荧光免疫标记技术讲课讲稿.ppt

v荧荧光免疫光免疫标记标记技技术术1荧光标荧光标记物的记物的制备制备2荧光免荧光免疫组织疫组织化学技化学技术术3其他荧其他荧光免疫光免疫技术技术任务对象任务对象 任务过程任务过程 复习提问复习提问 案例导入案例导入 讲解与示教讲解与示教学生操作学生操作讨论分析讨论分析 评价、考核评价、考核 课后思考题课后思考题 教教学学环环节节2 30 2 10 40 5 1 患儿，男，间断发热五天，伴咳嗽患儿，男，间断发热五天，伴咳嗽患儿，男，间断发热五天，伴咳嗽患儿，男，间断发热五天，伴咳嗽3 3 3 3天。体天。体天。体天。体温最高温最高温最高温最高39393939度，病程第度，病程第度，病程第度，病程第2 2 2 2天查血常规正常，诊天查血常规正常，诊天查血常规正常，诊天查血常规正常，诊断断断断“呼吸道感染呼吸道感染呼吸道感染呼吸道感染”并静滴并静滴并静滴并静滴“阿奇霉素阿奇霉素阿奇霉素阿奇霉素”3 3 3 3天，天，天，天，无明显改变，即而出现咳嗽，为阵发性刺无明显改变，即而出现咳嗽，为阵发性刺无明显改变，即而出现咳嗽，为阵发性刺无明显改变，即而出现咳嗽，为阵发性刺激性咳嗽，少痰，胸片提示：双肺纹理增激性咳嗽，少痰，胸片提示：双肺纹理增激性咳嗽，少痰，胸片提示：双肺纹理增激性咳嗽，少痰，胸片提示：双肺纹理增粗，右上肺片影。复查血常规仍正常。患粗，右上肺片影。复查血常规仍正常。患粗，右上肺片影。复查血常规仍正常。患粗，右上肺片影。复查血常规仍正常。患儿肺部感染系哪种病原体所致？儿肺部感染系哪种病原体所致？儿肺部感染系哪种病原体所致？儿肺部感染系哪种病原体所致？如何快速如何快速如何快速如何快速诊断？诊断？诊断？诊断？案例导入案例导入老师纠正老师纠正老师纠正老师纠正点评点评点评点评 学生操作学生操作一位学生一位学生一位学生一位学生操作演示操作演示操作演示操作演示学生分组学生分组学生分组学生分组再操作再操作再操作再操作 【主要试剂与器材主要试剂与器材主要试剂与器材主要试剂与器材】1.1.抗原基质片抗原基质片抗原基质片抗原基质片 固定有核抗原，可采用小鼠肝组织切固定有核抗原，可采用小鼠肝组织切固定有核抗原，可采用小鼠肝组织切固定有核抗原，可采用小鼠肝组织切 片或印片经丙酮固定即可。目前有商品化试剂供应。片或印片经丙酮固定即可。目前有商品化试剂供应。片或印片经丙酮固定即可。目前有商品化试剂供应。片或印片经丙酮固定即可。目前有商品化试剂供应。2.2.标记抗体标记抗体标记抗体标记抗体 FITCFITC标记的羊抗人标记的羊抗人标记的羊抗人标记的羊抗人IgGIgG，有商品化试剂供，有商品化试剂供，有商品化试剂供，有商品化试剂供 应。临用时稀释至工作浓度。应。临用时稀释至工作浓度。应。临用时稀释至工作浓度。应。临用时稀释至工作浓度。3.0.01mol/L pH7.2PBS3.0.01mol/L pH7.2PBS。4.4.缓冲甘油缓冲甘油缓冲甘油缓冲甘油 9 9份甘油和份甘油和份甘油和份甘油和1 1份份份份PBSPBS混匀。混匀。混匀。混匀。5.5.待检血清，阴性、阳性对照血清。待检血清，阴性、阳性对照血清。待检血清，阴性、阳性对照血清。待检血清，阴性、阳性对照血清。6.6.其它其它其它其它 荧光显微镜、染色缸、吸管、微量加样器等。荧光显微镜、染色缸、吸管、微量加样器等。荧光显微镜、染色缸、吸管、微量加样器等。荧光显微镜、染色缸、吸管、微量加样器等。实验操作实验操作【操作方法操作方法】vv1.1.