第五章分子荧光分析法2.ppt

荧光法的主要优点是灵敏度高，一般紫外可见分光光度法的灵敏度约为107g/mL。而荧光法的灵敏度可达到1010g/mL1012g/mL。标准曲线的线性范围宽,一般为35个数量级，吸收光度法一般为l2个数量级由于不是所有能吸光的物质都能产生荧光，所以荧光法的应用受到一定限制，但通过选择合适的荧光衍生试剂与其反应，生成具有荧光的物质（称衍生物荧光法），从而扩大了该法的应用范围。根据激发光的波长不同，荧光可分为射线荧光、紫外可见荧光和红外荧光等。根据发射荧光的粒子不同，荧光又可分为分子荧光和原子荧光。物质吸收一定能量后跃迁到激发态，物质吸收一定能量后跃迁到激发态，激发态以辐射的形式释放能量返回激发态以辐射的形式释放能量返回低能态或基态低能态或基态S2分子吸光与发光示意图分子吸光与发光示意图 Ee振振动动能能级级v3v2v1转动转动r3r2r1S1S0 紫外紫外荧光荧光磷光磷光T2T1可见可见 Ev Er红外红外单重单重态态 三重态三重态系间系间窜跃窜跃一、分子荧光分析法简介一、分子荧光分析法简介(对光的吸收对光的吸收)光致发光（光致发光（Photoluminescence）:荧光和磷光荧光和磷光是分子吸光成为激发态分子，在返回基态时的发光是分子吸光成为激发态分子，在返回基态时的发光现象现象.荧光：荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低振受光激发的分子从第一激发单重态的最低振动能级回到基态所发出的辐射。动能级回到基态所发出的辐射。磷光：磷光：从第一激发三重态的最低振动能级回到基从第一激发三重态的最低振动能级回到基态所发出的辐射。态所发出的辐射。第一节基本原理物质分子内部有三种运动。每个电子能级含有若干振动能级，每个振动能级含有若干转动能级。室温时，分子处于电子基态的最低振动能级。光照时，吸收一定波长的物质分子跃迁成为激发态分子。激发态分子不稳定，通过辐射跃迁或无辐射跃迁释放能量返回基态称为去激发过程。基态S:激发单重态第一、第二T:激发三重态振动驰豫振动驰豫 (Vibrational relaxationVR):分子碰撞以热分子碰撞以热的形式释放能量，无辐射跃迁。的形式释放能量，无辐射跃迁。内部转换内部转换(Internal Conversion，IC)：高：高能态能态S2以热能形式释放能量过渡到较低能态以热能形式释放能量过渡到较低能态S1，无辐射跃迁。，无辐射跃迁。荧光荧光(Fluorescence)受光激发的分子从第受光激发的分子从第一激发单重态的最低振动能级一激发单重态的最低振动能级,以光辐射形以光辐射形式放出能量，回到基态各振动能级。式放出能量，回到基态各振动能级。外转换外转换(External convertion,EC)：被激分：被激分子与溶剂分子或其他溶质分子相互作用以热子与溶剂分子或其他溶质分子相互作用以热形式释放能量，属于无辐射跃迁。形式释放能量，属于无辐射跃迁。系间跨跃系间跨跃(Intersystem Crossing,ISC)：无：无辐射跃迁辐射跃迁磷光磷光(Phosphorescence)：经系间跨越成为：经系间跨越成为激发三重态，并通过振动驰豫降至激发三重激发三重态，并通过振动驰豫降至激发三重态最低能级，然后以光辐射形式释放能量，态最低能级，然后以光辐射形式释放能量，回到基态。回到基态。二、激发光谱与荧光光谱由于荧光属于被激发后的发射由于荧光属于被激发后的发射光谱，因此，任何荧光化合物，光谱，因此，任何荧光化合物，都具有两种特征的光谱：激发都具有两种特征的光谱：激发光谱和荧光发射光谱。光谱和荧光发射光谱。Fluorometer:The BasicsExcitation WavelengthSelectionEmissionWavelengthSelectionSampleLight SourceDetectorComputerExcitation PolarizerEmission PolarizerFluorometer Components激发光谱激发光谱excitation spectrum固定荧光波长，连续改变激发光的波长，测定不同激发光波长下荧光强度的变化，以激发光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，即为该物质的激发光谱。激发光谱相当于荧光物质的表观吸收光谱。