蛋白质的结构、功能及分离纯化.ppt

第四章蛋白质的共价结构蛋白质的共价结构（一）蛋白质的化学组成和分类（一）蛋白质的化学组成和分类1 1、元素组成元素组成 碳碳 50%50%氢氢7%7%氧氧23%23%氮氮16%16%硫硫 0-3%0-3%微量的磷、铁、铜、碘、锌、钼微量的磷、铁、铜、碘、锌、钼 凯氏定氮：粗蛋白质含量凯氏定氮：粗蛋白质含量=蛋白氮蛋白氮6.256.252 2、氨基酸组成氨基酸组成蛋白质是由蛋白质是由2020种种L-L-型型氨基酸组成的长链分子氨基酸组成的长链分子一、一、蛋白质通论蛋白质通论3 3、分类分类（1 1）按组成：按组成：单单纯纯蛋蛋白白质质：只只含含氨氨基基酸酸成成分分；可可以以根根据据其其物物理理性性质质进进行行分类分类缀缀合合蛋蛋白白质质：氨氨基基酸酸 +辅辅基基（配配体体）；可可以以按按其其非非氨氨基基酸酸成分进行分类成分进行分类（2 2）按生物学功能：）按生物学功能：酶、调节蛋白、转运蛋白、贮存蛋白、收缩和游动蛋白、酶、调节蛋白、转运蛋白、贮存蛋白、收缩和游动蛋白、结构蛋白、支架蛋白、保护和开发蛋白、异常蛋白。结构蛋白、支架蛋白、保护和开发蛋白、异常蛋白。（二）（二）蛋白质分子的形状和大蛋白质分子的形状和大小小1 1 形状形状纤维状蛋白质：具有比较简单纤维状蛋白质：具有比较简单球状蛋白质球状蛋白质膜蛋白质膜蛋白质2大小少少于于5050个个氨氨基基酸酸的的低低分分子子量量多多聚聚物物称称为为肽肽，寡寡肽或生物活性肽，有时也称多肽。肽或生物活性肽，有时也称多肽。多于多于5050个氨基酸的称为蛋白质。个氨基酸的称为蛋白质。蛋白质分子量蛋白质分子量 =氨基酸数目氨基酸数目*110110蛋白质都有自己特有的天然空间结构，称为构象。蛋白质都有自己特有的天然空间结构，称为构象。一级结构：氨基酸顺序一级结构：氨基酸顺序二级结构：二级结构：螺旋、螺旋、折叠、折叠、转角，无规卷曲转角，无规卷曲三级结构：三级结构：整个肽链（亚基）的形状；整个肽链（亚基）的形状；四级结构四级结构 ：亚基之间的聚集形式。：亚基之间的聚集形式。（三）（三）蛋白质的构象和蛋白质结构蛋白质的构象和蛋白质结构的组织层次的组织层次（四）蛋白质功能的多样性（四）蛋白质功能的多样性催化酶，生物催化剂调节激素蛋白类，调节体内的物质代谢过程或参与基因表达的调控转运运输蛋白类，通过血流或膜通道转运特定的物质贮存能贮存氨基酸等，作为机体的营养物，在需要时提供各种元素运动使细胞或生物体发生运动结构成分具有强大的抗拉作用，对机体起支持作用支架作用在细胞应答激素和生长因子的途径中起作用防御和进攻在细胞防御、保护和开发方面的主动作用异常功能二二 肽肽肽肽 (peptides)(peptides)是由氨基是由氨基酸通过肽键连接起来的酸通过肽键连接起来的一类有机物。根据其所一类有机物。根据其所含氨基酸残基的数量，含氨基酸残基的数量，有小肽和多肽之分。有小肽和多肽之分。小肽一般是指不到小肽一般是指不到1010个个氨基酸所组成的肽，多氨基酸所组成的肽，多肽一般是指肽一般是指10501050个氨个氨基酸所组成的肽。基酸所组成的肽。（一一）肽肽键键与与肽肽链链肽肽键键：一一个个氨氨基基酸酸的的羧羧基基与与另另一一个个氨氨基基酸酸的的氨氨基基之之间间失失水水形形成成的的酰酰胺胺键键。肽键的特性肽键的特性氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用：氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用：肽肽键键中中的的C-NC-N键键具具有有部部分分双双键键性性质质，不不能能自自由由旋旋转转。在大多数情况下，以反式结构存在。在大多数情况下，以反式结构存在。组成肽键的原子处于同一平面组成肽键的原子处于同一平面-肽平面。肽平面。肽键的结构特点：肽键的结构特点：1.1.酰酰胺胺氮氮上上的的孤孤对对电电子子与与相相邻邻羰羰基基之之间间形形成成共共振振杂杂化体。化体。2.2.肽键具有部分双键性质，不能自由旋转。肽键具有部分双键性质，不能自由旋转。3.3.肽肽键键具具有有平平面面性性，组组成成肽肽键键的的4 4个个原原子子和和2 2个个CC几几乎处在同一平面内（酰氨平面）。乎处在同一平面内（酰氨平面）。4.4.肽键亚氨基在肽键亚氨基在pH0-14pH0-14内不解离。内不解离。5.5.