非洲猪瘟病毒核酸恒温荧光扩增检测试剂盒 标签及说明书.docx

附件2 （略）注册目录产品名称研制单位非洲猪瘟病毒核酸恒温荧光扩增 检测试剂盒广东省农业科学院动物卫生研究所、华南农业大学、郑州中道生物技术有 限公司、天津威特生物医药有限责任公司、禾旭（郑州）生物技术有限公 司非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂 盒唐山怡安生物工程有限公司、中海生物技术（枣庄）有限公司、卡尤迪智 农科技（北京）有限公司、黑龙江省动物疫病预防与控制中心、河北省动 物疫病预防控制中心、哈药集团生物疫苗有限公司附件3 （略）附件4说明书和标签一、非洲猪瘟病毒核酸恒温荧光扩增检测试剂盒说明书和内包装标签（-）非洲猪瘟病毒核酸恒温荧光扩增检测试剂盒说明书【兽药名称】通用名非洲猪瘟病毒核酸恒温荧光扩增检测试剂盒商品名无英文名 African Swine Fever Virus Nucleic Acid Fluorescent Isothermal Amplification Detection Kit汉语拼音 Feizhouzhuwen Bingdu Hesuan Hengwen Yingguang Kuozeng Jiance Shijihe 【主要成分与含量】【用法与判定】详见说明书。成分数量含量干粉反应管2袋/盒16管/袋Buffer A1管/盒1500 )41/管Buffer B1管/盒90可/管【贮藏与有效期】-20C以下保存，有效期为12个月。【生产企业】仅供兽医诊断使用 邈 组织样本裂解液1500 W管批 号：有效期至：【用法与判定】 详见说明书。【贮藏与有效期】28保存，有效期为12个月。【生产企业】仅供兽医诊断使用 邈 样本稀释液12 ml/管批 号：有效期至：【用法与判定】 详见说明书。【贮藏与有效期128保存，有效期为12个月。【生产企业】仅供兽医诊断使用阳性对照阴性对照1管/盒1管/盒160(41/管160皿管【作用与用途】 用于猪血液、脾脏、肝脏、淋巴结、扁桃体、肾脏、肌肉等样品中非洲猪瘟病 毒核酸的检测。【用法与判定】1用法待检样品采集、保存及运输1.1.1 样品采集血液样品 无菌采集抗凝血或血清5 mlo1.1.1.1 组织样品 无菌采集脾脏、肝脏、淋巴结、扁桃体、肾脏、肌肉等组织样品，2c 8低温运输至实验室用于检测。1.1.2 样品保存 采集的样品在28c保存应不超过24小时，-70条件下可长期保存，避 免反复冻融。1.1.3 样品运输 保温箱加冰袋后密封进行运输。包装和运输应符合农业农村部高致病性 动物病原微生物菌(毒)种或者样本运输包装规范和交通运输部门关于危险品运输管理的有关 规定。1.2 样品处理1.2.1 血液样品处理 待检样品需先在60条件下灭活30分钟。抗凝血样品在灭活后置于 离心管中，1000 g离心10分钟，取200 上层血浆于RNase/DNase - free无菌离心管中，编号备 用。非抗凝血样品置于离心管中，待凝固后，1000 g离心10分钟，取200 pl上层血清于RNase/DNase - free无菌离心管中，编号备用。1.2.2 组织样品处理 取适量脾脏、肝脏、淋巴结、扁桃体、肾脏、肌肉等组织，置于研磨 器或研磨管中研磨，在60C条件下灭活30分钟,再加适量生理盐水或PBS混匀，制成约10%(g/ml) 的组织匀浆，2000g离心5分钟，取200川上清于RNase/DNase-free无菌离心管中，编号备用。1.3 病毒核酸的提取用商品化的磁珠法或柱膜法核酸提取试剂盒按其说明书操作方法提 取DNA核酸。1.4 核酸扩增1.4.1 取出试验需要数量的干粉反应管，设定为no其中n=阴性对照数(1T) +阳性对照数 (1T) +待检样品数。1.4.2 在取出的干粉反应管中依次加入Buffer A 42.5可，然后加入5篦待检样品，最后管内 盖依次加入Buffer B 2.5可。每次检测应设立阳性对照和阴性对照，按照上述加样方式进行操作， 阳性对照、阴性对照的加样量为5可。