DNA测序技术.ppt
DNA测序技术第一代：双脱氧末端终止法 化学降解法第二代：DNA序列分析的自动化第三代：新一代DNA测序技术第一代70年代末，Sanger发明双脱氧核苷酸末端终止法，到现在仍为绝大多数实验室常用的DNA序列分析方法。同期，WalterGilbert发明化学降解法。双脱氧末端终止法原理2端羟基被氢原子取代形成 dNTP 3端羟基再次被氢原子取代形成 ddNTP无论体内还是体外条件下的DNA合成反应，DNA聚合酶都是以单链DNA为模板，根据碱基互补配对原则，将适当的dNTP底物连接到事先已经与DNA单链模板结合的寡核苷酸引物的3羟基末端，形成3,5-磷酸二酯键，同时脱去一个焦磷酸（PPi）分子；而新连接到引物上的dNTP底物又提供一个新的3羟基末端，与下一个dNTP底物连接，以形成下一个3,5-磷酸二酯键，以此类推，从而使引物延伸下去最终合成一条与单链模板互补的完整新链 化学降解法单侧末端标记的DNA片段在5组相互独立的化学反应中分别得到部分降解，其中每一组反应特异地针对某一种或某一类被修饰碱基，因此形成5组带有放射性标记的长短不一的DNA混合物。它们的长度取决于该组反应所针对的碱基在原有DNA片段的位置。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分别分离这5组DNA混合物，再通过放射自显影来检测末端标记DNA链的电泳区带位置。第二代双脱氧末端终止法操作简便、结果清晰可靠，一次能确定300-500个核苷酸序列，已成为最常用的DNA测序方法。在第二代DNA序列分析的自动化中仍沿用该原理。化学降解法操作繁杂，所用的化学试剂多为有毒物质，且无法进行自动化分析，故在DNA序列分析中很少人用。第二代80年代中期，出现自动测序仪（应用双脱氧终止法原理）、荧光代替同位素，计算机图象识别 90年代中期，测序仪重大改进、集束化的毛细管电泳代替凝胶电泳 DNA序列分析的自动化原理利用双脱氧末端终止法的原理，用四种不同的荧光化合物分别标记4种反应产物，把4种反应物混合在一起进行电泳，从而大大提高点用分析的效率，实现了DNA测序的高度自动化。ABI型全自动型全自动DNA测序仪测序仪：其特点采用专利的4种荧光染料分别标记终止物ddNTP或引物，经Sanger测序反应后，反应产物3端（标记终止物法）或5端（标记引物法）带有不同的荧光标记一个样品的4个测序反应产物可在同一泳道内电泳，从而降低测序泳道间迁移率差异对精确性的影响。通过电泳将各个荧光标记片段分开，同时激光检测器同步扫描，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD摄影机上同步成像。电脑可在电泳过程中对仪器运行情况进行同步检测。结果能以电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种方式输出。ALF全自动激光荧光全自动激光荧光DNA测序系统测序系统:该系统采用非放射性的单一Cy5荧光素标记测序引物。沿用双脱氧链终止法进行反应，分别生成4组终止于不同种类碱基、带有Cy5荧光素标记的DNA片段。A、G、C和T四组反应物在变形凝胶上电泳，每个泳道都有一个有激光枪和探测器组成的检测装置，当Cy5荧光素标记的DNA条带迁移至探测区并遇上激光时，荧光标记被激活并释放出光信号，光信号有探测器接收，最后电脑将收集到的信号进行处理。在第二代测序技术中最新型自动测序仪为大规模毛细管DNA分析系统，采用涂层毛细管，使信噪比更高，有效提高分辨率，工作效率极大提高，在人类基因组测序和基因结构研究中发挥了十分重要的作用。新一代DNA测序技术 2005年：焦磷酸测序法（美国Roche Applied Science）2007年：新一代高通量基因测序分析系统SOLiD（美国应用生物系统公司）最新成果：Illumina测序仪在单分子簇的边合成测序技术的基础上，采用了可逆终止化学反应。（美国Illumina公司和英国Solexa Technoiocy）焦磷酸测序法新一代高通量基因测序分析系统：SOLiD在进行测序反应时应用连接法和双碱基编码原理，他对每个碱基判读2次、用连接酶代替了传统的聚合酶、测序过程中更换引物。Illumina测序仪：其在单分子簇的边合成边测序的基础上采用了可逆终止化学反应。Solexa技术保证了每次延伸反应时4种dNTP的浓度均匀，有效地避免了掺入错误。新一代测序技术主要基于循环芯片测序法。它的Helicos单分子测序技术、SMRT技术和纳米孔单分子测序技术正向着更高通量、更低成本、更长读取的方向发展。