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第二章第二章 光学显微技术光学显微技术 第二章第二章 光学显微技术光学显微技术1.光学显微镜的发展历程光学显微镜的发展历程2.光学显微镜的成象原理光学显微镜的成象原理3.光学显微镜的构造和光路图光学显微镜的构造和光路图4.显微镜的重要光学参数显微镜的重要光学参数5.样品制备样品制备1.光学显微镜的发展历程光学显微镜的发展历程15世纪中叶：眼镜片工匠们开始磨制放大镜。当时 的放大镜的放大倍数只有35x 1590年，荷兰的詹森父子(Hans and zachrias Janssen)出第一台原始的、放大倍数约为20倍的显微镜。16l0年，意大利物理学家伽利略(Galileo)制造了具有物镜、目镜及镜筒的复式显微镜。1665年，英国物理学家罗伯特胡克(Robert Hooke)用复式显微镜观察软木塞时发现了小的蜂房状结构，称为“细胞”，由此引起了细胞研究的热潮。1684年，荷兰物理学家惠更斯(Huygens)设计并制造出双透镜目镜惠更斯目镜，是现代多种目镜的原型。这时的光学显微镜已初具现代显微镜的基本结构。阿贝奠定了显微镜成像的古典理论基础，阐明光学显微镜成像原理。光学显微镜分辨本领达0.2m理论极限。1850年出现了偏光显微术；1893年出现了干涉显微术；1935年荷兰物理学家泽尔尼克创造了相衬显微术 1.光学显微镜的发展历程光学显微镜的发展历程l在显微镜的发展史中，贡献最为卓著的是德国的物理学家、数学家和光学大师恩斯特阿贝(ErnstAbbe)。l他提出了显微镜的完善理论，阐明了成像原理、数值孔径等问题，在1870年发表了有关放大理论的重要文章。l两年后又发明了油浸物镜，并在光学玻璃、显微镜的设计和改进等方向取得了光辉的业绩。罗伯特罗伯特 虎克制造的显微镜（虎克制造的显微镜（1665）放大倍数：放大倍数：140倍倍 列文虎克和他的显微镜（约1680）2.光学显微镜的成象原理光学显微镜的成象原理l2.1 衍射的形成衍射的形成l2.2 阿贝成像原理阿贝成像原理2.1 衍射的形成衍射的形成l物理光学把光视为一种电磁波，具有波粒二象性，即波动性和粒子性。由于光具有波动性质，使得光波相互之间发生干涉作用，产生衍射现象。圆孔衍射圆孔衍射l屏幕上的P1点到狭峰上边缘的距离和它到狭峰下边缘的距离之差为一个波长。l从狭峰上缘和从狭峰下缘发出的两列光波在P1点相互增强，但这两列光波不过是从连线b上发出的无数光波中的一对，其他任意两列光波到达P1点的波程差均小于一个波长。l整个狭峰内发出的光波的累计相干效果，是在P1点两侧造成一个光强的低谷，P1点位于谷底位置。l相反，在P2点处，从狭缝上缘和下缘发出的光波的波程差1个波长，P2成为相干增强区的中心，称为第一级衍射极大值。衍射结果衍射结果l点光源经过光学仪器的小圆孔后，由于衍点光源经过光学仪器的小圆孔后，由于衍射的影响，所成的像不是一个点，而是一射的影响，所成的像不是一个点，而是一个明暗相间的衍射图样，中央为爱里斑。个明暗相间的衍射图样，中央为爱里斑。l点光源通过透镜产生的埃利斑第一暗环半径l式中n为介质折射率，照明光波长，透镜孔径半角，M透镜放大倍数l说明埃利斑半径与照明光源波长成正比，与透镜数值孔径成反比由斑点光源衍射形成的埃利斑（a）及其光强分布图（b）2.2 阿贝成像原理阿贝成像原理l对于周期性结构的物体，图像的形成用阿贝成像原理来解释。l光线通过细小的网孔时要发生衍射，衍射光线向各个方向传播，凡是光程差满足k=0，1，2，的，互相加强。同一方向的衍射光则成为平行光束。l平行光束通过物镜在后焦面上会聚；形成衍射花样。衍射花样上的某个衍射斑点是由不同物点的同级衍射光相干加强形成的；同一物点上的光由于衍射分解，对许多衍射斑点有贡献。