自冰箱中取出抗原基质片，平衡至室温，用记号笔画圈自冰箱中取出抗原基质片，平衡至室温，用记号笔画圈自冰箱中取出抗原基质片，平衡至室温，用记号笔画圈自冰箱中取出抗原基质片，平衡至室温，用记号笔画圈标记。标记。标记。标记。vv2.2.将待检血清和对照血清用将待检血清和对照血清用将待检血清和对照血清用将待检血清和对照血清用PBSPBS作作作作1 1 1010稀释，用微量加稀释，用微量加稀释，用微量加稀释，用微量加样器加样器加样器加样器加50l50l待检血清或对照血清于基质片上，水平置于待检血清或对照血清于基质片上，水平置于待检血清或对照血清于基质片上，水平置于待检血清或对照血清于基质片上，水平置于湿盒中湿盒中湿盒中湿盒中37oC37oC温箱反应温箱反应温箱反应温箱反应30min30min。vv3.3.以以以以PBSPBS冲洗抗原基质片，再分别浸于盛有冲洗抗原基质片，再分别浸于盛有冲洗抗原基质片，再分别浸于盛有冲洗抗原基质片，再分别浸于盛有PBSPBS染色缸染色缸染色缸染色缸中，反复漂洗中，反复漂洗中，反复漂洗中，反复漂洗3 3次，每次次，每次次，每次次，每次5min5min。vv4.4.取出玻片，吹干，加取出玻片，吹干，加取出玻片，吹干，加取出玻片，吹干，加50l50l最适工作浓度的标记抗体，最适工作浓度的标记抗体，最适工作浓度的标记抗体，最适工作浓度的标记抗体，平置于湿盒内，平置于湿盒内，平置于湿盒内，平置于湿盒内，37oC37oC温箱反应温箱反应温箱反应温箱反应30min30min。vv 5.5.重复步骤重复步骤重复步骤重复步骤3 3，洗去未结合的荧光抗体。，洗去未结合的荧光抗体。，洗去未结合的荧光抗体。，洗去未结合的荧光抗体。vv6.6.滴加缓冲甘油封片，用荧光显微镜观察。滴加缓冲甘油封片，用荧光显微镜观察。滴加缓冲甘油封片，用荧光显微镜观察。滴加缓冲甘油封片，用荧光显微镜观察。实验操作实验操作【结果判断结果判断】v1.1.荧光显微镜下见肝细胞核呈黄绿色，为阳性；荧光显微镜下见肝细胞核呈黄绿色，为阳性；荧光显微镜下见肝细胞核呈黄绿色，为阳性；荧光显微镜下见肝细胞核呈黄绿色，为阳性；反之为阴性。反之为阴性。反之为阴性。反之为阴性。v2.2.根据荧光分布情况，可分为四种荧光核型：根据荧光分布情况，可分为四种荧光核型：根据荧光分布情况，可分为四种荧光核型：根据荧光分布情况，可分为四种荧光核型：v均质型均质型均质型均质型:细胞核呈均匀一致的荧光。细胞核呈均匀一致的荧光。细胞核呈均匀一致的荧光。细胞核呈均匀一致的荧光。v周边型周边型周边型周边型:细胞核周围呈现荧光，核中央染色弱或细胞核周围呈现荧光，核中央染色弱或细胞核周围呈现荧光，核中央染色弱或细胞核周围呈现荧光，核中央染色弱或无荧光。无荧光。无荧光。无荧光。v斑点型：细胞核呈现斑点状荧光。斑点型：细胞核呈现斑点状荧光。斑点型：细胞核呈现斑点状荧光。斑点型：细胞核呈现斑点状荧光。v核仁型：核仁部分呈现荧光。核仁型：核仁部分呈现荧光。核仁型：核仁部分呈现荧光。核仁型：核仁部分呈现荧光。实验操作实验操作实验操作实验操作 实验操作实验操作【注意事项注意事项】v1.1.滴加的血清或标记抗体应充分覆盖满抗原片。滴加的血清或标记抗体应充分覆盖满抗原片。滴加的血清或标记抗体应充分覆盖满抗原片。滴加的血清或标记抗体应充分覆盖满抗原片。样品之间防止交叉污染。反应时应置于湿盒内，样品之间防止交叉污染。反应时应置于湿盒内，样品之间防止交叉污染。反应时应置于湿盒内，样品之间防止交叉污染。反应时应置于湿盒内，防止干燥。防止干燥。防止干燥。防止干燥。v2.2.