分子生物学之DNA复制.ppt

第第3章章 DNA复制复制 (DNA Replication)3.1.基本概念基本概念3.2.复制起点与方向复制起点与方向 3.3.Semi-Conservation Replication 3.4.复制的方式复制的方式 3.5.线状线状 DNA的复制的复制3.7.DNA复制的基因与酶类体系复制的基因与酶类体系 3.8.DNA复制速率及拷贝数的调控复制速率及拷贝数的调控 3.9.Methylation of DNA 3.6.The termination of DNA 3.1.基基 本本 概概 念念 (Basic Concept)遗传物质的分子机制遗传物质的分子机制分子生物学的核心分子生物学的核心Watson&Crick:一种遗传物质，必须能行使两种 功能，即自我复制和对细胞的高 度特异性的影响遗传物质的基本属性遗传物质的基本属性：基因的自我复制基因的自我复制 基因的突变基因的突变 控制性状的表达控制性状的表达DNA复制复制 亲代双链亲代双链DNA分子在分子在DNA聚合酶的作用下，分别以聚合酶的作用下，分别以 每单链每单链 DNA分子为模板，聚合与自身碱基可以互补分子为模板，聚合与自身碱基可以互补 配对的游离的配对的游离的dNTP,合成出两条与亲代合成出两条与亲代DNA分子完分子完 全相同的子代全相同的子代DNA分子的过程。分子的过程。Replicon;基因组中能独立进行复制的单位。基因组中能独立进行复制的单位。Replisome;A unit of the genome in which DNA contain a region from origin to terminator The multi protein(30)structure that assembles at replicating fork to undertake synthesis of DNA DNA replication at phase S of cell cycle E.coli 37 0.5 h105 bp/min S 6-8hs M 1hG23-4hsmammalian cell 22-25hrs500-5000 bp/min G112hs?3.2.复制起点与方向复制起点与方向（replication origin&direction）rich AT&palindrom Enzymes binding site 复制起点的特征复制起点的特征E E.coli coli 复制起点复制起点ori C245bp,序列保守序列保守成串排列的三成串排列的三个个13bp序列序列四个四个9bp序列序列DnaA蛋白结合位点蛋白结合位点真核生物复制起点的研究是以酵母为基础的uARS(automatic Replication Sequence)自主复制序列uARS1(A,B1,B2,B3)A区具有高度保守性 uB区变化较大AT rich 复制的多模式复制的多模式 单单起点、起点、单单方向方向单单起点、起点、双双方向方向多多起点、起点、双双方向方向1963 Cairns 37,5 ci/mM H3-T,6min 37,52 ci/mM H3-T,6min 42,T,one circle DNA双向复制的证据双向复制的证据 模式？模式？E.coli mut.ts 复制发动温度敏感突变型复制发动温度敏感突变型42不能发动不能发动DNA复制、但可完成复制、但可完成DNA延伸延伸模式？单单 起起 点、点、双双 方方 向向两个复制叉 子链子链DNA延伸方向延伸方向 DNA polymerase reacts on the 3 end only5 OHT C AT C A C 5 OH 3New DNA elongation from 5 to 3 direction ppp OH C+ppi 如果如果DNA的延伸方向是的延伸方向是 3 5 A T C G +5 ppp OH 3 G ppp OH G A T C G 5 ppp OH 3 A T C G +5 ppp OH 3 G ppp OH G 5 ppp因能量的需要，因能量的需要，DNA的的5 端必须带有端必须带有PPP游离游离dNTP具有具有pppppp OH 3 A T C G 在在0.2M NaCl 的生理环境中，磷酸基团间的强电负性，使的生理环境中，磷酸基团间的强电负性，使dNTP难以聚合到难以聚合到DNA的的5端，而且双链端，而且双链DNA的的5端碱基配对困难。端碱基配对困难。碱基发生错配后的校正碱基发生错配后的校正 费时、费能（增加脱磷酸、加磷酸的能量消耗）费时、费能（增加脱磷酸、加磷酸的能量消耗）A T C G ppp OH+pppAp OHT C Gppp OH T C GT C Gpp p OH 3.3.DNA的半保留复制的半保留复制 （Semi-Conservation Replication）半保留复制的半保留复制的实验验证实验验证3535OK!How?5353one strand of DNA replication in Okazaki fragment 1kb53535353（semi-discontinuous replication!）？a)Okazaki fragment 1968 Reiji Okazakib)半不连续复制半不连续复制 c)（semi-discontinuous replication）证据证据 Okazaki片段的发现，为不连续复制提供片段的发现，为不连续复制提供了有力的证据了有力的证据。