1.4.3 将以上干粉反应管盖好管盖，瞬时离心，充分混匀，用力上下颠倒振荡10次，再次瞬 时离心，确保管壁上不沾有液滴。1.4.4 将配置好的体系立即放入MA-1600型等温荧光PCR仪，设置反应程序为：39,采 光间隔30秒，反应时间20分钟，收集荧光信号，荧光通道选择FAM通道。2结果判定2.1结果分析条件的设定 设置阈值为300,基线期：起始值设置为1.0 min,终止值设置为3.0 mino每个样品反应管内的荧光信号累积达到设定的阈值时所经历的时间(Threshold Time)即 为TT值。2.2 试验成立条件 阳性对照有典型的扩增曲线出现，且TT值W15.0min；阴性对照无TT 值且无典型的扩增曲线，则试验结果成立；否则结果不成立。2.3 样品结果判定若TT值W17.5min,且有典型的扩增曲线，判定为阳性；2.3.1 若无TT值且无典型的扩增曲线，判定为阴性；2.3.2 若17.5 minVTT值W20.0 min,且出现典型的扩增曲线，判为可疑，建议重复检测进 行确认。重复检测后，若TT值W20.0min,且有典型的扩增曲线，则判定为阳性。【注意事项】(1)本试剂盒仅用于体外诊断使用，操作人员必须经过培训。试验前请仔细阅读 本试剂盒说明书，严格按照操作步骤执行，在操作过程中对时间、试剂体积等精确控制可以获得 最好的结果。(2)实验室应严格按照有关规定分区管理，依照配液区一模板提取区一扩增区一分析区顺序 进行基因检测。各区间人员、器材、试剂及空气流向应有严格要求。(3)核酸提取有关耗材确保洁净、无DNase/RNase,提取过程尽量低温、快速，完成后进入 下一步试验或冻存。(4)对于顶部采光仪器要带新的一次性PE手套对样品管封盖，对于底部采光仪器要避免徒 手或使用过的手套接触样品管管底，检测过程中使用不带荧光物质的一次性乳胶手套。(5)冻存试剂使用前应于室温下完全融化，瞬时离心使液体完全沉于管底。避免反复冻融， 以免影响试剂性能。操作时应注意避光，避免强光暴露和长时间光照。(6)待检样品、阳性对照等在使用后及时封盖，避免组分间及气溶胶等的污染造成假阳性。(7)在向干粉反应管中加入Buffer A、Buffer B和待测样品后，务必充分混匀，并立即上机 检测。(8)扩增产物禁止开盖，试验产生的废弃物应及时收集，远离PCR实验室进行无害化处理。【规格】32个检测/盒【贮藏与有效期】-20以下保存，有效期为12个月。【批准文号】【生产企业】仅供兽医诊断使用(二)非洲猪瘟病毒核酸恒温荧光扩增检测试剂盒内包装标签n非洲猪瘟病毒核酸恒温荧光扩增检测试剂盒32个检测/盒批准文号：批 号：有效期至：【用法与判定】 详见说明书。【贮藏与有效期】-20以下保存，有效期为12个月。【生产企业】仅供兽医诊断使用兽用干粉反应管16管/袋批 号:有效期至:【作用与用途】详见说明书。【用法与判定】 详见说明书。【贮藏与有效期】-20C以下保存，有效期为12个月。【生产企业】仅供兽医诊断使用Buffer A兽用1500似/管批 号:有效期至:【作用与用途】【用法与判定】【贮藏与有效期】【生产企业】详见说明书。详见说明书。-20以下避光保存，有效期为12个月。仅供兽医诊断使用Buffer BBuffer B兽用90业管批 号:有效期至:【作用与用途】【用法与判定】【贮藏与有效期】【生产企业】详见说明书。详见说明书。-20以下保存,有效期为12个月。仅供兽医诊断使用兽用阳性对照160 W管160 W管批 号:有效期至:【作用与用途】详见说明书。【用法与判定】详见说明书。【贮藏与有效期】-20以下保存，有效期为12个月。【生产企业】仅供兽医诊断使用阴性对照160 W管批号：有效期至:【作用与用途】详见说明书。【用法与判定】详见说明书。【贮藏与有效期】-20以下保存，有效期为12个月。