肽肽链链中中的的肽肽键键一一般般是是反反式式构构型型，而而ProPro的的肽肽键键可可能能出现顺、反两种构型出现顺、反两种构型肽肽链链由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个氨基酸由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个氨基酸组成的肽则称为多肽。组成的肽则称为多肽。组成肽链的氨基酸单元称为氨基酸残基。组成肽链的氨基酸单元称为氨基酸残基。肽链中肽链中AA的排列顺序和命名的排列顺序和命名v在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序。为氨基酸顺序。v通常在多肽链的一端含有一个游离的通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基端或氨基，称为氨基端或N-N-端；在另一端含有一个游离的端；在另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基端或羧基，称为羧基端或C-C-端。端。v氨基酸的顺序是从氨基酸的顺序是从N N端的氨基酸残基开始，以端的氨基酸残基开始，以C C端氨基酸残基为端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为：终点的排列顺序。如上述五肽可表示为：Ser-Val-Ser-Val-Tyr-Asp-GlnTyr-Asp-Gln1.1.旋旋光光性性：一一般般短短肽肽的的旋旋光光度度等等于于其其各各个个氨氨基基酸酸的的旋旋光度的总和。光度的总和。2.2.肽的酸碱性质肽的酸碱性质1)1)短肽在晶体和水溶液中也是以偶极离子形式存在。短肽在晶体和水溶液中也是以偶极离子形式存在。2)2)肽肽的的酸酸碱碱性性质质主主要要取取决决于于端端和和端端COOHCOOH以及侧链上可解离的基团。以及侧链上可解离的基团。3)3)在长肽或蛋白质中，可解离的基团主要是侧链基团。在长肽或蛋白质中，可解离的基团主要是侧链基团。（二）肽的物理和化学性质（二）肽的物理和化学性质4）原则：当溶液原则：当溶液pH大于解离侧链的值，占优大于解离侧链的值，占优势势的离子形式是该侧链的共轭碱，当溶液的离子形式是该侧链的共轭碱，当溶液pH小于小于解离侧链的值，占优势的离子形式是该侧链的解离侧链的值，占优势的离子形式是该侧链的共轭酸。共轭酸。3.肽的化学反应：肽的肽的化学反应：肽的-羧基，羧基，-氨基和侧链氨基和侧链R基上的活性基团都能发生与游离氨基酸相似的基上的活性基团都能发生与游离氨基酸相似的反应，如茚三酮反应、反应，如茚三酮反应、Sanger反应、反应、DNS反应反应和和Edman反应；还可发生双缩脲反应（含有两反应；还可发生双缩脲反应（含有两个或两个以上肽键的化合物与个或两个以上肽键的化合物与CuSO4碱性溶液碱性溶液发生反应生成紫红色或蓝紫色的复合物。氨基发生反应生成紫红色或蓝紫色的复合物。氨基酸无该反应）。酸无该反应）。（三）天然存在的活性肽（三）天然存在的活性肽一些小肽在动物体内主要用于合成蛋白质，作为体蛋白的结一些小肽在动物体内主要用于合成蛋白质，作为体蛋白的结构组分，构组分，因而称之为结构肽因而称之为结构肽(structural(structural peptiedspeptieds)。另有一些肽类物质，在体内并非用于合成蛋白质，而是独立另有一些肽类物质，在体内并非用于合成蛋白质，而是独立发挥其特定的生物学功能，一般称之为生物活性肽发挥其特定的生物学功能，一般称之为生物活性肽 （bioactive peptidesbioactive peptides），），简称活性肽；简称活性肽；也称功能肽也称功能肽（functional peptides)functional peptides)。已为人们广泛熟悉的表皮生长因子（已为人们广泛熟悉的表皮生长因子（epidermal growth epidermal growth factor,EGF)factor,EGF)、成纤维细胞生长因子（成纤维细胞生长因子（fibroblast growth fibroblast growth factor,FGFfactor,FGF）、）、类胰岛素生长因子（类胰岛素生长因子（insulin-like growth insulin-like growth factor,IGF)factor,IGF)均为典型的生物活性肽。均为典型的生物活性肽。