生物选修一大肠杆菌的培养和分离.ppt

1-1什么是生物技术生物技术生物技术=生物工程生物工程 应用自然科学及工程学原理，以应用自然科学及工程学原理，以微生微生物体、动物体、植物体或其组成部分物体、动物体、植物体或其组成部分作为作为生物反应器将物料进行加工，以提供产品生物反应器将物料进行加工，以提供产品来为社会服务的技术。来为社会服务的技术。1-2 传统生物技术传统生物技术传统传统生物生物技术指技术指主要主要通过通过微生物微生物的的发发酵酵来来生生产产商品商品.如如:酱、醋、酱、醋、酒、面包、奶酪、酸奶等酒、面包、奶酪、酸奶等1-3 现代生物技术一般而言，現代生物一般而言，現代生物技术技术可以分成以下五可以分成以下五种种：一、一、细胞工程细胞工程二、二、发酵工程发酵工程三、三、蛋白质工程蛋白质工程四、四、酶酶工程工程五、五、基因工程基因工程 现代生物技术与传统生物技术的本质区别是现代生物技术与传统生物技术的本质区别是现代生物技术中用到了基因工程。现代生物技术中用到了基因工程。一、细胞工程 按照人们的需要和科学设计按照人们的需要和科学设计改变改变细胞的遗传基础细胞的遗传基础，并通过细胞，并通过细胞(组组织织)培养，细胞杂交培养，细胞杂交(融合融合)，核移，核移植和胚胎移植等技术，重组细胞植和胚胎移植等技术，重组细胞的结构和内含物，以改变生物的的结构和内含物，以改变生物的结构和功能，快速繁殖和培养出结构和功能，快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的生物工程人们所需要的新物种的生物工程技术。技术。二、发酵工程微生物的无氧呼吸叫微生物的无氧呼吸叫发酵发酵1.1.定义定义：利用利用DNADNA重组技术重组技术对对不同生物不同生物的的遗传基因遗传基因，根据根据人人们们的的意愿意愿，进进行基行基因的切割、拼接及重新因的切割、拼接及重新组组合，再合，再转转入生入生物物体体內，內，产生产生出人出人们们所期望的所期望的产产物或物或创创造出具有新的造出具有新的遗传特征遗传特征的的生物类型生物类型。蛋白质工程主要包括蛋白质工程主要包括了解合成蛋了解合成蛋白质的白质的DNADNA编码序列、蛋白质的分编码序列、蛋白质的分离离纯化纯化、蛋白质的序列分析和蛋白质的序列分析和结构结构功能分析功能分析、蛋白质蛋白质结晶和结构力学结晶和结构力学分析等分析等。三、蛋白质工程 酶酶工程工程即利用即利用基因工程等手段基因工程等手段，改改变变酶或蛋白质的折叠方式、空间结酶或蛋白质的折叠方式、空间结构、催化活性和稳定性等构、催化活性和稳定性等四、酶工程选修1需学习的实验 （微生物的利用）（微生物的利用）实验实验1 大肠杆菌的培养和分离大肠杆菌的培养和分离 （酶的应用）（酶的应用）实验实验4 果汁中的果胶和果胶酶果汁中的果胶和果胶酶 实验实验5 加酶洗衣粉的使用条件和效果加酶洗衣粉的使用条件和效果 实验实验6-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测检测 （生物工程在食品加工中的应用）（生物工程在食品加工中的应用）实验实验8 果酒及果醋的制作实验果酒及果醋的制作实验 实验实验10 泡菜的腌制和亚硝酸盐的测定泡菜的腌制和亚硝酸盐的测定（浅尝现代生物工程）（浅尝现代生物工程）实验实验11 植物的组织培养植物的组织培养第一部分第一部分 :微生物的利用微生物的利用一、基础知识一、基础知识1微生物2培养基3无菌技术无菌技术二、实验操作2 2微生物的接种技术微生物的接种技术1操作步骤操作步骤微生物包括哪五类：微生物包括哪五类：病毒病毒细菌和蓝细菌细菌和蓝细菌放线菌放线菌真菌真菌原生动植物原生动植物特点：特点：结构都相当简单结构都相当简单,个体多数十分微小个体多数十分微小.通通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构的甚至没有细胞结构.原核原核生物界生物界 原生生物界原生生物界真菌界真菌界病毒界病毒界一基础知识（一）微生物（一）微生物细菌的外形与大小细菌的外形与大小细菌：细菌：单细胞不分枝的原核微生物单细胞不分枝的原核微生物。细菌细胞细菌细胞微小而透明微小而透明，通常用适当染料，通常用适当染料染色染色（革兰氏染色）后显微镜观察后显微镜观察A.