荧光定量PCR原理-扩增曲线.ppt

荧光定量荧光定量PCR技术专题技术专题内容概要内容概要1荧光定量荧光定量PCR的原理的原理1荧光定量荧光定量PCR的标记方法的标记方法1荧光定量荧光定量PCR解析方法解析方法1 SYBR法实验流程及注意事项法实验流程及注意事项1TIANGEN公司荧光定量产品选择指南公司荧光定量产品选择指南实时定量实时定量PCR技术：技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析与常规与常规PCR技术比较：技术比较：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测荧光定量荧光定量PCR原理原理定义定义+扩增曲线扩增曲线+荧光阈值荧光阈值+Ct值值荧光定量荧光定量PCR原理原理常用名词概念常用名词概念Cycle（循环数）（循环数）Rn（荧光强度）（荧光强度）BaselineLogliner phaseLogliner phase荧光基团荧光检测元件荧光定量荧光定量PCR原理原理扩增曲线扩增曲线Cycle（循环数）（循环数）Rn（荧光强度）（荧光强度）BaselineLogliner phaseLogliner phase1 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline）1 荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍1 手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段1 真正的信号:荧光信号超过域值Threshold荧光定量荧光定量PCR原理原理荧光域值荧光域值Ct值的定义：值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数Cycle（循环数）（循环数）Rn（荧光强度）（荧光强度）Ct value 荧光定量荧光定量PCR原理原理CtCt值值Cycle numberCk 104Ck 102SampleLog of DNA concentration0 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。0 Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。荧光定量荧光定量PCR原理原理CtCt值与模板起始量的关系值与模板起始量的关系线性关系、扩增效率确认线性关系、扩增效率确认检测灵敏度确认检测灵敏度确认No template control确认确认PCR扩增效率（扩增效率（E）35Cycles内可得到好的定量结果内可得到好的定量结果如果采用如果采用SYBR检测方法，检测方法，30Cycles内无非特异性产物扩增内无非特异性产物扩增35 Cycles内无引物二聚体产生内无引物二聚体产生相关系数（相关系数（r2）：大于）：大于0.98荧光定量荧光定量PCR反应性的确认反应性的确认.定性分析研究：定性分析研究：杂合或纯合子鉴定，（SNPs）分析等.绝对定量研究：绝对定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷贝数定量，GMO定量检测等.相对定量研究：相对定量研究：mRNA表达量分析，siRNA效果确认，基因芯片结果验证，差异显示结果验证等荧光定量荧光定量PCR技术的应用技术的应用内容概要内容概要1荧光定量荧光定量PCR的原理的原理1荧光定量荧光定量PCR的标记方法的标记方法1荧光定量荧光定量PCR的解析方法的解析方法1 SYBR法实验流程及注意事项法实验流程及注意事项1 TIANGEN公司荧光定量产品选择指南公司荧光定量产品选择指南非特异性荧光标记非特异性荧光标记 SYBR Green I特异性荧光标记特异性荧光标记 TaqMan Probe常用荧光标记方法常用荧光标记方法SYBRGreenI染料法染料法原理原理 SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。SYBR Green ISYBR Green I热热热热 变变变变 性性性性引物退火引物退火引物退火引物退火延伸反应延伸反应延伸反应延伸反应SYBRGreenI染料法染料法作用机理作用机理问题点：问题点：SYBRGreenI与双链与双链DNA进行结合后散发荧光，因此如进行结合后散发荧光，因此如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。SYBRGreenI染料法染料法问题点与关键点问题点与关键点关键点：关键点：设计合适引物，防止非特异性扩增！