其出现弥补了传统测序方法的缺陷，借助区数据产出通量高、测序成本低的显著优势，新一代测序技术为解决基因分子生物学问题开辟了新途径临床基因测序的发展2014年2月，国家食品药品监督管理总局（下称食药总局）、国家卫生和计划生育委员会（下称卫计委）一纸叫停了临床基因测序，原因是相关产品和技术并没有通过审批便在市场上流通开来。未经审批就做诊疗，算是非法行医，属于严重违法行为。这并未浇灭人们对中国市场的热情。两个月后，世界最大的基因测序仪器制造商Illumina的掌门人杰伊福莱特雷（Jay Flatley）先生就急匆匆跑来中国，并高调表示：“我十分看好中国基因测序市场。”四个月后的2014年6月30日，食药总局批准了二代基因测序产品上市。其中，华大基因的两款测序仪和试剂盒通过审批。临床测序按照行业分析的结果，市场基本被华大基因（BGI）、贝瑞和康（BERRYGENOMICS）、安诺优达（ANNOROAD）三家公司所占领，标杆企业分析-华大科技仪器争议焦点便是华大基因拿到审批的测序仪器和试剂产品都不是在国内生产的。我国规定凡进口设备必须通过原生产国审批，而这几款仪器和产品至今没有得到美国FDA审批。国内机构也一直在进行国产测序仪的开发。2014年4月，中国科学院北京基因组研究所和吉林中科紫鑫科技有限公司联合开发的新一代基因测序仪样机正式亮相。但目前，国内的基因检测公司，全都采购了国外的仪器和数据库。DNA测序的应用医疗农业个人按卫计委统计，中国每年约有2000万孕妇，如果一半的孕妇接受产前基因测序，仅“唐筛（唐氏综合征筛查）”一项的市场容量将达到100亿150亿元/年。而基因相关疾病的诊断市场空间更大。目前，已知的单基因遗传病、染色体异常及线粒体疾病有八千多种，明确与基因变异对应的遗传病有3672种。“中国每年新发的肿瘤病人有好几百万，患病后都需要基因诊断。”安诺优达的CEO梁峻彬告诉南方周末记者，基因测序的竞争大幕才刚刚拉开。不管是原来研究技术的，还是资本圈，都很关注这个新兴行业。然而，基因测序不在卫生行政部门准入的医疗技术项目之列，物价部门也没有收费标准。1、测序：基因组DNA测序、cDNA测序、未知序列测序 2、再测序3、细菌和真菌鉴定4、艾滋病诊断5、白细胞抗原配型6、SNP筛查（SNP：单核苷酸的多态性，即：有的人吸烟喝酒却长寿，也有人自幼就病痛缠身；同一种治疗肿瘤的药物对一些人非常有效，对另一些人则完全无效。这是为什么？答案是他们基因组中存在的差异。这种差异很多表现为单个碱基上的变异。）7、sscp（指单链构象多态性检测是一种基于DNA构象差别来检测点突变的方法。）8、提前预知潜在疾病，及时做好预防工作，提高人们的生活水平，提高我国国民的健康指数，也对未来生活提供了指导依据。利用新一代DNA测序技术，可以高效，廉价地测定所钉重要农业生物的基因组序列，测定农业核心种质的基因组序列，全面了解农作物遗传变异情况，进而大规模地鉴定、克隆功能基因。基于新一代DNA测序技术的种质基因组学，将实现农业育种由经验依赖型向知识决定型的转变，给农业发展带来革命。明白个人的基因信息，对个人的遗传情况、健康状况的了解等提供了技术支持，从而使个人有选择性的选择治疗康复、预防、社会医疗投保等；以DNA测序相关的产业链迅速蓬勃发展，在生物医疗领域带来科技热，将会对社会带来一场革命，同时可提高我国的就业率。可能导致个人基因信息的泄露，对被泄露个体造成损害，引发社会道德、信任危机，还能引发社会歧视问题，甚至造成民族矛盾的升级；对于基因信息有缺陷的个体，可能导致该个体的失落，严重者甚至产生心理阴影，影响了之后的生活。（所谓有时候被蒙在鼓里也是一种幸福，精神儿童欢乐多）在农业方面，大量的改变基因组实验可能培育出大量的对人体产生危害的变异物种，而且致病性的潜伏期也很难确定。人类基因组计划人类基因组计划(human genome project,HGP)是由美国科学家于1985年率先提出，于1990年正式启动的。美国、英国、法国、德国、日本和我国科学家共同参与了这一预算达30亿美元的人类基因组计划。按照这个计划的设想，在2015年，要把人体内约4万个基因的密码全部解开，同时绘制出人类基因的谱图。其宗旨在于测定组成人类染色体（指单倍体）中所包含的30亿个碱基对组成的核苷酸序列，从而绘制人类基因组图谱，并且辨识其载有的基因及其序列，达到破译人类遗传信息的最终目的。截止到2005年，人类基因组计划的测序工作已经完成。其中，2001年人类基因组工作草图的发表（由公共基金资助的国际人类基因组计划和私人企业塞雷拉基因组公司各自独立完成，并分别公开发表）被认为是人类基因组计划成功的里程碑。