球菌球菌B.杆菌杆菌C.弧菌弧菌革兰氏染色革兰氏染色革兰氏染色是一种用于细菌的染色法。革兰氏染色是一种用于细菌的染色法。革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌用用用用革兰氏染液染色后，再用脱色液处理，细菌仍保留染色液的颜色相反相反相反相反细菌的构造图图图图 细菌的结构细菌的结构细菌的结构细菌的结构细胞膜细胞膜拟核拟核细菌细胞由外向里依次有鞭毛鞭毛鞭毛鞭毛、菌菌（纤）毛纤）毛纤）毛纤）毛、荚膜荚膜荚膜荚膜、细胞壁细胞壁细胞壁细胞壁、细胞膜、细胞膜、细胞膜、细胞膜、细胞质细胞质细胞质细胞质、拟核拟核拟核拟核，细胞质中又有液细胞质中又有液细胞质中又有液细胞质中又有液泡、储存性颗粒、泡、储存性颗粒、泡、储存性颗粒、泡、储存性颗粒、核质等核质等核质等核质等。*细胞壁成分：肽聚糖成分：肽聚糖成分：肽聚糖成分：肽聚糖细胞壁有哪些功能？细胞壁有哪些功能？固定细胞外形；固定细胞外形；固定细胞外形；固定细胞外形；w w 保护细胞免受外力的损伤；保护细胞免受外力的损伤；保护细胞免受外力的损伤；保护细胞免受外力的损伤；w w 阻拦大分子物质进人细胞阻拦大分子物质进人细胞阻拦大分子物质进人细胞阻拦大分子物质进人细胞；使细胞具有致病性及对使细胞具有致病性及对使细胞具有致病性及对使细胞具有致病性及对噬菌体的敏感性。噬菌体的敏感性。噬菌体的敏感性。噬菌体的敏感性。伤伤寒寒杆杆菌菌细细胞胞壁壁中中含含毒毒素素 有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做体，叫做芽孢芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3 3小时以后才小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌.菌落：单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落形态结构的子细胞群体，叫做菌落。菌落是鉴定菌种的重要依据。菌落是鉴定菌种的重要依据。菌落细菌的菌落特征细菌的菌落特征因种而异因种而异 细菌的营养物质 碳源碳源 有机有机 、无机、无机氮源氮源 有机有机 、无机、无机水水无机盐无机盐生长因子生长因子 即细菌生长必需，而自身即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物不能合成的化合物,如维生素、某些氨如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶基酸、嘌呤、嘧啶大肠杆菌的培养与分离大肠杆菌的培养与分离实验目的实验目的:1.1.进行大肠杆菌的扩增，利用进行大肠杆菌的扩增，利用LBLB液体液体培养基进行细菌培养的操作培养基进行细菌培养的操作2.2.进行大肠杆菌的分离进行大肠杆菌的分离,用固体平板用固体平板培养基进行细菌的划线培养培养基进行细菌的划线培养3.3.说明大肠杆菌培养的条件和操作要说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原理求的原理A.球菌球菌B.杆菌杆菌C.弧菌弧菌对链霉素敏感对链霉素敏感大肠杆菌基础知识：大肠杆菌基础知识：由于细菌细胞壁结构不同，细菌可分为革兰氏阳性菌由于细菌细胞壁结构不同，细菌可分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。和革兰氏阴性菌。革兰氏阳性菌：革兰氏阳性菌：革兰氏阴性菌：革兰氏阴性菌：细胞壁厚，无荚膜，多产生外毒素。细胞壁厚，无荚膜，多产生外毒素。对青霉素更为敏感。对青霉素更为敏感。细胞壁薄，有荚膜，多产生内毒素细胞壁薄，有荚膜，多产生内毒素大肠杆菌是革兰氏阴性菌，异养兼性厌氧型肠道杆菌。大肠杆菌是革兰氏阴性菌，异养兼性厌氧型肠道杆菌。在肠道在肠道对人无害，但进入人的泌尿系统便会产生危害。大肠杆菌在基对人无害，但进入人的泌尿系统便会产生危害。大肠杆菌在基因工程中广泛应用，它的质粒是最常用的载体，也是基因工程因工程中广泛应用，它的质粒是最常用的载体，也是基因工程中常用的受体细胞。中常用的受体细胞。