1谷胱甘肽谷胱甘肽(GSH)GSH的功能的功能SH缓冲剂：保护血液中的红细胞不受缓冲剂：保护血液中的红细胞不受氧化损伤，维持血红素中半胱氨酸处于氧化损伤，维持血红素中半胱氨酸处于还原态还原态解毒作用：解毒作用：GHS可与过氧化氢或其它有可与过氧化氢或其它有机过氧化物反应机过氧化物反应参与氨基酸的转运参与氨基酸的转运2、短杆菌肽（抗生素）短杆菌肽（抗生素）由由短短杆杆菌菌产产生生的的1010肽肽环环。抗抗革革兰兰氏氏阳阳性性细细菌菌，临床用于治疗化浓性病症。临床用于治疗化浓性病症。L-L-OrnOrnL-LeuD-PheL-ProL-ValL-L-LeuD-PheL-ProL-ValL-OrnOrnL-LeuD-Phe L-ProL-Val L-LeuD-Phe L-ProL-Val 3、脑啡肽（脑啡肽（5肽）肽）Met-脑啡肽：脑啡肽：TyrGlyGlyPheMetLeu-脑啡肽：脑啡肽：TyrGlyGlyPheLeu具有镇痛作用。具有镇痛作用。生物体内寡肽的来源：生物体内寡肽的来源：合成蛋白质的剪切、修饰合成蛋白质的剪切、修饰酶专一性逐步合成（如谷胱甘肽）、酶专一性逐步合成（如谷胱甘肽）、动物肠道可吸收寡肽动物肠道可吸收寡肽4 4、肽类激素肽类激素一一级级结结构构：蛋蛋白白质质多多肽肽链链中中氨氨基基酸酸残残基基的的排排列列顺顺序序 表表示示方方法法：N N-末末端端向向C C-末末端端维维持持力力：肽肽 键键、二二硫硫键键三三、蛋蛋白白质质一一级级结结构构的的测测定定（一）（一）蛋白质测序的策略蛋白质测序的策略 对对于于一一个个纯纯蛋蛋白白质质，理理想想方方法法是是从从N N端端直直接接测测至至C C端端，但目前只能测但目前只能测6060个个N N端氨基酸。端氨基酸。1 1、直接法（测蛋白质的序列）、直接法（测蛋白质的序列）两种以上特异性裂解法两种以上特异性裂解法 N N C C A A 法裂解法裂解 A1 A1 A2 A2 A3 A3 A4 A4 B B 法裂解法裂解 B1B1 B2 B2 B3 B3 B4 B4 2 2、间接法（测核酸序列推断氨基酸序列）间接法（测核酸序列推断氨基酸序列）3 测序前的准备工作1）蛋白质的纯度鉴定蛋白质的纯度鉴定纯度纯度97%以上，均一。以上，均一。聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)要求一条带要求一条带DNScl（二甲氨基萘磺酰氯）法测二甲氨基萘磺酰氯）法测N端氨基酸端氨基酸2）测定分子量，估算氨基酸残基数，确定肽链数测定分子量，估算氨基酸残基数，确定肽链数SDS-PAGE凝胶过滤法凝胶过滤法沉降系数法沉降系数法4蛋白质测序的一般步骤蛋白质测序的一般步骤（1 1）测定蛋白质分子中多肽链的数目；测定蛋白质分子中多肽链的数目；（2 2）拆分蛋白质分子中的多肽链；）拆分蛋白质分子中的多肽链；（3 3）断裂链内二硫键；）断裂链内二硫键；（4 4）分析每一多肽链的氨基酸组成；）分析每一多肽链的氨基酸组成；（5 5）鉴定多肽链的）鉴定多肽链的N N末端和末端和C C末端残基；末端残基；（6 6）裂解多肽链成较小的肽段；）裂解多肽链成较小的肽段；（7 7）测定各个肽段的氨基酸顺序；）测定各个肽段的氨基酸顺序；（8 8）确定肽段在多肽链中的顺序；）确定肽段在多肽链中的顺序；（9 9）确定多肽链中二硫键的位置。）确定多肽链中二硫键的位置。（二）（二）N末末端和端和C-末端氨基酸残基的鉴定末端氨基酸残基的鉴定1N-末端分析末端分析DNS-cl法法：最最常常用用，黄黄色色荧荧光光，灵灵敏敏度度极极高高，DNS-多多肽肽水水解解后后的的DNS-氨基酸不需要提取。氨基酸不需要提取。DNFB法法：Sanger试试剂剂，DNP-多多肽肽，酸酸水水解解，黄黄色色DNP-氨氨基基酸酸，有机溶剂（乙酸乙酯）抽提分离，纸层析、薄层层析、液相等有机溶剂（乙酸乙酯）抽提分离，纸层析、薄层层析、液相等PITC法：法：Edman法，逐步切下。无色法，逐步切下。无色PTH-氨基酸，有机溶剂抽氨基酸，有机溶剂抽提，层析。提，层析。2C-末端分析末端分析肼解法肼解法无水肼无水肼NH2NH21005-10h。苯苯甲甲醛醛沉沉淀淀氨氨基基酸酸的的酰酰肼肼，C端端游游离离氨氨基基酸酸留留在在上上清清中。中。Gln、Asn、Cys、Arg不能用此法。不能用此法。