Prok.1-2kb,Euk 在复制叉上发生一条新链为连续合成，在复制叉上发生一条新链为连续合成，另一条链为不连续合成的复制机制。另一条链为不连续合成的复制机制。leading strand lagging strand leading strand（前导链）：连续复制：连续复制lagging strand（后随链）：按后随链）：按Okazaki 片段不片段不连续复制连续复制3.4.DNA复制的方式复制的方式(DNA replication model)starting point RNA primer transcription activation leading strand fork lagging strand 复制叉式复制叉式（replication fork）环状环状DNA复制复制（form，50，000bp/min)多复制子多复制子 真核生物（真核生物（1000-3000bp/min)大多数生物染色体采取大多数生物染色体采取双向对称复制双向对称复制。枯草杆菌采取不对称复制。枯草杆菌采取不对称复制。DNA聚合酶不能发动子链聚合酶不能发动子链DNA的复制起始的复制起始.DNADNA聚合酶行使聚合作用需要：聚合酶行使聚合作用需要：a)a)引物提供引物提供3-OH3-OHb)b)以四种以四种dNTPdNTP作为底物作为底物c)c)模板指导模板指导d)d)延伸方向延伸方向5353 RNARNA引物的合成（引物的合成（ATPATP，GTPGTP，CTPCTP，UTPUTP）RNARNA聚合酶和引物合成酶聚合酶和引物合成酶(primaseprimase)引物的长度：几个引物的长度：几个1010个核苷酸个核苷酸 DNADNA聚合酶聚合酶I I：RNARNA引物的消除和缺口的填补引物的消除和缺口的填补 primer DNA复制的转录激活复制的转录激活 (transcriptional activation）RNA polymerase Rif S 10 Nt RNA primer for leading Strand origin dnaGprimase Rif R for lagging Strand primosome Synthesis of progeny strand in lagging DNA Synthesis of progeny strand in lagging DNA pppRNA as primerDNA polymerase IIIpppDNA polymerase IDNA polymerase IDNAligase RNApol(RNA polymerase)Rif S dnaG(primase)Rif R 完成对后随链引物的合成完成对后随链引物的合成 完成完成10 Nt RNA引物合成后引物合成后.DNApol III进行进行DNA链的延伸链的延伸 DNApol I 对对RNA引物切除并聚合填补引物切除并聚合填补 连接酶连接酶(ligase）将连接将连接 Okazaki 片段片段.完成对先导链引物的合成完成对先导链引物的合成 实现实现DNA复制的转录激活起始复制的转录激活起始较先导链的启动落后一个较先导链的启动落后一个Okazaki片断片断 Conclusion 共价延伸方式共价延伸方式（covalence elongation）或或 滚环方式滚环方式（rolling circle）D.S.DNA Nick leading StrandElongation rolling Lagging Strand1)1)X174X174单链单链DNADNA分子（分子（+），以此为模板，），以此为模板，起始合成（起始合成（-）DNADNA链，成为（链，成为（+/-+/-）双链）双链DNADNA分子，即复制型分子，即复制型RFI.RFI.2)2)（+）链）链DNADNA复制起点复制起点被被特异性特异性A A蛋白蛋白切断，切断，33和和55端游离出来。端游离出来。3)3)（-）DNADNA为为模板，模板，以以 （+）链）链DNADNA 3-OH3-OH为引物，为引物，DNADNA聚合酶聚合酶IIIIII合成新链合成新链（+）。）。原原来的（来的（+）链）链DNADNA 被取代。被取代。4)4)（+）链）链DNADNA被滚出一定被滚出一定 长度后，产生环状长度后，产生环状（+）链）链DNADNA。（+/-+/-）DNADNA链，继续参与复链，继续参与复制。制。置换式置换式 或或 D-Loop（Displacement form）D.S.DNA In mitochondrial DNA also in chloroplast DNA S.S.DNA as template New S.S.DNA Displacement D-LoopTop I ,Top II Helicase(rep protein)Single Strand Binding protein(SSB)DnaB proteinDnaC protein Primase DNA Polymerase III DNA Polymerase I Ligase for primosome复复制制体体进进 化化 中中 形形 成成 了了 灵灵 活活 的的 多多 酶酶 复复 合合 体体 