设计合适引物，防止非特异性扩增！将温度与荧光强度的变化求导将温度与荧光强度的变化求导将温度与荧光强度的变化求导将温度与荧光强度的变化求导(-dI/dT)(-dI/dT)原始图谱原始图谱对数图谱对数图谱SYBRGreenI染料法染料法融解曲线融解曲线融解曲线分析，单一峰融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光无非特异性荧光定量准确定量准确融解曲线分析，出现杂峰融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确光，因此定量不准确SYBRGreenI染料法染料法融解曲线融解曲线%对对DNA模板没有选择性模板没有选择性适用于任何适用于任何DNA%使用方便，不必设计复杂使用方便，不必设计复杂探针探针%具有价格优势具有价格优势优优点点%容易与非特异性双链容易与非特异性双链DNA结合，结合，产生假阳性产生假阳性但可以通过融解曲线但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件的分析，优化反应条件%对引物特异性要求较高对引物特异性要求较高%不能进行多重定量不能进行多重定量缺缺 点点SYBRGreenI染料法染料法优缺点优缺点Taqman探针法探针法原理原理+5端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等+3端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)+探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光+Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针Taqman探针法探针法工作机理工作机理热变性热变性热变性热变性引物和探针与模板退火引物和探针与模板退火引物和探针与模板退火引物和探针与模板退火延伸反应延伸反应延伸反应延伸反应探针探针探针探针报告基团报告基团报告基团报告基团淬灭基团淬灭基团淬灭基团淬灭基团探针探针探针探针DNADNA聚合聚合聚合聚合酶酶酶酶引物引物引物引物R RR RR RR R1、引物、探针的设计：、引物、探针的设计：探针Tm为68-70，30 bp,5不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段400 bp，引物Tm为59-60 2、反应参数的确定：、反应参数的确定：一般为：94，10-20S 60，30-60S（Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高），也可通过温度梯度优化退火温度 3、优化引物和探针浓度：获得最小、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号值，最大信号/背景比值背景比值 引物浓度：50-900nM 探针浓度：50-250nM4、其他与常规、其他与常规PCR相同相同Taqman探针法探针法PCR体系的建立体系的建立3 3 3 3 淬灭基淬灭基淬灭基淬灭基团团团团淬灭基团性质淬灭基团性质淬灭基团性质淬灭基团性质建议使用的建议使用的建议使用的建议使用的5 5 5 5 报告基团报告基团报告基团报告基团TAMRATAMRATAMRATAMRA荧光物质荧光物质荧光物质荧光物质FAM,HEX,TET,JOEFAM,HEX,TET,JOEFAM,HEX,TET,JOEFAM,HEX,TET,JOE等等等等EclipseEclipseEclipseEclipse非荧光物质非荧光物质非荧光物质非荧光物质FAM,HEX,TET,FAM,HEX,TET,FAM,HEX,TET,FAM,HEX,TET,JOE,TAMRA,ROXJOE,TAMRA,ROXJOE,TAMRA,ROXJOE,TAMRA,ROX等等等等Taqman探针法探针法荧光标记物的选择荧光标记物的选择%高度特异性高度特异性%重复性好重复性好%可进行多重定量可进行多重定量优优 点点%只适合一个特定的目标只适合一个特定的目标%委托公司标记，价格较高委托公司标记，价格较高%不易找到本底低的探针不易找到本底低的探针缺缺 点点Taqman探针法探针法优缺点优缺点不同定量方法的比较不同定量方法的比较方法方法优点优点缺点缺点适用范围适用范围SYBR Green I SYBR Green I 方法方法适用性广适用性广灵敏灵敏方便方便便宜便宜引物要求高引物要求高易出现非特异性带易出现非特异性带不能进行多重定量不能进行多重定量适合科研中对各种目的适合科研中对各种目的基因定量分析，基因表基因定量分析，基因表达量的研究，转基因重达量的研究，转基因重组动植物的研究组动植物的研究TaqMan