羧肽酶法（羧肽酶法（ProPro不能测）不能测）羧肽酶羧肽酶A A：除：除ProPro、ArgArg、LysLys外的所有外的所有C C端端a.aa.a羧肽酶羧肽酶B B：只水解只水解ArgArg、LysLys N H N H2 2N ValSerGly CN ValSerGly C图图P118羧肽酶法测羧肽酶法测C末端末端（三）二硫桥的断裂 过甲酸氧化：过甲酸氧化：SS+HCOOOH SOSS+HCOOOH SO3 3H H 巯基乙醇还原巯基乙醇还原（四）氨基酸组成的分析 酸水解的同时辅以碱水解酸水解的同时辅以碱水解（五五）多多肽肽链链的的部部分分裂裂解解和和肽肽段段混混合合物物的的分离纯化分离纯化1酶裂解法酶裂解法1）胰蛋白酶）胰蛋白酶LysX(XPro)ArgX2）胰凝乳蛋白酶）胰凝乳蛋白酶TyrX(XPro)TrpXPheX3）嗜热菌蛋白酶）嗜热菌蛋白酶Leu(Trp、Try、Phe）X(XPro/Gly)4）胃蛋白酶）胃蛋白酶Phe(Trp、Try、Leu)Phe(Trp、Try、Leu)2 2 化学裂解法化学裂解法 溴化氰溴化氰 MetX MetX 产率产率85%85%亚碘酰基苯甲酸亚碘酰基苯甲酸 TrpTrpX X 产率产率70-100%70-100%NTCB NTCB（2-2-硝基硝基-5-5-硫氰苯甲酸）硫氰苯甲酸）XXCysCys 羟胺羟胺NHNH2 2OH OH AsnAsnGlyGly 约约150150个氨基酸出现一次个氨基酸出现一次3、肽段的分离纯化肽段的分离纯化电泳法电泳法根据分子量大小分离根据分子量大小分离离子交换层析法（离子交换层析法（DEAECellulose、DEAESephadex）根据肽段的电荷特性分离根据肽段的电荷特性分离反相法反相法根据肽段的极性分离根据肽段的极性分离凝胶过滤凝胶过滤要求：要求：单带单带单峰单峰端单一（常用端单一（常用cl法）法）四四蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构与生物功能与生物功能（一）（一）同源蛋白质的物种差异与生物进化同源蛋白质的物种差异与生物进化1同源蛋白质：同源蛋白质：在不同的生物体内行使相同或相似功能的蛋白质。在不同的生物体内行使相同或相似功能的蛋白质。如如：血血红红蛋蛋白白在在不不同同的的脊脊椎椎动动物物中中都都具具有有输输送送氧氧气气的的功功能能，细胞色素在所有的生物中都是电子传递链的组分。细胞色素在所有的生物中都是电子传递链的组分。通通过过比比较较同同源源蛋蛋白白质质的的氨氨基基酸酸序序列列的的差差异异可可以以研研究究不不同同物物种种间的亲源关系和进化。间的亲源关系和进化。亲源关系越远，同源蛋白的氨基酸顺序差异就越大。亲源关系越远，同源蛋白的氨基酸顺序差异就越大。同源蛋白质的特点：同源蛋白质的特点：同同源源蛋蛋白白质质的的氨氨基基酸酸序序列列具具有有明明显显的的相相似似性性（序序列列同同源性）源性）有有许许多多位位置置的的氨氨基基酸酸对对所所有有种种属属来来说说都都是是相相同同的的，称称不变残基，不变残基高度保守，是必需的。不变残基，不变残基高度保守，是必需的。除除不不变变残残基基以以外外，其其它它位位置置的的氨氨基基酸酸对对不不同同的的种种属属有有很很大大变变化化，称称可可变变残残基基，可可变变残残基基中中，个个别别氨氨基基酸酸的的变变化不影响蛋白质的功能。化不影响蛋白质的功能。多肽链长度相同或相近多肽链长度相同或相近2细胞色素细胞色素C分子量：分子量：12500左右左右氨基酸残基：氨基酸残基：100个左右，单链。个左右，单链。25种生物中，细胞色素种生物中，细胞色素C的不变残基的不变残基35个。个。60种生物中，细胞色素种生物中，细胞色素C的不变残基的不变残基27个。个。亲源关系越近的，其细胞色素亲源关系越近的，其细胞色素C的差异越小。的差异越小。亲源关系越远的，其细胞色素亲源关系越远的，其细胞色素C的差异越大。的差异越大。人与黑猩猩人与黑猩猩0人与猴人与猴1人与狗人与狗10人与酵母人与酵母44细胞色素细胞色素C功能功能:传递电子传递电子多肽链，血红多肽链，血红素，铁原子素，铁原子胰岛素胰岛素有有24个个氨氨基基酸酸残残基基位位置置始始终终不不变变：AB链链上上6个个Cys不不变变，其其余余18个个氨氨基基酸酸多多数数为为非非极极性性侧侧链链，对对稳稳定定蛋蛋白白质质的的空空间间结结构构起重要作用。起重要作用。其其它它可可变变氨氨基基酸酸对对稳稳定定蛋蛋白白质质的的空空间间结结构构作作用用不不大大，但但对对免免疫疫反应起作用。反应起作用。猪猪与与人人接接近近，而而狗狗则则与与人人不不同同，因因此此可可用用猪猪的的胰胰岛岛素素治治疗疗人人的的糖尿病。糖尿病。