大肠杆菌的培养和分离大肠杆菌的培养和分离菌种保存培养基的配培养基的配制制灭菌灭菌超净工作台超净工作台倒平板倒平板接种液体接种液体培养培养分离分离培养培养氮源氮源 矿质矿质元素元素生长生长因子因子 能源能源 碳源碳源水水 培养基是人工配制的适合微生物生长繁培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。殖或积累代谢产物的营养基质。大肠杆菌培养基：一般用大肠杆菌培养基：一般用LB液体培养基来扩大培养大液体培养基来扩大培养大肠杆菌，培养后可在肠杆菌，培养后可在LB固体培养基上划线分离。固体培养基上划线分离。一、大肠杆菌的培养一、大肠杆菌的培养培养基种类培养基种类液体培养基液体培养基固体培养基固体培养基半固体培养基半固体培养基物理状态物理状态选择培养基选择培养基鉴别培养基鉴别培养基目的用途目的用途化学成分化学成分合成培养基合成培养基天然培养基天然培养基液体培养基：液体培养基：表面生长表面生长均匀混浊生长均匀混浊生长沉淀生长沉淀生长按按物理状态物理状态来分来分用途：工业生产、扩大培养用途：工业生产、扩大培养固体培养基：菌落，菌苔固体培养基：菌落，菌苔按按物理状态物理状态来分来分用途：菌种分离、鉴定、计数用途：菌种分离、鉴定、计数保保保保存存存存菌菌菌菌种种种种半固体培养基：半固体培养基：无动力无动力 有动力有动力(弥散弥散)观察细菌的运动、厌氧菌的分离和菌种鉴定观察细菌的运动、厌氧菌的分离和菌种鉴定按按物理状态物理状态来分来分 1 1液体基础培养基液体基础培养基 牛肉膏牛肉膏0.3g0.3g，蛋白胨，蛋白胨1g1g，氯化钠，氯化钠0.5g 0.5g，蒸馏水，蒸馏水100ml100ml，加热溶解以上成分，冷至加热溶解以上成分，冷至40-5040-50，调，调pHpH值至值至7.47.67.47.6，煮沸煮沸3-53-5分钟，补足水分，过滤、分装、高压灭菌。分钟，补足水分，过滤、分装、高压灭菌。2 2半固体基础培养基半固体基础培养基 在液体基础培养基在液体基础培养基100ml100ml中加中加琼脂琼脂0.2-0.5g0.2-0.5g，加热至，加热至100100使琼脂熔化，分装试管，高压灭菌。取出后直立使琼脂熔化，分装试管，高压灭菌。取出后直立放置至琼脂凝固。放置至琼脂凝固。3 3固体基础培养基固体基础培养基 在液体基础培养基在液体基础培养基100ml100ml中加中加琼脂琼脂2-3g2-3g，加热至，加热至100100使使琼脂化，分装于试管和三角烧瓶中，高压灭菌。取出后琼脂化，分装于试管和三角烧瓶中，高压灭菌。取出后趁热将试管倾斜一定角度放置，琼脂凝固后即成普通琼趁热将试管倾斜一定角度放置，琼脂凝固后即成普通琼脂斜面；将三角烧瓶中培养基倾注于灭菌平皿内，凝固脂斜面；将三角烧瓶中培养基倾注于灭菌平皿内，凝固后即成琼脂平板基础培养基。后即成琼脂平板基础培养基。选择培养基选择培养基加入青霉素的培养基加入青霉素的培养基:分离酵母菌、霉菌等真菌分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基加入高浓度食盐的培养基:分离金黄色葡萄球菌分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基不加氮源的无氮培养基:分离固氮菌分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基不加含碳有机物的无碳培养基:分离自养型微生物分离自养型微生物加入青霉素等抗生素的培养基加入青霉素等抗生素的培养基:分离导入了目的基因的受体细胞分离导入了目的基因的受体细胞按按功能功能来分来分添加或缺少某种化学成分用于菌种的分离添加或缺少某种化学成分用于菌种的分离鉴别培养基按按功能功能来分来分当大肠杆菌分解乳糖产酸时细菌带正电当大肠杆菌分解乳糖产酸时细菌带正电荷被染成红色，再与美蓝结合形成紫黑色菌荷被染成红色，再与美蓝结合形成紫黑色菌落，并带有落，并带有绿色金属光泽绿色金属光泽。常用的伊红美蓝。