每次冲片应彻底，防止非特异荧光的干扰。每次冲片应彻底，防止非特异荧光的干扰。每次冲片应彻底，防止非特异荧光的干扰。每次冲片应彻底，防止非特异荧光的干扰。v3.3.荧光受温度影响较大，不能及时观察时应注荧光受温度影响较大，不能及时观察时应注荧光受温度影响较大，不能及时观察时应注荧光受温度影响较大，不能及时观察时应注意低温避光保存。意低温避光保存。意低温避光保存。意低温避光保存。实验操作实验操作【应用与评价应用与评价】v荧光抗体技术应用较广，可用于病原微生物鉴定荧光抗体技术应用较广，可用于病原微生物鉴定荧光抗体技术应用较广，可用于病原微生物鉴定荧光抗体技术应用较广，可用于病原微生物鉴定及其抗体的检测；自身免疫病自身抗体的检测，及其抗体的检测；自身免疫病自身抗体的检测，及其抗体的检测；自身免疫病自身抗体的检测，及其抗体的检测；自身免疫病自身抗体的检测，免疫细胞表面抗原的检测等。免疫细胞表面抗原的检测等。免疫细胞表面抗原的检测等。免疫细胞表面抗原的检测等。v此方法检测此方法检测此方法检测此方法检测ANAANA，主要用于初步筛查，具有简便、，主要用于初步筛查，具有简便、，主要用于初步筛查，具有简便、，主要用于初步筛查，具有简便、快速、敏感等特点。快速、敏感等特点。快速、敏感等特点。快速、敏感等特点。实验操作实验操作讨论分析讨论分析提提 出出 问问 题题展展 开开 讨讨 论论 用什么可以用什么可以用什么可以用什么可以观察到荧光观察到荧光观察到荧光观察到荧光？为什么有荧为什么有荧为什么有荧为什么有荧光就能做出光就能做出光就能做出光就能做出诊断？诊断？诊断？诊断？免疫荧光技术（免疫荧光技术（Immunofluorescence technique）又称荧光抗体技术。它是在免）又称荧光抗体技术。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。立起来的一项技术。v该技术的主要优缺点该技术的主要优缺点该技术的主要优缺点该技术的主要优缺点v主要优点：特异性强、敏感性高、速度快。主要优点：特异性强、敏感性高、速度快。主要优点：特异性强、敏感性高、速度快。主要优点：特异性强、敏感性高、速度快。v主要缺点：非特异性染色问题尚未完全解主要缺点：非特异性染色问题尚未完全解主要缺点：非特异性染色问题尚未完全解主要缺点：非特异性染色问题尚未完全解 决，决，决，决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。免疫荧光技术免疫荧光技术讨论分析讨论分析 免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微示踪的精确性相结合。微示踪的精确性相结合。微示踪的精确性相结合。微示踪的精确性相结合。以荧光素作为标记物，与已知的抗体以荧光素作为标记物，与已知的抗体以荧光素作为标记物，与已知的抗体以荧光素作为标记物，与已知的抗体(或抗原或抗原或抗原或抗原)结合、但结合、但结合、但结合、但不影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试不影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试不影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试不影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和鉴定未知的抗原。