3系系统统树树（二）（二）同源蛋白质具有共同的进化起源同源蛋白质具有共同的进化起源1 1 氧合血红素蛋白质氧合血红素蛋白质2 2丝氨酸蛋白酶类丝氨酸蛋白酶类3 3 功能差异很大的蛋白质功能差异很大的蛋白质（三）（三）血液凝固血液凝固与氨基酸序列的局部断裂与氨基酸序列的局部断裂1 1、血液凝固中的级联过程血液凝固中的级联过程2 凝血酶和血纤蛋白原在血凝中的作用凝血酶和血纤蛋白原在血凝中的作用在在凝凝血血酶酶原原致致活活因因子子催催化化下下，凝凝血血酶酶原原分分 子子 中中 的的 Arg274Thr275Arg274Thr275、Arg323Arg323Ile324Ile324断断裂裂，释释放放出出4848个个a.aa.a，产产生生活活性凝血酶。性凝血酶。A A链链49 a.a49 a.a B B链链259 a.a259 a.a纤维蛋白原纤维蛋白原 2 22 2r r2 2从从二二条条链链和和二二条条链链的的N N端端各各断断裂裂一一个个特特定定的的肽肽键键-ArgArgGly-Gly-，释释放放出出二二个个纤纤维维肽肽A A（1919个个氨氨基基酸酸）和和二二个个纤纤维维肽肽B B（2121个氨基酸），它们含有较多的酸性氨基酸残基。个氨基酸），它们含有较多的酸性氨基酸残基。A、B肽肽切切除除后后，减减少少了了蛋蛋白白质质分分子子的的负负电电荷荷，促促进进分分子子间间聚聚集集，形成网状结构。形成网状结构。在凝血因子在凝血因子XIIIa（纤维蛋白稳定因子）催化下，纤维蛋白质单纤维蛋白稳定因子）催化下，纤维蛋白质单体间形成共价健（体间形成共价健（Gln-Lys结合），生成交联的纤维蛋白。结合），生成交联的纤维蛋白。五、五、肽和蛋白质的人工合成肽和蛋白质的人工合成氨基保护：叔丁氧甲酰氯（氨基保护：叔丁氧甲酰氯（BOC-Cl）、）、苄苄氧酰氯（氧酰氯（CBZ-Cl）、）、对甲苯磺酰氯对甲苯磺酰氯Tosyl-Cl）;羧基保护：苄酯、叔丁酯（成盐、成酯）羧基保护：苄酯、叔丁酯（成盐、成酯）;羧基活化：酰氯法（羧基活化：酰氯法（PCL5）、）、叠氮法、混叠氮法、混合酸酐法、活化酯法合酸酐法、活化酯法;缩合剂：缩合剂：DCCI（二环己基碳二亚胺）直接二环己基碳二亚胺）直接接肽。接肽。第第5章章蛋白质的三维结构蛋白质的三维结构决定蛋白质天然构象的决定蛋白质天然构象的3个因素个因素:1)与溶剂分子的相互作与溶剂分子的相互作用用;2)溶剂的溶剂的pH和离子强度和离子强度;3)蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列.每一种蛋白质都具有唯一的氨基酸序列，实际上蛋白质每一种蛋白质都具有唯一的氨基酸序列，实际上蛋白质的氨基酸序列是由的氨基酸序列是由DNA决定的。蛋白质的氨基酸序列具决定的。蛋白质的氨基酸序列具有重要意义：有重要意义：蛋白质的氨基酸序列是阐明蛋白质生物活性的分子基蛋白质的氨基酸序列是阐明蛋白质生物活性的分子基础；础；蛋白质的一级结构决定它的空间结构；蛋白质的一级结构决定它的空间结构；氨基酸序列的改变可以导致蛋白功能异常和疾病；氨基酸序列的改变可以导致蛋白功能异常和疾病；通过对一些蛋白质的氨基酸序列的比较可以反应出通过对一些蛋白质的氨基酸序列的比较可以反应出一些生物亲缘关系。一些生物亲缘关系。一一 研究蛋白质构象的方法研究蛋白质构象的方法X射线衍射法射线衍射法光谱学方法光谱学方法 紫外差光谱紫外差光谱 荧光和荧光偏振荧光和荧光偏振 圆二色性圆二色性 核磁共振核磁共振二二稳定蛋白质三维结构的作用力稳定蛋白质三维结构的作用力蛋白质的折叠和具有生物学功能的蛋白质构象的稳定性依赖于大量的非共价因素，其中包括疏水效应、氢键、范德华力（van der Waals）和离子间相互作用；以及共价交联（二硫键）。（一）（一）氢氢 键键 氢键的贡献是协同蛋白质的折叠和帮助稳定球蛋氢键的贡献是协同蛋白质的折叠和帮助稳定球蛋白的天然构象。前面已经提到多肽链骨架的羰基和酰白的天然构象。前面已经提到多肽链骨架的羰基和酰胺基之间，特别是在球蛋白内部的那些基团之间常常胺基之间，特别是在球蛋白内部的那些基团之间常常形成氢键使肽链形成形成氢键使肽链形成a-螺旋和螺旋和b-折叠结构。此外在多折叠结构。此外在多肽链骨架和水之间，多肽链骨架和极性侧链之间，两肽链骨架和水之间，多肽链骨架和极性侧链之间，两个极性侧链之间以及极性侧链和水之间也可以形成氢个极性侧链之间以及极性侧链和水之间也可以形成氢键。大多数氢键都是键。大多数氢键都是N-HO类型的。类型的。蛋白质结构中常见的氢键蛋白质结构中常见的氢键（二）范德华力（二）范德华力范德华力包括吸引力和斥力两种相互作用，范德范德华力包括吸引力和斥力两种相互作用，范德华力只有当两个非极性残基之间处于一定距离华力只有当两个非极性残基之间处于一定距离时才能达到最大。