TaqMan 方法方法特异性高特异性高重复性好重复性好多重定量多重定量价格高价格高只适合特定目标只适合特定目标病原体检测，疾病耐药病原体检测，疾病耐药基因研究基因研究,药物疗效考核药物疗效考核遗传疾病的诊断遗传疾病的诊断内容概要内容概要1荧光定量荧光定量PCR原理原理1荧光定量荧光定量PCR的标记方法的标记方法1荧光定量荧光定量PCR的解析方法的解析方法1 SYBR法实验流程及注意事项法实验流程及注意事项1 TIANGEN公司荧光定量产品选择指南公司荧光定量产品选择指南绝对定量解析方法绝对定量解析方法Sample25绝对定量的定义绝对定量的定义0 Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品 可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系0 根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量质粒标准品的制备质粒标准品的制备PCR目的基因克隆目的基因克隆质粒提取，质粒提取，质粒提取，质粒提取，ODOD值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用用用用目的基因目的基因目的基因目的基因目的基因目的基因目的基因目的基因目的基因目的基因目的基因目的基因质粒质粒目的基因目的基因目的基因目的基因基因组基因组DNA拷贝数的计算：拷贝数的计算：待测样本浓度（ng/ul）OD26040稀释倍数样本分子量=碱基数324待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量61014倍比梯度稀释方法：倍比梯度稀释方法：1v原液(标准品i)+9v稀释缓冲液，得标准品ii1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv1v标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品v质粒标准品稀释方法与拷贝数计算质粒标准品稀释方法与拷贝数计算q 方方 法：法：从血液中提取病毒DNA，以TaqMan探针法进行荧光定量检测q 试试 剂：剂：TIANGEN公司探针法试剂RealMasterMix（Probe）（目录号：FP203）q 标准品：标准品：质粒标准品浓度为106、105、104、103；2个重复；设阴性空白对照q 实验步骤：实验步骤：提取HBV DNA；设计特异引物；设计TaqMan探针并标记探针；荧光定量扩增；结果分析：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数。绝对定量实验例绝对定量实验例乙肝病人血液中乙肝病人血液中HBVHBV的绝对定量的绝对定量SampleSamplecopies/mlcopies/mlCt1Ct1Ct2Ct2Mean CtMean CtSTDSTD标准品510328.1828.6428.410.16标准品510425.2525.1425.190.04标准品510522.1122.4622.280.12标准品510618.6318.9218.770.10未知样品?20.5620.4520.50.05空白对照NoneNone实验数据实验数据绝对定量实验例绝对定量实验例乙肝病人血液中乙肝病人血液中HBVHBV的绝对定量的绝对定量扩增效率（扩增效率（E）计算）计算 E=10-1/斜率 1 =10-1/-3.17 1 =2.031 1.03 标准曲线制作：标准曲线制作：利用利用Mean Ct 作图可得到标准曲线作图可得到标准曲线y=-3.17x+37.52 R2=0.9988绝对定量实验例绝对定量实验例乙肝病人血液中乙肝病人血液中HBVHBV的绝对定量的绝对定量 相关系数（相关系数（相关系数（相关系数（R R2 2）：大于）：大于）：大于）：大于0.980.98，越接近，越接近，越接近，越接近1 1，结果可信度越高。，结果可信度越高。，结果可信度越高。，结果可信度越高。扩增效率（扩增效率（扩增效率（扩增效率（E E）：）：）：）：0.8-1.2,0.8-1.2,越接近越接近越接近越接近1 1，越理想。，越理想。，越理想。，越理想。