保保持持荧荧光光发发射射波波长长不不变变（即即固固定定发发射射单单色色器器），依依次次改改变变激激发发光光波波长长（即即调调节节激激发发单单色色器器），测测定定不不同同波波长长的的激激发发光光激激发发下下得得到到的的荧荧光光强强度度F（即即激激发发光光波波长长扫扫描描）。然然后后以以激激发发光光波波长长为为横横坐坐标标，以以荧荧光光强强度度F为为纵纵坐坐标标作作图图，就就可可得得到到该该荧光物质的激发光谱。荧光物质的激发光谱。激发光谱激发光谱通过扫描激发单色器，使不同波 长的入射光照射激发荧光体，发出的荧光通过固定波长的发射单色器而照射到检测器上，检测其荧光强度，最后通过记录仪记录光强度对 激发光波长的关系曲线，即为激发光谱。通过激发光谱，选择最佳激发波长发射荧光强度最大的激发光波长，常用ex表示。荧光光谱fluorescence emission spectrum 固定激发光的波长和强度，测量不同荧光波长下的荧光强度，以荧光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标，称为荧光发射光谱，简称荧光光谱。一般选择最强荧光波长em作为测定波长萘的激发光谱、荧光和磷光光谱 荧光光谱的特征1.斯托克斯位移在溶液荧光光谱中，所观察到的荧光发射波长总是大于激发波长，emex。Stokes于1852年首次发现这种波长位移现象，故称Stokes位移。斯托克斯位移说明了在激发与发射之间存在着一定的能量损失。激发态分子由于振动弛豫及内部转移的无辐射跃迁而迅速衰变到S1电子激发态的最低振动能级，这是产生其位移的主要原因；其次，荧光发射时，激发态的分子跃迁到基态的各振动能级，此时，不同振动能级也发生振动弛豫至最低振动能级，也造成能量的损失；第三，溶剂效应和激发态分子可能发生的某些反应，也会加大斯托克斯位移。2.荧光发射光谱的形状与激发波长无关由于荧光发射是激发态的分子由第一激发单重态的最低振动能级跃迁回基态的各振动能级所产生的，所以不管激发光的能量多大，能把电子激发到哪种激发态，都将经过迅速的振动弛豫及内部转移跃迁至第一激发单重态的最低能级，然后发射荧光。因此除了少数特殊情况，如S1与S2的能级间隔比一般分子大及可能受溶液性质影响的物质外，荧光光谱只有一个发射带，且发射光谱的形状与激发波长无关。荧光激发光谱的形状与发射波长无关由于在稀溶液中，荧光发射的效率(称为量子产率)与激发光的波长无关，因此用不同发射波长绘制激发光谱时，激发光谱的形状不变，只是发射强度不同而已。荧光激发发光谱与吸收光谱的形状相近似，荧光发射光谱与吸收光谱成镜像关系物质的分子只有对光有吸收，才会被激发，所以，从理论上说，某化合物的荧光激发光谱的形状，应与它的吸收光谱的形状完全相同。然而实际并非如此，由于存在着测量仪器的因素或测量环境的某些影响，使得绝大多数情况下，“表观”激发光谱与吸收光谱两者的形状有所差别。只有在校正仪器因素后，两者才非常近似，而如果也校正了环境因素后，两面的形状才相同。如果把某种物质的荧光发射光谱和它的吸收光谱相比较低，便会发现两者之间存在着“镜像对称”关系。三、荧光强度与分子结构的关系（一）物质产生荧光的必要条件第一是物质分子必须有强的紫外可见吸收；第二是必须具备较高的荧光效率(fluorescence efficiency)。荧光量子产率荧光量子产率物质分子发射荧光的能力用荧光量子产率（物质分子发射荧光的能力用荧光量子产率（）表示表示：许多物质不能发射荧光，因为激发态分子释放能量的过程除荧光发射外，还有其它辐射和无辐射跃迁过程与之竞争。与失活过程的速率常数与失活过程的速率常数k k有关有关凡是使荧光速率常数凡是使荧光速率常数k kf f增大而使其他失活过程（系增大而使其他失活过程（系间窜越、外转换、内转换）的速率常数减小的因素间窜越、外转换、内转换）的速率常数减小的因素都可使荧光增强。都可使荧光增强。（二）荧光强度与分子结构的关系一个化合物能否产生荧光，荧光强度的大小，ex(max)和em(max)的波长位置均与其分子结构有关。下面简述影响分子荧光强弱的一些结构规律。1 跃迁类型 2 共轭效应3刚性结构和共平面效应4 取代基效应1.具有 电子跃迁类型的结构 实验表明，大多数能发荧光的化合物都是由*或n*跃迁激发，然后经过振动弛豫等无辐射跃迁，再发生*或*n跃迁而产生荧光。而其中吸收时*跃迁的摩尔吸光系数大，跃迁寿命短，因此荧光发射的速率常数Kf值较大，荧光发射的效率高。