虽然范德华力相对来说比较时才能达到最大。虽然范德华力相对来说比较弱，但由于范德华力相互作用数量大，并且具弱，但由于范德华力相互作用数量大，并且具有加和性，因此范德华力对球蛋白的稳定性也有加和性，因此范德华力对球蛋白的稳定性也有贡献。有贡献。（三）（三）疏水相互作用疏水相互作用蛋白质中的疏水基团彼此靠近、聚集以避开蛋白质中的疏水基团彼此靠近、聚集以避开水的现象称之疏水相互作用（水的现象称之疏水相互作用（hydrophobic 0interaction）或疏水效应（或疏水效应（hydrophobic effect）。）。疏水相互作用在维持蛋白质构象中疏水相互作用在维持蛋白质构象中起着主要的作用，因为水分子彼此之间的相互起着主要的作用，因为水分子彼此之间的相互作用要比水与其它非极性分子的作用更强烈，作用要比水与其它非极性分子的作用更强烈，非极性侧链避开水聚集被压迫到蛋白质分子内非极性侧链避开水聚集被压迫到蛋白质分子内部，而大多数极性侧链在蛋白质表面维持着与部，而大多数极性侧链在蛋白质表面维持着与水的接触。水的接触。（四）盐（四）盐 键键带有相反电荷的侧链之间的离子相互带有相反电荷的侧链之间的离子相互作用也能帮助稳定球蛋白，虽然这种作用作用也能帮助稳定球蛋白，虽然这种作用很弱。离子化的侧链一般都出现在球蛋白很弱。离子化的侧链一般都出现在球蛋白的表面，所以是溶剂化的，对于整个球蛋的表面，所以是溶剂化的，对于整个球蛋白的稳定性的贡献是最小的。白的稳定性的贡献是最小的。盐盐 键键（五）二 硫 键除了氢键以外，共价交联，例如二硫键也有助于除了氢键以外，共价交联，例如二硫键也有助于某些球蛋白的天然构象的稳定，二硫键有时存某些球蛋白的天然构象的稳定，二硫键有时存在于由细胞分泌的蛋白质中，当这样的蛋白质在于由细胞分泌的蛋白质中，当这样的蛋白质离开细胞内环境时，由于有二硫键的存在，可离开细胞内环境时，由于有二硫键的存在，可使得蛋白质对去折叠以及降解不那么敏感，而使得蛋白质对去折叠以及降解不那么敏感，而维持蛋白质的稳定。维持蛋白质的稳定。二二 硫硫 键键三三多肽主链折叠的空间限制多肽主链折叠的空间限制氨基酸残基是通过肽键连接形成线性的多肽链的，一个氨基酸残基是通过肽键连接形成线性的多肽链的，一个多肽链的骨架是由通过肽键连接的重复单位多肽链的骨架是由通过肽键连接的重复单位N-C-C组组成的，酰胺氢和羰基氧结合在骨架上，而不同氨基酸成的，酰胺氢和羰基氧结合在骨架上，而不同氨基酸残基的侧链连接在残基的侧链连接在-碳上。碳上。酰胺平面酰胺平面参与肽键形成的参与肽键形成的2个原子个原子以及另外以及另外4个取代成员：个取代成员：羰基氧原子、酰胺氢原羰基氧原子、酰胺氢原子、以及子、以及2个相邻的个相邻的-碳原子构成了一个肽单碳原子构成了一个肽单位。位。肽键的部分双键特性防碍肽键的部分双键特性防碍了了C-N键的旋转，其结键的旋转，其结果造成肽单位实际上是果造成肽单位实际上是个平面个平面-酰胺平面。酰胺平面。由于连接在两个由于连接在两个-碳上的侧链基团之间的立体干碳上的侧链基团之间的立体干扰，不利于顺式构象的形成，对伸展的反式构象扰，不利于顺式构象的形成，对伸展的反式构象的形成有利，因此蛋白质中几乎所有的肽单位都的形成有利，因此蛋白质中几乎所有的肽单位都是反式构象。是反式构象。二面角（二面角（dihedralangle)一个蛋白质的构象取决一个蛋白质的构象取决于肽单位绕于肽单位绕N-C 键和键和C-C键的旋转，旋键的旋转，旋转本身受到肽链的主转本身受到肽链的主链和相邻残基的侧链链和相邻残基的侧链原子之间的立体干扰原子之间的立体干扰的限制。的限制。一个肽平面绕一个肽平面绕N-C 键旋转的角度用键旋转的角度用F F表示，而绕表示，而绕C-键旋转的角度用键旋转的角度用Y Y表示，顺时针方向为正，表示，顺时针方向为正，反时针为负，理论上反时针为负，理论上F(F(fai)和和Y(Y(fai)可以取可以取180至至180之间的任一个角度。当包含之间的任一个角度。当包含a的的两个肽键处于同一平面时，两个肽键处于同一平面时，F F和和Y Y都定义为都定义为0。四四二级结构：二级结构：肽主链折叠的规则方式肽主链折叠的规则方式早在早在1951年，年，Pauling和和Corey根据对一些简单根据对一些简单化合物，例如氨基酸、化合物，例如氨基酸、二肽以及三肽的二肽以及三肽的X-射线射线晶体图的研究数据，提晶体图的研究数据，提出了两个周期性的多肽出了两个周期性的多肽结构：结构：-螺旋（螺旋（a-helix）和）和b b-折叠（折叠（b-sheet）结构，它们是许结构，它们是许多纤维蛋白和球蛋白的多纤维蛋白和球蛋白的主要的二级结构。