常用的伊红美蓝乳糖培养基，可乳糖培养基，可用来鉴别饮用水和乳制品中用来鉴别饮用水和乳制品中是否存在大肠杆菌等细菌是否存在大肠杆菌等细菌添加某种指示剂后化学药剂用于菌种的鉴别添加某种指示剂后化学药剂用于菌种的鉴别伊红伊红美蓝鉴别大肠杆菌美蓝鉴别大肠杆菌大肠杆菌菌落大肠杆菌菌落伊红美蓝培养基伊红美蓝培养基 天然培养基有血清、血浆、和组织天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：优点：营养成分丰富，培养效果好营养成分丰富，培养效果好缺点：缺点：来源受限来源受限;成分复杂，影响对某成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析些实验产物的提取和实验结果的分析;易发生支原体污染易发生支原体污染;天然培养基：天然培养基：按按化学成分化学成分来分来分 根据细胞生存所需物质的种类和数根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。量，用人工方法模拟合成的。合成培养基主要成分是氨基酸、维合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。些辅助物质。优点：优点：标准化生产，组分和含量相标准化生产，组分和含量相对固定对固定;成本低成本低 缺点：缺点：缺少某些成分，不能完全满缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。足体外细胞生长需要。合成培养基合成培养基:按按化学成分化学成分来分来分血清中含有：血清中含有：多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）多种金属离子；多种金属离子；激素；激素；促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。各种生长因子各种生长因子转移蛋白转移蛋白不明成分不明成分人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。按按化学成分化学成分来分来分不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方 不管哪种培养基，一般都含有不管哪种培养基，一般都含有水水、碳源碳源、和、和氮氮源源、无机盐无机盐、生长因子生长因子(即细菌生长必需，而自身不能合即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)等等营养物质，营养物质，另外还需要满足微生物生长对另外还需要满足微生物生长对pH pH、氧气氧气、渗透渗透压压的要求的要求细菌喜荤，霉菌喜素细菌喜荤，霉菌喜素大肠杆菌配方：酵母提取物：大肠杆菌配方：酵母提取物：0.5g蛋白胨：蛋白胨：0.5gNacl：0.5g琼脂琼脂：1g水水:50ml细菌喜中性偏碱，霉菌喜中性偏酸细菌喜中性偏碱，霉菌喜中性偏酸LBLB固体培养基固体培养基大肠杆菌菌液（大肠杆菌菌液（LBLB液体培养基）液体培养基）大肠杆菌培养基：一般用大肠杆菌培养基：一般用LB液体培养基来扩大培养大液体培养基来扩大培养大肠杆菌，培养后可在肠杆菌，培养后可在LB固体培养基上划线分离。固体培养基上划线分离。大肠杆菌的扩大培养大肠杆菌的扩大培养好氧型好氧型好氧型好氧型将斜面上培养的大肠杆菌菌种接种到将斜面上培养的大肠杆菌菌种接种到灭菌后的灭菌后的液体培养基液体培养基中中,使其在使其在3737摇床培养摇床培养1212小时。小时。注意事项注意事项:1.1.火焰旁火焰旁从斜面上用接种环取菌从斜面上用接种环取菌;2.2.取菌前取菌前接种环要接种环要用酒精灯用酒精灯灼烧灼烧灭菌灭菌,冷却后方能取菌冷却后方能取菌;3.3.取菌后封口膜和棉塞复原取菌后封口膜和棉塞复原.二、无菌技术二、无菌技术从制备培养基到接种与培养等全部实验从制备培养基到接种与培养等全部实验过程要无菌操作过程要无菌操作（1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒洁和消毒；（2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌灭菌；（3）为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精）为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行；灯火焰附近进行；（4）避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接）避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。