因此，跃迁发射荧光的强度大。此外，在跃迁过程中，通过系间跨跃从单重态跃迁至三重态的速率常数KISC也比较小，有利于荧光的发射。总之，*跃迁的类型是产生荧光的最主要跃迁类型。2.具有大的共轭键结构发生荧光(或磷光)的物质，其分子都含有共轭双键(键)的结构体系。共轭体系越大，电子的离域性越大，越容易被激发，荧光也就越容易发生，且荧光光谱向长波移动。例如具有芳环或杂环的物质，芳环越大，其荧光(或磷光)峰越向长波移动，且荧光强度往往也较强。例如苯和萘的荧光位于紫外区，蒽位于蓝区。苯萘蒽维生素A205nm286nm356nm327nm278nm321nm404nm510nm0.110.290.36具有芳环或杂环的物质，芳环越大，其荧光峰越向长波移动，且荧光强度往往也较强。例如苯和萘的荧光位于紫外区，蒽位于蓝区。3.具有刚性平面结构实验发现，多数具有刚性平面结构的有机化合物分子都具有强烈的荧光，因为这种结构可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其他溶质分子之间的相互作用减少，即可减少能量外部转移的损失，有利于荧光的发射。而且平面结构可以增大分子的吸光截面，增大摩尔吸光系数，增强荧光强度。酚酞与荧光黄(亦称荧光素)的结构十分相近，只是由于荧光黄分子中的氧桥使其具有刚性平面结构，因而在溶液中呈现强烈的荧光，在0.1molL-1的NaOH溶液中，荧光效率达0.92，而酚酞却没有荧光。芴与联二苯，由于芴中的亚甲基使分子的刚性平面增加，导致两者在荧光性质上的显著差别，前者荧光产率接近于1，后者仅为0.18。萘与维生素A都具有5个共轭键，而前者为平面结构，后者为非刚性结构，因而前者的荧光强度为后者的5倍。4.取代基的影响取代基的性质(尤其是生色基团)对荧光体的荧光特性和强度均有强烈的影响。芳烃及杂环化合物的荧光激发光谱、发射光谱及荧光效率常随取代基的不同而异。一般说来，给电子取代基如-OH，-NH2，-OR，-NR2等能增强荧光；而吸电子取代基如-NO2，-COOH，-CO，卤素离子等使荧光减弱。苯及其衍生物的荧光（乙醇溶液）参考资料苯及其衍生物的荧光（乙醇溶液）参考资料化化 合合 物物分分 子子 式式荧荧 光光 波波 长长/nm相对荧光强度相对荧光强度苯苯甲苯甲苯丙苯丙苯氯苯氯苯溴苯溴苯苯酚苯酚苯甲醚苯甲醚苯胺苯胺苯胺离子苯胺离子苯甲酸苯甲酸硝基苯硝基苯C6H6C6H5CH3C6H5C3H7C6H5ClC6H5BrC6H5OHC6H5OCH3C6H5NH2C6H5NH3+C6H5COOHC6H5NO2270 031031027027032032027027032032027527534534529029038038028528536536528528534534531031040540531039039010171075182020030有些物质本身不发荧光或荧光较弱，但和金属离子形成配合物后，如果刚性和共平面性增加，就可以发荧光或增强荧光。如8-羟基喹啉是弱荧光物质，与Mg2+、Al3+等金属离子形成的配合物的荧光增强，利用这一特点可以间接测定金属离子。四、荧光强度与荧光物质浓度的关系分光光度法是测定物质对光的吸收程度；荧光分析法是测定物质吸收了一定频率的光之后，物质本身所发射的荧光强度。当溶液中的荧光物质被入射光激发后，可以在各个方向观察到荧光，由于激发光一部分可透过溶液，所以在透射光方向观察荧光是不适宜的，一般是在与透射光垂直的方向观察荧光。测定荧光强度时，要选择两个不同的波长：一个是物质吸收的光，即激发光的波长；另一个是被激发物质发射的光，即荧光的波长。溶液的荧光强度与该溶液对光的吸收程度以及溶液中荧光物质的荧光效率有关。吸收的光量(光强)Ia应为入射光的光强I0与透射光的光强It之差，即：IaI0It根据朗伯根据朗伯-比尔定律比尔定律Ia=I0-It=I0(1-10-bc)根据荧光效率的定义，荧光强度IF为吸收激发光的量子数Ia与荧光效率的乘积。当溶液浓度很稀时，荧光强度与物质的荧光效应、激发光强度，物质的吸光系数以及溶液的浓度成正比。F=I01-(1-2.303 bc)=2.303 I0 bc对于给定的荧光物质，当激发光波长和强度固定时，荧光强度与溶液浓度成正比。IF=Kc当浓度较大，bc0.02时，线性关系将受到破坏。