剂，用于检测和鉴定未知的抗原。剂，用于检测和鉴定未知的抗原。剂，用于检测和鉴定未知的抗原。在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其存在部位。体复合物及其存在部位。体复合物及其存在部位。体复合物及其存在部位。免疫荧光技术免疫荧光技术免疫荧光技术免疫荧光技术-基本原理基本原理基本原理基本原理讨论分析讨论分析 荧光是指一个分子或原子吸收了给予的能量后，即刻引荧光是指一个分子或原子吸收了给予的能量后，即刻引荧光是指一个分子或原子吸收了给予的能量后，即刻引荧光是指一个分子或原子吸收了给予的能量后，即刻引起发光；停止能量供给，发光亦瞬即停止。荧光素是一起发光；停止能量供给，发光亦瞬即停止。荧光素是一起发光；停止能量供给，发光亦瞬即停止。荧光素是一起发光；停止能量供给，发光亦瞬即停止。荧光素是一种可吸收激发光的光便能产生荧光，并能作为染料使用种可吸收激发光的光便能产生荧光，并能作为染料使用种可吸收激发光的光便能产生荧光，并能作为染料使用种可吸收激发光的光便能产生荧光，并能作为染料使用的有机化合物，亦称荧光色素。的有机化合物，亦称荧光色素。的有机化合物，亦称荧光色素。的有机化合物，亦称荧光色素。发生原理发生原理发生原理发生原理-基态基态基态基态 激发态激发态激发态激发态产生特点：激发产生特点：激发产生特点：激发产生特点：激发-即刻产生即刻产生即刻产生即刻产生 停止激发停止激发停止激发停止激发-瞬间消失瞬间消失瞬间消失瞬间消失种类种类种类种类-光致荧光，化学荧光，光致荧光，化学荧光，光致荧光，化学荧光，光致荧光，化学荧光，X X线荧光，阴极射线荧光线荧光，阴极射线荧光线荧光，阴极射线荧光线荧光，阴极射线荧光讨论分析讨论分析荧光荧光荧光寿命荧光寿命-荧光物质被瞬时光脉冲激发后产生的荧光物质被瞬时光脉冲激发后产生的荧光衰减到一定程度所用时间。荧光衰减到一定程度所用时间。荧光淬灭荧光淬灭-荧光物质的荧光辐射能力在受到激发荧光物质的荧光辐射能力在受到激发光较长时间的照射后发生的减弱现象。光较长时间的照射后发生的减弱现象。淬灭剂淬灭剂-苯胺、硝基苯、酚等苯胺、硝基苯、酚等荧光（标记）物质的保存荧光（标记）物质的保存荧光荧光讨论分析讨论分析 荧光色素荧光色素荧光色素荧光色素:能够产生明显能够产生明显能够产生明显能够产生明显荧光并能作为染料使用荧光并能作为染料使用荧光并能作为染料使用荧光并能作为染料使用的有机化合物称为荧光的有机化合物称为荧光的有机化合物称为荧光的有机化合物称为荧光色素或荧光染料。用于色素或荧光染料。用于色素或荧光染料。用于色素或荧光染料。用于标记抗体的荧光色素，标记抗体的荧光色素，标记抗体的荧光色素，标记抗体的荧光色素，必须具有化学上的活性必须具有化学上的活性必须具有化学上的活性必须具有化学上的活性基因，能与蛋白质稳定基因，能与蛋白质稳定基因，能与蛋白质稳定基因，能与蛋白质稳定结合，且不影响标记抗结合，且不影响标记抗结合，且不影响标记抗结合，且不影响标记抗体的生物活性及抗原抗体的生物活性及抗原抗体的生物活性及抗原抗体的生物活性及抗原抗体的特异性结合。体的特异性结合。体的特异性结合。体的特异性结合。