主要的二级结构。（一）（一）-螺旋螺旋在一个理想的在一个理想的-螺旋螺旋中，每一个氨基酸中，每一个氨基酸残基绕螺旋轴上升残基绕螺旋轴上升了了0.15nm，每圈螺每圈螺旋需要旋需要3.6个氨基酸个氨基酸残基（一个羰基、残基（一个羰基、3个个N-Ca-C单位和单位和一个氮），它们绕一个氮），它们绕螺旋轴上升的距离，螺旋轴上升的距离，即螺距为即螺距为0.54nm。在在-螺旋中，螺旋中，相邻相邻的螺圈之间形成链的螺圈之间形成链内氢键，内氢键，多肽链骨多肽链骨架的每个羰基氧架的每个羰基氧（氨基酸残基（氨基酸残基n）与它后面与它后面C-端方端方向的第四个残基向的第四个残基（n4）的）的-氨氨基氮形成氢键，螺基氮形成氢键，螺旋内的氢键几乎平旋内的氢键几乎平行于螺旋的长轴，行于螺旋的长轴，所有的羰基都指向所有的羰基都指向C-末端。末端。影响影响-螺旋形成的原因螺旋形成的原因氨基酸组成与序列氨基酸组成与序列多多肽肽链链上上连连续续出出现现带带同同种种电电荷荷基基团团的的氨氨基基酸酸残残基基,(如如Lys，或或Asp，或或Glu)，不不能能形形成成稳稳定定的的螺螺旋旋。如如多多聚聚Lys、多聚、多聚Glu。Gly在肽中连续存在时，不易形成在肽中连续存在时，不易形成螺旋。螺旋。R基大（如基大（如Ile）不易形成）不易形成螺旋螺旋Pro、脯氨酸中止、脯氨酸中止螺旋。螺旋。R基基较较小小，且且不不带带电电荷荷的的氨氨基基酸酸利利于于螺螺旋旋的的形形成成。如如多聚丙氨酸在多聚丙氨酸在pH7的水溶液中自发卷曲成的水溶液中自发卷曲成螺旋。螺旋。pH对对螺旋的影响螺旋的影响右手右手-螺旋与左手螺旋与左手-螺旋螺旋右手螺旋比左手螺旋稳定。右手螺旋比左手螺旋稳定。蛋白质中的蛋白质中的-螺旋几乎都螺旋几乎都是右手，但在嗜热菌蛋是右手，但在嗜热菌蛋白酶中有很短的一段左白酶中有很短的一段左手手螺旋，螺旋，由由Asp-Asn-Gly-Gly（226-229）组成组成（+64、+42）。）。（二）（二）b b-折叠片折叠片Pauling和和Corey提提出的出的b b-折叠结构，折叠结构，是一种由伸展的多是一种由伸展的多肽链（称之肽链（称之b b链）链）组成的二级结构。组成的二级结构。b b-折叠又分为平行折叠又分为平行式（所有肽链的式（所有肽链的N端都在同一方向）端都在同一方向）和反平行式（肽链和反平行式（肽链N端一反一正）。端一反一正）。（1）氢氢键键与与肽肽链链的的长长轴轴接接近近垂直。垂直。（2）多多肽肽主主链链呈呈锯锯齿齿状状折折叠叠构象构象（3）侧侧链链R基基交交替替地地分分布布在在片层平面的两侧。片层平面的两侧。在在-螺旋中，每一个氨基酸螺旋中，每一个氨基酸残基绕轴上升残基绕轴上升0.15nm，但但在在b b-构象中，每个残基大构象中，每个残基大约占约占0.320.34nm，羰基羰基氧和酰胺氢之间的氢键起氧和酰胺氢之间的氢键起着稳定着稳定b b-折叠结构的作用。折叠结构的作用。（三）（三）转角及其它转角及其它除除-螺旋和螺旋和b b-折叠结折叠结构之外，球蛋白还含构之外，球蛋白还含有一些非重复的三维有一些非重复的三维结构区。非重复区一结构区。非重复区一般是由般是由2至至16个氨基个氨基酸残基组成，这些非酸残基组成，这些非重复区可以连接二级重复区可以连接二级结构和环（结构和环（loop）处处改变肽链折叠的方向，改变肽链折叠的方向，使得蛋白质最终呈现使得蛋白质最终呈现球形。球形。转角转角 由由多多肽肽链链上上4 4个个连连续续的的氨氨基基酸酸残残基基组组成成；主主链链骨骨架架以以1801800 0返返回回折折叠叠；第第一一个个肽肽单单位位上上的的羰羰基基氧氧原原子子与与第第三三个个肽肽单单位位上上的的亚亚氨氨基基氢氢原原子子生生成成一一个个氢氢键。键。发夹发夹由一条伸展的多肽链由一条伸展的多肽链弯曲而成的两条等弯曲而成的两条等长、彼此相邻、反长、彼此相邻、反向平行的肽段；两向平行的肽段；两条肽段依靠氢键联条肽段依靠氢键联系，氢键有系，氢键有16个；个；此构象包含此构象包含1011个氨基酸残基。个氨基酸残基。无规卷曲无规卷曲没有规律的多肽链主链骨架构象。没有规律的多肽链主链骨架构象。往往与生物活性有关往往与生物活性有关-螺螺旋旋，-转转角角，-折折叠叠在在拉拉氏氏图图上上有有固固定定位位置置，而而无无规规卷曲的卷曲的、二面角可存在于所有允许区域内。