其原因是受激后的激发态分子与体系中的其他分子所碰撞，使其以非辐射击跃迁的形式去激化，产生荧光猝灭，或者激发态分子所发射的荧光被没受激发的分子所吸收，所以发生所谓的“自吸收”现象而使荧光减弱。为了减少碰撞去激发的机会，可以用降低温度，增大溶液粘度或把荧光物质附着在固体支撑物测定的方法，以减少猝灭效应。五、影响荧光强度的外部因素1.温度溶液荧光强度随着温度的降低而增强。随着温度的降低，介质粘度增加，荧光物质分子与溶剂分子碰撞也随之减少，减少了无辐射去激发过程。2.溶剂荧光光谱的位置和强度与溶剂的极性、粘度和纯度有关。在极性溶液中跃迁所需能量减小，跃迁几率增大。溶液粘度增大，分子碰撞减少，无辐射跃迁的概率降低溶液杂质可导致荧光强度增加或降低。3.溶液酸度影响荧光物质的存在形式荧光物质本身为弱酸或弱碱，酸度不同，物质在溶液中解离程度不同（2）影响荧光配合物的组成对于金属离子与有机试剂生成的荧光配合物，溶液pH的改变会影响配合物的组成和稳定性。例如Ga离子与邻-二羟基偶氮苯，在pH34的溶液中形成1:1配合物，能产生荧光。而在pH67的溶液中，则形成1：2的配合物，不产生荧光。4.散射光当一束光照射在被测溶液上，其中一部分光被吸收后发出荧光，一部分光透过溶液，还有一小部分光则由于光子与溶剂分子的相互碰撞，使光子的运动方向发生改变而向不同方向散射，称为散射光。瑞利（Reyleigh）散射光光子和物质分子发生弹性碰撞，不发生能量的交换，只是光子运动方向发生改变，其波长和激发光相同，这种散射光称为瑞利散射光。它的强度与波长的四次方成反比，即波长越短，瑞利散射光越强。但因因瑞瑞利利散散射射光光波波长长与与激激发发光光波波长长相相同同，只要选择适当的荧光测定波长或选用滤光片即可消除其影响。2.拉曼（Raman）散射光光子和溶剂分子发生非弹性碰撞，在运动方向发生改变的同时，光子与溶剂分子还发生能量的交换，使光光子子能能量量减减小小或或者者增增加加，光的波长增长或变短，这两种散射光均称为拉曼（散射）光。其中波长较长的拉曼光因其波长与物质的荧光波长相接近相接近,故对测定的干扰较大。320nm320nm448nm350nm448nm350nm400nm360nm激发320nm硫酸奎宁激发350nm硫酸奎宁散射光谱散射光谱5.荧光熄灭由于荧光物质分子间或与其它物质相互作用，引起荧光强度显著下降，或使荧光强度与浓度不呈线性关系的现象叫做荧光熄灭（quenching）或猝灭。引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂，如卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物和羧基化合物等。造成荧光熄灭的原因有多种：（1）碰撞猝灭：激发态荧光分子和熄灭剂分子碰撞，将能量转移到熄灭剂而使荧光熄灭；（2）生成化合物的猝灭：荧光分子与熄灭剂分子作用生成了本身不发光的配合物；（3）转入三重态的猝灭：荧光物质分子中引入重原子后，易发生系间窜越而转变为三重态；（4）自熄灭：当荧光物质浓度较大时，激发态分子和基态分子发生碰撞，产生荧光自熄灭现象。溶液浓度越高，自熄灭现象越严重；（5）氧的猝灭：溶液中溶解的氧分子能引起几乎所有的荧光物质产生不同程度的荧光熄灭。荧光熄灭是荧光分析的不利因素。但是如果一个荧光物质在加入某种熄灭剂后，荧光强度的减小和熄灭剂的浓度呈线性关系，则可以利用这一性质建立熄灭剂的荧光分析法，称为荧光熄灭法。荧光熄灭法比直接荧光法更灵敏、更有选择性。第二节 荧光分析仪器一、仪器的主要部件光源分光系统样品池检测器显示系统1.光源能发射紫外到可见区波长的光、强度大、稳定。常用的有溴钨灯、高压汞灯、氙灯。2.单色器两个单色器3.样品池通常用石英制成4.检测器光电倍增管二、仪器类型1.光电荧光计用滤光片作单色器（激发滤光片和荧光滤光片），溴钨灯或高压汞灯作光源，光电管为检测器。2.荧光分光光度计用氙灯作光源、光栅作单色器，光电倍增管为检测器。可连续扫描激发光谱和荧光光谱。二、仪器类型1.光电荧光计用滤光片作单色器（激发滤光片和荧光滤光片），溴钨灯或高压汞灯作光源，光电管为检测器。2.荧光分光光度计用氙灯作光源、光栅作单色器，光电倍增管为检测器。可连续扫描激发光谱和荧光光谱。第三节定性和定量分析根据光谱特征、荧光效率、荧光寿命、荧光偏振等参数进行定性分析定量分析标准曲线法直接比较法第四节 荧光新技术1.时间分辨荧光分析2.三维荧光分析3.核酸分子荧光探针4.薄层扫描法中的荧光扫描法