为什么在配制培养基时先要配成较浓的混合母液？在配制培养基时先要配成较浓的混合母液？简述植物细胞全能性的实现途径和条件？简述植物细胞全能性的实现途径和条件？