replisomeprimosome（引发体）（引发体）PriA(dual role)displace SSB from S.S DNA and helicase DnaT required at prepriming stage DnaB is central component,action with DnaC DnaC is central component,action with DnaB PriB function is unknown PriC function is unknown DnaG primase(引物酶引物酶)进进 化化 中中 形形 成成 了了 灵灵 活活 的的 多多 酶酶 复复 合合 体体 replisome 位于复制叉处的多酶复合体位于复制叉处的多酶复合体完成完成 lagging Strand DNA延伸时延伸时 必须快速从一个冈崎片段移到另一冈崎片段必须快速从一个冈崎片段移到另一冈崎片段 In lagging Strand 多酶系统多酶系统 必须完成多次反复的启动与扩展必须完成多次反复的启动与扩展 E.coli 启动启动20004000次的冈崎片段复制次的冈崎片段复制3.5.线状线状 DNA的复制的复制 及避免及避免5末端短缩的模式末端短缩的模式 （5-end shortend）3-OH?3-OHLagging strand of 环状环状 DNA replication Lagging strand of 线状线状 DNA replication But 3-OH?a)Watson J.D b)T7 phage Direct repeat in the end of linear DNA Concatermer between two offspring DNA after replication?concatermer 3-OHATCGTAGCATCGTAGC3-OHb)真核生物染色体真核生物染色体 DNA末端补齐模式末端补齐模式 端粒的发现端粒的发现 1938 Muller X-ray Drosophila 末端极少发生缺失和倒位末端极少发生缺失和倒位推测染色体两端存在特殊结推测染色体两端存在特殊结构，使染色体趋于稳定构，使染色体趋于稳定.并定名为并定名为Telomer 1938 B.McClintock 顶端缺失染色体易于融合，而正常染色体不易连接。顶端缺失染色体易于融合，而正常染色体不易连接。推测染色体末端具有特殊端粒结构。推测染色体末端具有特殊端粒结构。1970s 分子生物学发展 端粒研究获得突破 端粒端粒DNA(Telomer)TTGGGG(T2G4)序列高度重复的末端序列高度重复的末端 5 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG 3(rich G chain)3 AACCCC AACCCC AACCCC 5 (rich C chain)1985.四膜虫四膜虫 端粒酶（端粒酶（telomerase）将将T2G4 末端重复延伸末端重复延伸=RNA(CAACCCCAA)链链+端粒结合蛋白端粒结合蛋白 model Telomerase 是是反转录酶反转录酶 RNA 与与 3 end of DNA 互补互补,作为合成作为合成 cDNA的模板的模板T2G4的延伸的延伸以端粒以端粒 3-end 作引物作引物 G链链 T2G4-TTGGGGTTGGGG C链链-A2C4-telomerase 3 AACCCCAAC-5 TTGG链链 T2G4-TTGGGGTTGGGG C链链-A2C4-TTG telomerase 3 AACCCCAAC-5 GGGTTGG链链 T2G4-TTGGGGTTGGGG C链链-A2C4-TTGGGGTTGGGGTTG-telomerase 3 AACCCCAAC-5 telomerase 3 AACCCCAAC-5 When G-rich strand is longer enough telomerase 3 AACCCCAAC-5 G G hoogsteen bond 四股螺旋四股螺旋 G链链 T2G4-TTGGGG TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG C链链-A2C4-G链链 T2G4-TTGGGG t t g g g g t t gC链链-A2C4-AACCCCAA g g g g t tgggPrimaseAACCCCAACCCCAACCCCAACCCCAACCCDNA polor多细胞组织的体细胞中，端粒酶的活性受到抑制，造成每一多细胞组织的体细胞中，端粒酶的活性受到抑制，造成每一代细胞分裂后染色体末端缩短。这种缩短如果到达信息代细胞分裂后染色体末端缩短。这种缩短如果到达信息DNA（informational DNA）,细胞将逐渐衰老和死亡。细胞将逐渐衰老和死亡。