触。获得纯净培养物的关键获得纯净培养物的关键:消毒与灭菌消毒与灭菌 (1)(1)消毒：消毒：概念：使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表概念：使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的面或内部一部分对人体有害的微生物微生物。包括芽孢和。包括芽孢和孢子吗？孢子吗？不包括不包括防止外来杂菌的入侵防止外来杂菌的入侵1 1、煮沸消毒法煮沸消毒法:100100煮沸煮沸5-6min5-6min（日常生活常用）日常生活常用）2 2、巴氏消毒法巴氏消毒法：70-75 70-75 下煮下煮30min30min或或 80 80 下煮下煮15min 15min （对一些不耐高温的液体，常用于鲜奶的消毒对一些不耐高温的液体，常用于鲜奶的消毒）3 3、化学药剂消毒法化学药剂消毒法:用用75%75%酒精、新洁尔灭等进酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒行皮肤消毒;氯气消毒水源氯气消毒水源（双手使用酒精消毒）（双手使用酒精消毒）4 4、紫外线消毒紫外线消毒消毒的方法：消毒的方法：对接种室、接种箱或超净工作台首先喷洒碳酸和煤酚皂等溶液以对接种室、接种箱或超净工作台首先喷洒碳酸和煤酚皂等溶液以增强消毒效果，然后用紫外线进行物理消毒增强消毒效果，然后用紫外线进行物理消毒（2 2）灭菌）灭菌概念：使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的概念：使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。微生物，包括芽孢和孢子。方法：方法：a a 灼烧灭菌灼烧灭菌 b b干热灭菌干热灭菌 c c 高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌a 灼烧灭菌灼烧灭菌 微生物的接种工具微生物的接种工具(接接种环、接种针种环、接种针)或其他或其他金属用具直接在火焰的金属用具直接在火焰的充分燃烧层灼烧充分燃烧层灼烧b 干热灭菌干热灭菌 160170；12h能耐高温的需要保持干能耐高温的需要保持干燥的物品燥的物品(玻璃器皿玻璃器皿)C 高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌 100kPa 121 15-30min通常用于培养基、无菌水的灭菌通常用于培养基、无菌水的灭菌补充：补充：表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯灭菌法，所用器械是紫外灯培养基灭菌培养基灭菌 基础培养基：基础培养基：121121高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌1515分钟分钟 含糖培养基：含糖培养基：9090以上灭菌以上灭菌3030分钟分钟 鸡蛋、血清培养基：鸡蛋、血清培养基：间歇灭菌间歇灭菌3 3天天3 3次次 不耐高温的液体成分：不耐高温的液体成分：G6G6玻璃砂漏斗滤过除菌玻璃砂漏斗滤过除菌细菌检验的操作需在无菌室或细菌检验的操作需在无菌室或超净工作台超净工作台内进内进行。行。无菌室、超净工作台使用前后需进行消毒。无菌室、超净工作台使用前后需进行消毒。细菌检验使用的物品使用前后需严格灭菌细菌检验使用的物品使用前后需严格灭菌标本的采集标本的采集无菌试管、烧瓶的使用无菌试管、烧瓶的使用3.3.无菌环境无菌环境4.4.接种前准备接种前准备用肥皂洗手并使用酒精消毒。用肥皂洗手并使用酒精消毒。点燃酒精灯点燃酒精灯酒精棉擦拭双手酒精棉擦拭双手酒精棉擦拭桌面酒精棉擦拭桌面1.1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？