l从同一物点发出的各级衍射光，在产生相应的衍射斑点后继续传播，在象平面上又相互干涉，形成物象阿贝成像原理l阿贝成像原理可以简单地描述为两次干涉作用：平行光束受到有周期性特征物体的散射作用形成衍射谱，各级衍射波通过干涉重新在像平面上形成反映物的特征的像。物与象之间的相似性 l物象是由直射光和衍射光互相干涉形成的，不让衍射光通过就不能成象，参与成象的衍射斑点愈多，则物象与物体的相似性愈好。放大原因显微镜和放大镜起着同样的作用，就是把近处的微小物体成一放大的像，以供人眼观察。只是显微镜比放大镜可以具有更高的放大率而已。物体位于物镜前方，离开物镜的距离大于物镜的焦距，但小于两倍物镜焦距。所以，它经物镜以后，必然形成一个倒立的放大的实像AB。AB靠近F2的位置上。再经目镜放大为虚像AB后供眼睛观察。目镜的作用与放大镜一样。所不同的只是眼睛通过目镜所看到的不是物体本身，而是物体被物镜所成的已经放大了一次的像。3.光学显微镜的构造和光路图光学显微镜的构造和光路图显微镜的结构组成光学放大系统照明系统机械和支架系统物镜光源折光镜聚光镜滤光片目镜光学显微镜基本结构光学显微镜基本结构：1.照明灯照明灯(Lamp)2.聚光器聚光器(Condenser)3.载物台和切片夹载物台和切片夹(Mechanical stage and specimen retainer)4.推进器推进器(Mechanical stage adjustment knob)5.物镜物镜(Objectives)6.粗细螺旋粗细螺旋(Course and fine focus knob)7.目镜目镜(Oculars)8.照相机等接口照相机等接口(Connection to camera,etc.)目镜l目镜的作用是把物镜放大的实象再放大一级，并把物象映入观察者的眼中，实质上目镜就是一个放大镜。显微镜的分辨率能力是由物镜的数值孔径所决定的，而目镜只是起放大作用。对于物镜不能分辨出的结构，目镜放的再大，也仍然不能分辨出。聚光镜l聚光镜装在载物台的下方。小型的显微镜往往无聚光镜，在使用数值孔径0.40以上的物镜时，则必须具有聚光镜。聚光镜不仅可以弥补光量的不足和适当改变从光源射来的光的性质，而且将光线聚焦于被检物体上，以得到最好的照明效果。l聚光镜光栏l所谓光栏，从广义的角度可指一切限制入射光束截面的框孔都可认为光栏。l聚光镜光栏作用l（1）改变聚光镜的数值孔径以便与物镜的数值孔径相匹配，可调整图象的分辨率和反差。l（2）辅助调整亮度。聚光器数值孔径l物镜l物镜(objective)是光学显微镜成像系统中决定其分辨率或叫分辨本领的最关键部件。l(1)消色差物镜(achromat)l色差校正使可见光中红光和蓝光聚焦于一点，而黄绿光则聚焦于另一点。能够消除光谱中红光和蓝光所形成的色差。这种物镜与目镜配用时可达到消色差物镜所要求的光学性能。l(2)复消色差物镜(apochromat)l是性能最高的物镜。能消除可视光中黄、红、蓝即包括几乎所有谱线在成像过程中所造成的色差。l(3)平象物镜l它们所成的影象基本上是平的，象场弯曲很小，不会发生视野中心与边缘不能同时准焦的现象，因此对目视观察及显微摄影都极为方便。平象物镜由于将弯曲的影象展平，在同样放大倍数下它成的影象比用一般物镜要大一点。在平象物镜的金属外框上，刻有Flanachr、planapo、plan等字样。l(4)相差物镜l相差物镜(Phasencontrastobjective)的一个透镜片上喷涂着一层环状金属膜板叫相位板。相位板是相差显微镜的关键部件。它和相差显微镜的聚光镜上的的环状光栏相配合使用。有关位相板涂料的性质和作用原理在以后详述。外壳上刻有Ph标记物镜结构物镜标识4 显微镜的重要参数显微镜的重要参数l4.1 数值孔径数值孔径l4.2 分辨率分辨率l4.3 放大率和有效放大率放大率和有效放大率l4.4 光学透镜的象差光学透镜的象差4.1 数值孔径数值孔径l数值孔径（NA）是物镜前透镜与被检物体之间介质的折射率（n）和半孔径角（）的正弦之乘积。