二面角可存在于所有允许区域内。大多数蛋白质可以分为两种主要类型：纤维蛋白大多数蛋白质可以分为两种主要类型：纤维蛋白（Fibrous proteins）和球蛋白（和球蛋白（globular proteins）。）。一般来说纤维蛋白的特性通过它的二级一般来说纤维蛋白的特性通过它的二级结构就可表现出来，但球蛋白的生物学功能通常都是结构就可表现出来，但球蛋白的生物学功能通常都是以三级结构表现出来的，而某些球蛋白的生物学活性以三级结构表现出来的，而某些球蛋白的生物学活性则需要四级结构。则需要四级结构。纤维蛋白的主要功能是维持和支撑单个的细胞和整个纤维蛋白的主要功能是维持和支撑单个的细胞和整个的有机体。的有机体。-角蛋白和胶原蛋白是最常见的纤维蛋白，角蛋白和胶原蛋白是最常见的纤维蛋白，-角蛋白是毛发和动物尾巴的主要成分，而胶原蛋白角蛋白是毛发和动物尾巴的主要成分，而胶原蛋白是腱、皮肤、骨骼和牙齿的主要蛋白成分。是腱、皮肤、骨骼和牙齿的主要蛋白成分。大多数球蛋白是水溶性的、多肽链紧密折叠、轮廓上大多数球蛋白是水溶性的、多肽链紧密折叠、轮廓上象一个球型的大分子。球蛋白典型特征是它有一个疏象一个球型的大分子。球蛋白典型特征是它有一个疏水的内部环境和一个亲水的表面水的内部环境和一个亲水的表面.五五 纤维状蛋白质纤维状蛋白质纤纤维维蛋蛋白白：是是动动物物体体的的基基本本支支架架和和外外保保护护成分。分子对称性差，分子轴比大于成分。分子对称性差，分子轴比大于10。可溶性：肌球蛋白可溶性：肌球蛋白纤维蛋白质纤维蛋白质不溶性：角蛋白不溶性：角蛋白胶原蛋白胶原蛋白弹性蛋白弹性蛋白球球状状蛋蛋白白：具具有有多多种种多多样样的的生生物物功功能能。分分子子对对称称性性佳佳，分分子子轴轴比比小小于于10。溶溶解解度度较好。较好。（一）（一）-角蛋角蛋白白（二）丝（二）丝心心蛋白与蛋白与折叠折叠（三）胶原蛋白（三）胶原蛋白-三股螺旋三股螺旋结构特征结构特征肽链的氨基酸顺序多肽链的氨基酸顺序多为为(Gly-x-y)，其中，其中x残基往往是残基往往是Pro，y残基往往是残基往往是Hyp，因此不可能形成，因此不可能形成螺旋或螺旋或折叠。折叠。三股左手螺旋平行排三股左手螺旋平行排列，相互绞合，生列，相互绞合，生成右手螺旋。各肽成右手螺旋。各肽链借助链借助Gly残基的残基的肽键之间形成氢键肽键之间形成氢键而交联在一起。而交联在一起。六六超二级结构和结构域超二级结构和结构域蛋白质分子中存在的由若干相邻的二级蛋白质分子中存在的由若干相邻的二级结构单元按一定规律组合在一起，形成结构单元按一定规律组合在一起，形成在空间上可彼此区别的结构单位在空间上可彼此区别的结构单位充当更高层次结构的构件，与空间结构充当更高层次结构的构件，与空间结构的运动性有密切关系的运动性有密切关系超二级结构超二级结构 也称之基元（motifs），是二级结构的组合结构。这类结构存在于大量的各种不同的蛋白质结构中。超二级结构可能具有一种特定的功能或是作为大的功能单位结构域的一部分。在二级或超二级结构在二级或超二级结构基础上形成的特定区基础上形成的特定区域，参与蛋白质结构域，参与蛋白质结构的装配，并与蛋白质的装配，并与蛋白质的许多功能，如分子的许多功能，如分子间的识别和相互作用间的识别和相互作用等有密切关系等有密切关系折叠单位折叠单位 功能单位功能单位 运动性运动性结构域结构域EFEF手手：钙钙结结合合蛋蛋白白中中，含含 有有 Helix-Loop-Helix-Loop-LelixLelix结构结构锌锌指指：DNADNA结结合合蛋蛋白白中中，2 2个个HisHis、2 2个个CysCys结结合合一一个个ZnZn亮亮氨氨酸酸拉拉链链：DNADNA结结合合蛋蛋白白中中，由由亮亮氨氨酸酸侧侧链链形形成的拉链式结构成的拉链式结构七七球状蛋白质与三级结构球状蛋白质与三级结构三级结构是由一三级结构是由一个已经具有了个已经具有了某些某些-螺旋和螺旋和/或或折叠区折叠区的多肽链折叠的多肽链折叠成一个紧密包成一个紧密包裹的、几乎成裹的、几乎成球形的空间结球形的空间结构，或称为天构，或称为天然构象。然构象。（一）球状蛋白质的分类（一）球状蛋白质的分类（二）球状蛋白质三维结构的特征（二）球状蛋白质三维结构的特征 1 含多种二级结构单元含多种二级结构单元2 具有明显的折叠层次具有明显的折叠层次3紧密的球状或椭球状实体紧密的球状或椭球状实体4疏水侧链埋藏在分子内部，疏水侧链埋藏在分子内部，亲水侧链暴露在分子表面亲水侧链暴露在分子表面5 表面的空穴是活性部位