外来微生物污染外，还有什么目的？2.2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。如果需要，请选择合适的方法。（1 1）培养细菌用的培养基与培养皿培养细菌用的培养基与培养皿（2 2）玻棒、试管、烧瓶和吸管玻棒、试管、烧瓶和吸管（3 3）实验操作者的双手实验操作者的双手答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（答：（1）、（）、（2）需要灭菌；（）需要灭菌；（3）需要消毒。）需要消毒。1配制培养基配制培养基包器材包器材灭菌灭菌菌种扩增菌种扩增倒平板倒平板接种、划线接种、划线培养培养观察记录观察记录实验流程实验流程三、大肠杆菌的分离三、大肠杆菌的分离倒平板倒平板接种、划线接种、划线灼烧接种环灼烧接种环取菌液取菌液划线分离划线分离烧至暗红烧至暗红接种、划线接种、划线灼烧接种环灼烧接种环取菌液取菌液划线分离划线分离菌液膜菌液膜接种、划线接种、划线1 1、划线分离法、划线分离法为什么通过划线分离可得到单菌落？为什么通过划线分离可得到单菌落？每划完一个区域要不要灼烧接种环？每划完一个区域要不要灼烧接种环？一旦划破，会造成划线不均匀，难一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；以达到分离单菌落的目的；二是存留在划破处的单个细胞无法二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。处生长，会形成一个条状的菌落。恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，倒恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，倒放培养皿则会使水蒸气凝结成水滴留在盖上；如果正放，放培养皿则会使水蒸气凝结成水滴留在盖上；如果正放，则水分形成的水滴会落入培养基表面并扩散开。如果培养则水分形成的水滴会落入培养基表面并扩散开。如果培养皿中已形成菌落，则会导致菌随水扩散，很难再分成单菌皿中已形成菌落，则会导致菌随水扩散，很难再分成单菌落，达不到分离目的。落，达不到分离目的。(1).(1).为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？什么？操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。(2).(2).在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？后再进行划线？(3).(3).在作第二次以及其后的划线操作时，为在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？什么总是从上一次划线的末端开始划线？以免接种环温度太高，杀死菌种。以免接种环温度太高，杀死菌种。划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。2 2、涂布分离法、涂布分离法是指将培养的菌液稀释一定的倍数是指将培养的菌液稀释一定的倍数,然后取一定量稀释然后取一定量稀释液加在固体培养基上液加在固体培养基上,用玻璃刮刀涂布在培养基平面上用玻璃刮刀涂布在培养基平面上.37370 0C C恒温培养箱恒温培养箱划线分离法和涂布分离法哪个更好呢？划线分离法和涂布分离法哪个更好呢？划线分离：划线分离：方法简单，但单方法简单，但单菌落较难分开。菌落较难分开。涂布分离：涂布分离：单菌落更易分开，单菌落更易分开，但操作复杂。但操作复杂。分离后分离后,一个菌体一个菌体便会形成一个菌落便会形成一个菌落,这是这是消除污染杂菌消除污染杂菌的通用方法的通用方法,也是用于也是用于筛选高表筛选高表达量菌株达量菌株的最简便的最简便方法之一方法之一大肠杆菌分离后保存大肠杆菌分离后保存1 1、临时保藏：、临时保藏：接种到固体斜接种到固体斜面培养基，菌面培养基，菌落长成后置于落长成后置于44冰箱保存。冰箱保存。2 2、长期保存：、长期保存：甘油冷冻管藏甘油冷冻管藏法法