【生产企业】仅供兽医诊断使用二、非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒说明书和内包装标签（一）非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒说明书【兽药名称】通用名 商品名 英文名非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒 无African Swine Fever Virus Fluorescence PCR Detection Kit汉语拼音 Feizhou Zhuwen Bingdu Yingguang PCR Jiance Shijihe【主要成分与含量】序号组成成分规格/数量24个检测/盒50个检测/盒100个检测/盒1 PCR反应液2 阴性对照3 阳性对照4 样本稀释液5 组织样本裂解液6 说明书480 |11/管X150 W管xl50皿管xl12 ml/管 xl1500 可/管xl1000 W管 x l100 W管xl100 W管 X1121111/管义21500 W管xl 1份1000 W管X2150 W管xl 150业管xl 12 ml/<x41500业管xl【作用与用途】 用于猪口鼻眼拭子、猪肉组织、猪脏器、血液、血清等样本中非洲猪瘟病毒核 酸的检测。【用法与判定】1用法1.1 样本的采集、处理和保存采样过程中样本不得交叉污染，采样及样本前处理过程中须 戴一次性手套。采集的样本一律进行灭活处理。1.1.1 采样器具拭子、剪刀、镒子、一次性注射器、采样管（1.5 ml离心管或其他规格）、 采样袋。所有采样器具应无菌处理（高温干烤或高压灭菌）。1.1.2 样本采集1.1.2.1 口鼻眼拭子样本 用专用采样拭子，适度拭抹口腔分泌物和鼻腔分泌物，眼分泌物 要用拭子在眼睑下充分擦拭，迅速将拭子放入装有400|J样本稀释液的采样管中，在靠近顶端处折 断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥。将采集的样本置于65c水浴灭活30分钟。1.1.2.2 猪肉组织及脏器 用无菌剪、镜采集待检脏器，装入无菌采样袋或其它灭菌容器。 将采集的样本置于65 水浴灭活30分钟。1.1.2.3 血液和血清 抽取猪静脉血1mL置于含有适量抗凝剂的采血管中（抗凝剂建议采 用EDTA或柠檬酸三钠，不应采用肝素）。将采集的样本置于65水浴灭活30分钟。抽取猪静脉 血1 ml,注入无菌收集管中，放室温不超过4小时，待样本自行析出血清，或直接1600 rpm离心5 分钟获取血清，转移至新的灭菌离心管中。将采集的样本置于65水浴灭活30分钟。1.1.3 样本保存 采集的灭活待测样本可立即用于检测，灭活待测样本在28c保存不应超 过三天；-20C以下保存不超过一个月；-70C以下可以长期保存。应避免反复冻融。1.1.4 样本处理1.1.4.1 猪口鼻眼拭子 无需样本处理，混匀后即可取5出拭子悬液直接上样。1.1.4.2 猪肉组织和脏器样本 无菌取黄豆粒大小的样本（约0.1 g）置于无菌1.5 ml离心管中 后，加入2003样本稀释液，使用组织研磨器充分研磨至匀浆。另取出一个新的无菌1.5 ml离心管, 加入15 Hl的组织样本裂解液，再加入15 m的上述组织匀浆液，涡旋混匀，置于95加热5分钟后, 12000 rpm离心2分钟，吸取上清液5 M上样。1.1.4.3 全血样本 用样本稀释液进行10倍稀释后，即可取5比直接上样。1.1.4.4 血清样本 用样本稀释液进行5倍稀释后，即可取5 m直接上样。1.2 荧光PCR扩增1.2.1 扩增试剂准备 取出PCR反应液、阴性对照和阳性对照，待所有组分完全溶解后，振 荡混匀5秒，瞬时离心5秒。1.2.2 配制反应体系 按下表体系，在PCR管中配制反应体系。成分体积PCR反应液20pl预处理的样本（或阳性对照/阴性对照）5 |11总体积25|11以上操作建议在冰浴条件下进行，加样完毕后压紧管盖，瞬时离心。1.2.3 PCR 扩增1.2.3.1 将反应管放置于PCR仪内，记录加样顺序，同时按下表设置反应条件。