细胞分裂细胞分裂端粒阈值端粒阈值细胞停止分裂或死亡细胞停止分裂或死亡When telomerase activity is repressed人体发育完成，端粒酶被抑制，人体发育完成，端粒酶被抑制，细胞分裂次数与端粒长短呈反比细胞分裂次数与端粒长短呈反比细胞分裂细胞分裂端粒阈值端粒阈值端粒长短端粒长短端粒酶活端粒酶活性性 Harley(1989)端粒的重复片段为探针检测端粒的重复片段为探针检测 胎儿细胞株胎儿细胞株婴儿细胞株婴儿细胞株青年细胞株青年细胞株老年细胞株老年细胞株年龄年龄小 大端粒长度端粒长度 长 短早衰性侏儒症的端粒明显较正常人短早衰性侏儒症的端粒明显较正常人短PCD机制、癌细胞的无限繁殖机制、癌细胞的无限繁殖(癌细胞中的端粒酶被激活癌细胞中的端粒酶被激活)3.6 The termination of DNA 3.6 The termination of DNA replication replication E.coli(单起点双方向单起点双方向)两复制叉的相遇处具有多个终止位点两复制叉的相遇处具有多个终止位点(不是复制叉简单相遇）不是复制叉简单相遇）terE,D,A terF,B,C(22bp保守区保守区)F BTerminus Utilization Substance（TUS 36kd）CADETer-TUS复合体 terE,D,A 仅对逆时针方向的复制叉具有终止效应仅对逆时针方向的复制叉具有终止效应 terF,B,C 仅仅对对顺时针顺时针方向的复制叉具有终止效应方向的复制叉具有终止效应 F BCADETer-TUS复合体复合体 (Rep.fork trap)终止终止DnaB(螺旋酶螺旋酶)防止防止DNA过度复制过度复制避免出现避免出现DNA多聚体，高拷贝多聚体，高拷贝环状环状DNA分子复制完成后，两个环状染色体互相缠分子复制完成后，两个环状染色体互相缠绕，成为绕，成为连锁体连锁体。需要拓扑异构酶使。需要拓扑异构酶使DNA两条链断两条链断开和再连接。开和再连接。3.7.3.7.DNADNA的复制基因的复制基因 与酶类体系与酶类体系 a)原核生物的酶类原核生物的酶类 与起始有关的蛋白因子与起始有关的蛋白因子 Dna B 解开双链解开双链 300kd hexamer RNApol RNA primer for leading strand Dna C 与与 DnaB相互作用相互作用 25kdDna G RNA primer for lagging Strand 60kd SSB 结合单链结合单链DNA 74kdElongation genes与酶与酶 dnaE DNA polymerase III()140kddnaZ DNA polymerase III()52kdpolA DNA polymerase I 109kdpolB DNA polymerase II 90-120kd解螺旋酶和连接酶解螺旋酶和连接酶 rep Relaxed protein(Helicase)D.S.DNA S.S.DNAlig Ligase缺口缺口酶活化酶活化(T4)(E.coli)缺口腺苷化缺口腺苷化封口连接封口连接dAMP复制叉两侧复制叉两侧DNA双螺旋的解旋双螺旋的解旋E.coli C/genome=4.2 106 bp,40分钟分钟/每次复制历时每次复制历时,10 bp/每圈螺旋每圈螺旋 84000 bp 解旋解旋/分分(8400 rpm !高速离心机高速离心机)DNA topoisomerase I DNA的单链瞬间断裂的单链瞬间断裂 缓解缓解高速旋转高速旋转DNA topoisomerase II DNA的双链瞬间断裂的双链瞬间断裂 缓解缓解高速解旋时，高速解旋时，DNA双链的相互缠绕双链的相互缠绕能量？能量？拓扑异构酶（拓扑异构酶（Topoisomerase）(1)DNA(1)DNA拓扑异构酶拓扑异构酶 I I100kd topA编码编码不需能量不需能量在在DNA的一条链上的一条链上 产生一个切口。产生一个切口。superhelix (2)DNA(2)DNA拓扑异构酶拓扑异构酶 II IICut D.S.DNAATPLigategyr TopII(gyrase)400kdgyr 四聚体四聚体()需要能量需要能量使使DNA的两条链同时的两条链同时 发生断裂和连接发生断裂和连接D.S.helix superhelix b)DNA聚合酶聚合酶（DNA polymerase）polA polB dnaE dnaZ 104kd 120kd 250kd monomer klenow fragmentProkaryote I II III 5 3 elongation (dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+ppi 10 dNt/sec 1/10 of pol I 500dNt/sec(68,36)Kornberg E 多亚基酶多亚基酶 多亚基酶多亚基酶 3 5 editing mismatch 10-8 10-3 yes 5 3 exonuclease small fragment repair No No I II III mutation lethal lethal 功能功能 切除引物，修复切除引物，修复 修复修复 复制复制b;primer site c;primer terminator a;template sited;dNTP site e;5 3 repair site 36kde胰酶胰酶68kdabcOHOHpppdppppppppppppOHOHOHDNA polymerase I大片段具有聚合酶和大片段具有聚合酶和3535的外切核的外切核酸酶活性酸酶活性小片段具有小片段具有5 35 3的外切核酸酶活性的外切核酸酶活性多亚基酶多亚基酶功能：不是复制酶，是修复酶功能：不是复制酶，是修复酶DNA