NA=nsinl孔径角是物镜光轴上的物点与物镜前透镜的有效直径所形成的角度。孔径角越大，进入物镜的光通亮就越大，分辨率越高。孔径角与物镜的有效直径成正比，与焦点的距离成反比。l根据阿贝成像原理，衍射光线反映了物体形貌的细节，因此一个物镜要反映物体的细节，必须能够接受尽量多的高阶衍射光线。l物镜接收衍射光线的能力也强烈的依赖于在样品与镜头之间的介质。因此，数值孔径的概念更加能够有效的描述物镜的成像能力。物镜数值孔径4.2 分辨率分辨率瑞利判据：两埃利斑中心间距等于第一暗环半径R。此时,两中央峰之间叠加强度比中央峰最大强度低19，因此肉眼仍能分辨是两个物点的像l瑞利判据瑞利判据：当一个点光源的衍射图样的中央最亮当一个点光源的衍射图样的中央最亮处刚好与另一个点光源的衍射图样的第一级暗纹处刚好与另一个点光源的衍射图样的第一级暗纹相重合时，这两个点光源恰好能被分辨。相重合时，这两个点光源恰好能被分辨。恰恰能能分分辨辨能能分分辨辨不不能能分分辨辨分辨本领l此时,样品上相应的两个物点间距离r。定义为透镜能分辨的最小距离，也就是透镜的分辨本领。lr。R。Ml分辨本领是由物镜的NA值与照明光源的波长两个因素决定，NA值越大，照明光线波长越短，分辨率就越高。4.3 放大率和有效放大率放大率和有效放大率l由于经过物镜和目镜的两次放大，所以显微镜总的放大率应该是物镜放大率和目镜放大率1的乘积：=1l显微镜放大倍率的极限即有效放大倍率。l当选用的物镜数值孔径不够大，即分辨率不够高时，显微镜不能分清物体的微细结构，此时即使过度地增大放大倍率，得到的也只能是一个轮廓虽大但细节不清的图像，称为无效放大倍率。4.4 光学透镜的象差光学透镜的象差l（1）球面象差（简称球差）边缘与中心部分的折射光不能通过会聚相交于一点球差校正光学透镜的象差光学透镜的象差l（2）色象差由于组成白光的各色光波长不同，折射率不同，因而成象的位置也不同 色差校正光学透镜的象差光学透镜的象差l（3）象域弯曲。垂直于光轴的直立的物体经过透镜后台形成一弯曲的象面，称为象域弯曲 象域弯曲是几种象差综合作用的结果 5样品制备样品制备l5.1取样取样l5.2 镶样镶样l5.3 磨光磨光l5.4 抛光抛光l5.5腐蚀腐蚀5.1取样取样l取样应选择有代表性的部位l对于软材料，可以用锯、车、刨等加工方法；l对于硬材料，可以用砂轮切片机切割或电火花切割等方法；l对于硬而脆的材料，如白口铸铁，可以用锤击方法；l在大工件上取样，可用氧气切割等方法。5.2 镶样镶样l用专门的镶样机，在合适的加热温度和压力下，将试样镶嵌在固化的树脂或塑料基体中。l还可以采用机械镶嵌法，即用夹具夹持试样。5.3 磨光磨光l金相试样的磨光除了要使表面光滑平整外，更重要的是应尽可能减少表层损伤。l每一道磨光工序必须除去前一道工序造成的变形层，而不是仅仅把前一道工序的磨痕除去。l手工磨光时，本道工序的磨痕应与上一道工序的磨痕方向垂直，这样可以使试样磨面保持平整并平行于原来的磨面。5.4 抛光抛光（1）机械抛光。粗抛，精抛。（2）电解抛光。电解抛光时，在试样表面上形成一层具有较高电阻的薄膜，试样凸起部分的膜比凹下部分薄，膜越薄电阻越小，金属溶解速度越快，从而使凸起部分渐趋平坦。（3）化学抛光。化学抛光的原理与电解抛光类似，是化学药剂对试样表面不均匀溶解的结果。5.5腐蚀腐蚀（1）化学腐蚀。l纯金属及单相合金的腐蚀是一个化学溶解的过程。由于晶界上原子排列不规则，具有较高的自由能，所以晶界易受腐蚀而呈凹沟，使组织显示出来，若腐蚀较深，则由于各晶粒位向不同，不同的晶面溶解速率不同。l两相合金的腐蚀主要是一个电化学腐蚀过程。（2）电解腐蚀电解腐蚀所用的设备与电解抛光相同，只是工作电压和工作电流比电解抛光时小。在微弱电流的作用下各相腐蚀程度不同，因而显示出组织。本章重点 阿贝成像原理阿贝成像原理分辨率分辨率