阶段 温度时间循环数95 5 秒15个循环505 秒95 1分钟1个循环95 5 秒30个循环55 30秒（收集荧光）1.2.3.2 荧光通道的选择 选择FAM通道检测ASFV的核酸。2判定2.1 质控标准2.1.1 阴性对照FAM检测通道无S型扩增曲线且无Ct值。2.1.2 阳性对照FAM检测通道有典型S型扩增曲线且Ct值W23.0。2.1.3 试验成立 阴性对照和阳性对照检测均符合上述结果，则试验有效，否则此次试验无 效。2.2 结果判定2.2.1 阴性 如果样本在FAM通道无典型S型扩增曲线且无Ct值或Ct值2270则判定为非洲 猪瘟病毒核酸检测阴性。222阳性 如果样本在FAM通道有典型Ct值W23O并有典型S型扩增曲线，则判定为非 洲猪瘟病毒核酸检测阳性。223复检 如果样本Ct值在23.027.0之间，判为可疑进行重检，如重检结果Ct值27,且 有明显扩增曲线，则判定为非洲猪瘟病毒核酸检测阳性；若Ct值V27O但无明显扩增曲线或Ct 值227.0或无Ct值，判定为非洲猪瘟病毒核酸检测阴性。【注意事项】(1)开始检测前请仔细阅读本说明书，按要求操作。(2)各区物品均为专用，不得交叉使用，避免污染；试验后立即清洁工作台。(3)扩增产物的污染，很容易出现假阳性结果。因此，临床试验室应严格按照临床基因 扩增试验室工作规范配备设备及操作人员。(4)本试剂盒仅在兽医指导下使用，对病猪的临床诊治应结合其症状/体征，病史，其他试 验室检查及治疗反应等情况综合考虑。(5)检测为阴性，并不完全代表为非感染状态，具体诊断结果须结合其他临床诊断结果判 断。造成检测为阴性的可能是：不合理样本采集、转运及处理、样本中病毒浓度过低，未经 验证的其他干扰因素如：服用抗病毒药物等。(6)样本中DNA浓度低于本产品的最低检出限时可能出现假阴性。(7)核酸反应液分装时应尽量避免产生气泡，上机前注意检查各荧光定量PCR反应管是否盖 紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。(8)扩增完毕立即取出荧光定量PCR反应管，密封在自封袋内并做无害化处理。(9)待检样本需要按照有潜在传染性的材料处理，对样本及其废弃物的操作和处理必须严 格遵守生物安全规定。(10)试验中用过的离心管、Tip头等耗材请打入盛有消毒液的废物缸内，并与其他废弃物品 一同做无害化处理。(11)检测场所、工作台及各种试验用品定期用1%次氯酸钠、75%酒精或紫外灯进行消毒。 【规格】(1)24个检测/盒 (2) 50个检测/盒 (3) 100个检测/盒【贮藏与有效期】 本试剂盒中组织样本裂解液和样本稀释液应储存于28；其余组分应储存 于-20以下避光条件，有效期均为12个月。【批准文号】【生产企业】仅供兽医诊断使用(二)非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒内包装标签邈非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒24个检测(50个检测、100个检测)/盒批准文号：批 号：有效期至：【用法与判定】详见说明书。【贮藏与有效期】-20以下避光保存，有效期为12个月。【生产企业】仅供兽医诊断使用 n 非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒24个检测（50个检测、100个检测）/盒批准文号：批 号：有效期至：【作用与用途】详见说明书。【用法与判定】详见说明书。【贮藏与有效期】28保存，有效期为12个月。【生产企业】仅供兽医诊断使用 邈 PCR反应液480 M/管（1000 口/管）批 号：有效期至：【用法与判定】详见说明书。【贮藏与有效期】-20以下保存，有效期为12个月。【生产企业】仅供兽医诊断使用 n 阴性对照50 W管（100W管、150 W管）批 号：有效期至：【用法与判定】 详见说明书。【贮藏与有效期】-20以下保存，有效期为12个月。【生产企业】仅供兽医诊断使用 n 阳性对照50 W管（100W管、150 W管）批 号：有效期至：