未知样品拷贝数的计算未知样品拷贝数的计算将Ct值带入线性方程：20.5=-3.1726 X+37.52QuantityUnknown=105.36 =229087 copies 绝对定量实验例绝对定量实验例乙肝病人血液中乙肝病人血液中HBVHBV的绝对定量的绝对定量X=20.5-37.52-3.1726=5.36相对定量解析方法相对定量解析方法理论上目的基因表达量分析条件理论上目的基因表达量分析条件理论上目的基因表达量分析条件理论上目的基因表达量分析条件Sample BSample BSample ASample A目的基因扩增效率相同目的基因扩增效率相同目的基因扩增效率相同目的基因扩增效率相同RNARNA提取效率相同提取效率相同提取效率相同提取效率相同细胞起始数相同细胞起始数相同细胞起始数相同细胞起始数相同实际目的基因表达量分析实际目的基因表达量分析实际目的基因表达量分析实际目的基因表达量分析相对定量的必要性相对定量的必要性以上条件不可能同时得到满足，必须用以上条件不可能同时得到满足，必须用内对照基因内对照基因（管家基因）（管家基因）进行校正，进进行校正，进行相对表达量分析。行相对表达量分析。管家基因管家基因管家基因管家基因 维持细胞基本代谢活动所必须的基因维持细胞基本代谢活动所必须的基因维持细胞基本代谢活动所必须的基因维持细胞基本代谢活动所必须的基因,如：如：如：如：GAPDHGAPDH、ActinActin、18S rRNA18S rRNA等等等等筛选方法筛选方法筛选方法筛选方法 根据文献提供根据文献提供根据文献提供根据文献提供 通过具体实验筛选通过具体实验筛选通过具体实验筛选通过具体实验筛选相对定量分析相对定量分析管家基因筛选管家基因筛选0 01 12 23 34 45 56 6Sample1Sample1Sample2Sample2Sample3Sample3Sample4Sample4实验组实验组实验组实验组实验值实验值实验值实验值-Actin-ActinGAPDHGAPDH-2-microglobulin-2-microglobulinHPRTHPRTP P P P P P O O 双标准曲线法双标准曲线法2-Ct法法相对定量分析相对定量分析两种常用的分析方法两种常用的分析方法 通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家基因进行定量，然后根据计算公式求得相对值即为相对基因进行定量，然后根据计算公式求得相对值即为相对表达量。表达量。相对值相对值=校正值校正值=目的基因定量结果目的基因定量结果管家基因定量结果管家基因定量结果待测样品的校正值待测样品的校正值对照样品的校正值对照样品的校正值相对定量分析相对定量分析双标准曲线法双标准曲线法公式：公式：优点：分析点：分析简单，实验优化相化相对简单缺点：缺点：对每一个基因，每一每一个基因，每一轮实验都必需做都必需做标准曲准曲线应用：基因表达用：基因表达调控研究中最常用与公控研究中最常用与公认的两种相的两种相对定量方法之一定量方法之一相对定量分析相对定量分析双标准曲线法双标准曲线法检测样品检测样品管家基因管家基因H H目的基因目的基因X X定量结果定量结果定量结果定量结果校正值校正值相对量相对量对照样品对照样品6391.56391.5343.4343.40.05370.05371.0001.000待测样品待测样品1 18589.78589.717.317.30.00200.00200.0370.037待测样品待测样品2 27432.97432.91946.11946.10.26180.26184.8744.874实验数据实验数据公式：公式：F=2相对定量分析相对定量分析2 2 法法优点：无需作标准曲线优点：无需作标准曲线缺点：假定扩增效率为缺点：假定扩增效率为 100%；假定标准曲线及每次扩增之际间的效率都保持一致；假定标准曲线及每次扩增之际间的效率都保持一致；实验条件优化较为复杂实验条件优化较为复杂应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一 待测组目的基因平均Ct值待测组管家基因平均Ct值对照组目的基因平均Ct值对照组管家基因平均Ct值CtCt实验数据：实验数据：Sample 处理前 处理后 Jun(MeanCt)GAPDH(MeanCt)E18161717.41.951.952-Ct法：法：假设目的基因和参照基因扩增效率都接近假设目的基因和参照基因扩增效率都接近100%Ct（处理前）18171 Ct（处理后）1617.4=1.4Ct=Ct（处理后）Ct（处理前）1.412.4比率（处理后/处理前）=2Ct2（2.4）=5.3 所以所以JunJun基因在处理后表达水平比处理前高基因在处理后表达水平比处理前高5.35.3倍倍修正方法：如果我们知道目标基因和参照基因有相同的扩增效率，但扩增效率不等于修正方法：如果我们知道目标基因和参照基因有相同的扩增效率，但扩增效率不等于2，那么，那么2Ct可以修正为：可以修正为：ECt，例如扩增效率为，例如扩增效率为1.95，那么计算公式可修正为，那么计算公式可修正为1.95Ct相对定量分析相对定量分析2-Ct2-Ct法法内容概要内容概要1荧光定量荧光定量PCR的原理的原理1荧光定量荧光定量PCR的标记方法的标记方法1荧光定量荧光定量PCR的解析方法的解析方法1 