讨论分析讨论分析异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素(FITC)(FITC)荧光荧光荧光荧光FITC+RB200标记标记讨论分析讨论分析光源：高压汞灯、氙灯、光源：高压汞灯、氙灯、光源：高压汞灯、氙灯、光源：高压汞灯、氙灯、卤素灯卤素灯卤素灯卤素灯1 1滤板：隔热滤板、激滤板：隔热滤板、激滤板：隔热滤板、激滤板：隔热滤板、激光滤板（光滤板（光滤板（光滤板（UGUG、BGBG）、）、）、）、吸收滤板（吸收滤板（吸收滤板（吸收滤板（OGOG、GGGG）2 2光路：透射光、落射光路：透射光、落射光路：透射光、落射光路：透射光、落射光光光光荧光显微镜荧光显微镜荧光显微镜荧光显微镜讨论分析讨论分析a 透射光透射光 b 落射光落射光 讨论分析讨论分析 荧光显微镜荧光显微镜荧光显微镜荧光显微镜台式机台式机台式机台式机-FACSCalibur-FACSCalibur双激光双激光双激光双激光-488nm488nm 635nm635nm四荧光参四荧光参四荧光参四荧光参数数数数分选、浓分选、浓分选、浓分选、浓缩系统缩系统缩系统缩系统讨论分析讨论分析大型机大型机大型机大型机-FACSVantage SE-FACSVantage SE 多激光多多激光多多激光多多激光多波长八荧光波长八荧光波长八荧光波长八荧光参数高速分参数高速分参数高速分参数高速分选单细胞点选单细胞点选单细胞点选单细胞点对点分选对点分选对点分选对点分选讨论分析讨论分析v基本原理-荧光显微镜；荧光Ab；标本（组织或细胞中Ag)v技术类型：直接法-荧光素标记Ab直接检测间接法-荧光素标记二抗补体结合法-荧光素标记抗补体Ab双结合法-两种荧光素标记Ab重点重点荧光免疫显微技术荧光免疫显微技术讨论分析讨论分析讨论分析讨论分析间接免疫荧光检测自身抗核抗体间接免疫荧光检测自身抗核抗体间接免疫荧光检测自身抗核抗体间接免疫荧光检测自身抗核抗体讨论分析讨论分析FALS SensorFALS SensorLaserLaser前向角散射光（前向角散射光（FSC）：反映细胞的大小）：反映细胞的大小荧光免疫显微技术荧光免疫显微技术荧光免疫显微技术荧光免疫显微技术讨论分析讨论分析FALS SensorFALS Sensor90LS Sensor90LS SensorLaserLaser侧向角散射光（侧向角散射光（侧向角散射光（侧向角散射光（SSCSSC）：反映细胞内的颗粒多少）：反映细胞内的颗粒多少）：反映细胞内的颗粒多少）：反映细胞内的颗粒多少 荧光免疫显微技术荧光免疫显微技术荧光免疫显微技术荧光免疫显微技术讨论分析讨论分析双色直接染色细胞双色直接染色细胞双色直接染色细胞双色直接染色细胞T细胞细胞B B细胞细胞细胞细胞荧光免疫显微技术荧光免疫显微技术荧光免疫显微技术荧光免疫显微技术讨论分析讨论分析直方图分析：对细胞的某一个单参直方图分析：对细胞的某一个单参数进行统计分析数进行统计分析横坐标为荧光或散射光强度横坐标为荧光或散射光强度纵坐标为细胞数纵坐标为细胞数荧光免疫显微技术荧光免疫显微技术荧光免疫显微技术荧光免疫显微技术讨论分析讨论分析间间接接免免疫疫荧荧光光法法示示意意图图讨论分析讨论分析v荧光免疫显微技术在医学检验中的应用：细菌检验-细菌培养物、感染组织、病人分泌排泄物等（菌种鉴定）病毒检验-特殊意义亦可检测血清中Ab(间接法)-流行病学调查和临床回顾性诊断寄生虫检验-间接法测Ab,如抗疟Ab、阿米巴Ab等自身Ab检测讨论分析讨论分析配分与评分标准配分与评分标准配分与评分标准配分与评分标准序号序号序号序号考核要点考核要点考核要点考核要点分值分值分值分值评分标准评分标准评分标准评分标准得分得分得分得分1 12 2(1)(1)抗原基质片，平衡抗原基质片，平衡抗原基质片，平衡抗原基质片，平衡至室温至室温至室温至室温(2)(2)记号笔画圈标记记号笔画圈标记记号笔画圈标记记号笔画圈标记 (1)(1)待检血清和对照血待检血清和对照血待检血清和对照血待检血清和对照血清用清用清用清用PBSPBS作作作作1 1 1010稀稀稀稀释释释释 (2)(2)微量加样器微量加样器微量加样器微量加样器50l50l待检待检待检待检血清或对照血清于血清或对照血清于血清或对照血清于血清或对照血清于基质片上基质片上基质片上基质片上 水平置于湿盒中水平置于湿盒中水平置于湿盒中水平置于湿盒中37oC37oC温箱反应温箱反应温箱反应温箱反应30min 30min 1 11 11 11 11 1不符合要求将此分扣除不符合要求将此分扣除不符合要求将此分扣除不符合要求将此分扣除不符合要求将此分扣除不符合要求将此分扣除不符合要求将此分扣除不符合要求将此分扣除考核考核配分与评分标准配分与评分标准配分与评分标准配分与评分标准序号序号序号序号考核要点考核要点考核要点考核要点分分分分值值值值评分标准评分标准评分标准评分标准得分得分得分得分3 3 以以以以PBSPBS冲洗抗原冲洗抗原冲洗抗原冲洗抗原基质片基质片基质片基质片(2)(2)浸于盛有浸于盛有浸于盛有浸于盛有PBSPBS染染染染 色缸中色缸中色缸中色缸中 反复漂洗反复漂洗反复漂洗反复漂洗3 3次次次次 每次每次每次每次5min 5min 1 11 11 1不符合要求将此分扣不符合要求将此分扣不符合要求将此分扣不符合要求将此分扣除除除除考核考核配分与评分标准配分与评分标准配分与评分标准配分与评分标准序号序号序号序号考核要点考核要点考核要点考核要点分分分分值值值值评分标准评分标准评分标准评分标准得分得分得分得分4 4 取出玻片，吹干取出玻片，吹干取出玻片，吹干取出玻片，吹干 (2)(2)加加加加50l50l最适工作最适工作最适工作最适工作浓度的标记抗体浓度的标记抗体浓度的标记抗体浓度的标记抗体 平置于湿盒内，平置于湿盒内，平置于湿盒内，平置于湿盒内，37oC37oC温箱反应温箱反应温箱反应温箱反应30min 30min 1 11 11 1不符合要求将此分扣不符合要求将此分扣不符合要求将此分扣不符合要求将此分扣除除除除考核考核序序序序号号号号考核要点考核要点考核要点考核要点分分分分值值值值评分标准评分标准评分标准评分标准得分得分得分得分5 56 6 重复步骤重复步骤重复步骤重复步骤3 3，洗去未结合洗去未结合洗去未结合洗去未结合的荧光抗体的荧光抗体的荧光抗体的荧光抗体 (1)(1)滴加缓冲甘滴加缓冲甘滴加缓冲甘滴加缓冲甘油封片油封片油封片油封片 用荧光显微镜用荧光显微镜用荧光显微镜用荧光显微镜观察观察观察观察 1 11 11 11 1不符合要求将此分不符合要求将此分不符合要求将此分不符合要求将此分扣除扣除扣除扣除不符合要求将此分不符合要求将此分不符合要求将此分不符合要求将此分扣除扣除扣除扣除考核考核配分与评分标准配分与评分标准配分与评分标准配分与评分标准vv姓名、班级和学号姓名、班级和学号姓名、班级和学号姓名、班级和学号vv实验题目实验题目实验题目实验题目vv实验原理（略写）实验原理（略写）实验原理（略写）实验原理（略写）vv实验操作（略写）实验操作（略写）实验操作（略写）实验操作（略写）vv实验结果实验结果实验结果实验结果 画图画图画图画图 文字描述文字描述文字描述文字描述vv分析和讨论分析和讨论分析和讨论分析和讨论vv思考题思考题思考题思考题实验报告实验报告v此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