polymerase IIDNA polymerase III DNA pol III(holo Enzyme)+核心核心酶酶 具有具有5 3聚合酶的活性聚合酶的活性 具具有有35的外切核酸酶活性的外切核酸酶活性功能如同功能如同夹夹子子,夹夹住模板住模板DNA分子分子是一种依是一种依赖赖DNADNA的的ATPATP酶酶c)真核生物真核生物DNA复制的特点及聚合酶复制的特点及聚合酶 multiple replicon Prok.105 bp/min Euk.1000-3000 bp/min 5-300kb/复制子复制子 DNApol+primase(50-60kd)6-9 Nt RNA as primer 例；果蝇例；果蝇 5000 replicons受精后受精后genome replication/3min Replicons 扩增到扩增到50,000Euk.染色体在全部复制完成之前起染色体在全部复制完成之前起点不再从新开始复制。而点不再从新开始复制。而Prok.起点起点可以连续发动复制。可以连续发动复制。真核生物在快速生长时，往往采用真核生物在快速生长时，往往采用更多更多的复制起点。的复制起点。DNA polymerase polymerize 5 3 均有均有 Nuclei Nuclei Nuclei Nuclei mt editing 3 5 +功能功能 RNA引物引物 DNA合成合成 修复修复 修复修复 修复修复 3.8.DNA 复复 制制 速速 率率 及及 拷拷 贝贝 数数 的的 调调 控控 (?!)(?!)a)影响因素影响因素 多种专一性的多种专一性的蛋白质因子蛋白质因子浓度浓度除引物以外的其他除引物以外的其他RNARNA分子（分子（anti-RNAanti-RNA）营养条件（营养条件（aa starvedaa starved的抑制的抑制)（原核生物）（原核生物）细胞复制周期速率的影响（真核生物）细胞复制周期速率的影响（真核生物）b)严格的自我调控机制严格的自我调控机制 e.g.plasmid （parasite）independent replication 严谨型严谨型stringent type(1-2copies)松弛型松弛型relaxed type(10-100copies)Rop蛋白蛋白 反义反义RNA1 RNA-2 positive control 正调控 0-555 0 RNA-2 RNaseHOH RNA-2复制的调控复制的调控e.g.ColEI plasmid负调控负调控DNA复制方向RNA-1110 bp RNase H 不能识别不能识别D.S.RNA-1/RNA-2,不能形成不能形成primer 的3-OH-555-4450RNA-2RNA-1RNA-2 110 bp D.S.RNARNA-1 0 When RNA-2200-360Nt Rop gene expression RNA-1/RNA-2 D.S.repression RNA-1/RNA-2 不能形成不能形成primer的的 3-OH 促进促进 限限制制 63 aa ROP(Rop protein)RNA-2 只能转录到只能转录到100-220 base,不能到达不能到达“0”原点原点 不能形成不能形成primer 的的3-OH03.9.DNA的甲基化（的甲基化（Methylation）(m5C in Eukaryote)m5C a)DNA中中m5C的特点的特点 HNH H4153 62OHNNCH3 m5C的复制的复制 m5C的分布的分布 含含CG序列序列 HpaII CCmGG ;MspI CmCGG HhaI GCmGC ;ThaI CmGCmG Hea III GG CmC;PstI CmTGCAG（启动甲基化酶）（启动甲基化酶）（去甲基化）（去甲基化）(保持甲基化酶保持甲基化酶)（识别半甲基化）识别半甲基化）CmG CmG G C G CmCmGG C C G G C CG GC CmG G C Animal 70%of CG seq.Plant CNG seq.of Nuclei DNA (mtDNA,cpDNA no m5C)Eukaryote High repetitive seq.frequent m5C Structure gene rare m5C Cluster gene frequent m5C Expressing gene rare m5C Closed gene frequent m5C (in GC island of promoter)b)Function of m5C 细胞分化，组织特化，阶段发育，组织培养过程的脱分细胞分化，组织特化，阶段发育，组织培养过程的脱分化化 与与mm5 5C C的相关性（的相关性（5-5-氨胞苷去甲基化的作用）氨胞苷去甲基化的作用）m5C-甲基化是生物自我保护的机制甲基化是生物自我保护的机制 mm5 5C C 的不足的不足 基因表达相关基因表达相关 m5C的丰富的丰富 基因关闭相关基因关闭相关 mm5 5C C 的程度具有明显的组织，细胞的特异性的程度具有明显的组织，细胞的特异性(时空性时空性)m5C 与基因突变的关系与基因突变的关系 C m5C T gene mutation(癌变癌变)HNH5OC GCH35HNHOOCH35O氧化脱氨氧化脱氨m5CGT A 本章结束，本章结束，谢谢！谢谢！