SYBR法实验流程及注意事项法实验流程及注意事项1 TIANGEN公司荧光定量相关产品公司荧光定量相关产品SYBR法实验流程及注意事项法实验流程及注意事项样品制备样品制备模板准备模板准备引物设计引物设计反应条件优化反应条件优化浓度确定浓度确定技能要求技能要求环境要求环境要求误差控制误差控制数据分析数据分析仪器介绍仪器介绍RT上机上机反应体系优化反应体系优化试剂选择试剂选择分析方法分析方法样品制备样品制备环境要求环境要求模板准备模板准备数据分析数据分析RT上机上机浓度确定浓度确定SYBR法实验流程及注意事项法实验流程及注意事项无RNase环境使用无RNase耗材专用RNase-free工具高纯度，浓度均一的高纯度，浓度均一的高纯度，浓度均一的高纯度，浓度均一的RNARNARNARNA分光光度计检测电泳检测RT反应体系优化反应体系优化试剂选择试剂选择样品制备样品制备模板准备模板准备数据分析数据分析上机上机AMVM-MLVQuantSuper下游反应数确定反转录体积选择应用引物高效、全长的高效、全长的高效、全长的高效、全长的cDNAcDNAcDNAcDNASYBR法实验流程及注意事项法实验流程及注意事项模板准备模板准备引物设计引物设计浓度确定浓度确定环境要求环境要求误差控制误差控制RT样品制备样品制备数据分析数据分析上机上机核酸制备区反应液制备区制作标准曲线设定浓度区间评价引物使用mix降低系统误差设置重复（3次）设置空白和阴性对照均一的反应液和模板混合物均一的反应液和模板混合物均一的反应液和模板混合物均一的反应液和模板混合物GC：5060Tm：5065单个碱基重复4个无二级结构扩增长度：100200bp反应体系优化反应体系优化上机上机反应条件优化反应条件优化RT样品制备样品制备模板准备模板准备数据分析数据分析反应体积5ul，推荐2050ulMg2调节，酶活调节引物浓度优化，模板量优化退火温度优化：梯度PCR延伸时间：产物长度决定扩增效率：90110重复性：std0.2标准曲线：R0.99或R2 0.98SYBR法实验流程及注意事项法实验流程及注意事项标准品待测样本阳性对照阴性对照技能要求技能要求误差控制误差控制仪器介绍仪器介绍上机上机试剂选择试剂选择RT样品制备样品制备模板准备模板准备数据分析数据分析自配realmastermixRCHO-Lightcycler seriesROTOGEN-RG seriesBIO-RAD Opticon seriesABI-7seriesBioerLinegene series分装控制内参控制机器校正控制平滑曲线，重复性好，灵敏度高平滑曲线，重复性好，灵敏度高平滑曲线，重复性好，灵敏度高平滑曲线，重复性好，灵敏度高SYBR法实验流程及注意事项法实验流程及注意事项 Rotor-gene6000 Rotor-gene6000 MiniOpticon MiniOpticon Mx3005PMx3005PTMTM LINE-GENE FQD-LINE-GENE FQD-66A66A ABI ABI PRISM PRISM 75007500 iQ5 Real-Time PCR Detection iQ5 Real-Time PCR Detection System System 数据分析数据分析仪器介绍仪器介绍分析方法分析方法上机上机RT样品制备样品制备模板准备模板准备相对定量：2Ct法绝对定量：标准曲线法可靠，准确的数据可靠，准确的数据可靠，准确的数据可靠，准确的数据SYBR法实验流程及注意事项法实验流程及注意事项内容概要内容概要1荧光定量荧光定量PCR的原理的原理1荧光定量荧光定量PCR的标记方法的标记方法1荧光定量荧光定量PCR的解析方法的解析方法1 SYBR法实验流程及注意事项法实验流程及注意事项1 TIANGEN公司荧光定量相关产品公司荧光定量相关产品TIANGEN公司荧光定量产品公司荧光定量产品SYBRGreen法法探针法探针法FP203RealMasterMix(Probe)以以DNA为模板为模板FP202RealMasterMix（SYBRGreen）以以RNA为模板为模板FP302QuantqRT-PCR(SYBRGreen)KitFP303Quant一步法一步法qRTPCR(SYBRGreen）TIANGEN公司荧光定量产品优势公司荧光定量产品优势试剂盒中使用改良后的Hotmaster Taq Polymerase，具有高效率、高灵敏度、高特异性特点多种不同的实验缓冲液，满足不同实验需求高效的Quant系列逆转录酶，满足RT需求独特的Mg2自动调节，随时保证为PCR提供最佳Mg2浓度谢谢！