生物化学实验理论教学课件-分光光度计的结构与使用方法.ppt

生物化学实验理论教学课件生物化学实验理论教学课件 第一讲第一讲 分光光度计的结构与使用方法分光光度计的结构与使用方法主讲教师：徐文俊主讲教师：徐文俊成都大学生物产业学院成都大学生物产业学院20082008年年6 6月月 教学目的教学目的：1.掌握分光光度法的定义和在实践中的应用；掌握分光光度法的定义和在实践中的应用；2.掌握分光光度计的基本结构和工作原理；掌握分光光度计的基本结构和工作原理；3.掌握可见光分光光度计的正确使用方法；掌握可见光分光光度计的正确使用方法；4.掌握紫外分光光度计正确使用方法；掌握紫外分光光度计正确使用方法；几个基本概念：几个基本概念：1.什么叫可见光？白光（复合光）？单色光？什么叫可见光？白光（复合光）？单色光？2.可见光由哪几种单色光组成？什么叫互补色？可见光由哪几种单色光组成？什么叫互补色？3.物质的颜色与可见光选择性吸收有什么内在联系？物质的颜色与可见光选择性吸收有什么内在联系？（1）对于固体物质：黑色；白色与彩色对于固体物质：黑色；白色与彩色 （2）对于溶液：矿泉水对于溶液：矿泉水;CuSO4;KMnO4溶液等溶液等例如：黄光与例如：黄光与 光互补；光互补；绿光与绿光与 光互补；光互补；红光与红光与 光互补等。光互补等。蓝蓝紫紫青青 教学内容：教学内容：1.分光光度法定义与应用分光光度法定义与应用 2.分光光度计的基本结构和工作原理分光光度计的基本结构和工作原理3.以以7200可见光分光度计为例，掌握可见可见光分光度计为例，掌握可见 4.以以UV-754型紫外型紫外-可见分光光度计为例，可见分光光度计为例，掌握紫外光光度计的正确使用方法。掌握紫外光光度计的正确使用方法。光分光度计的正确使用方法。光分光度计的正确使用方法。1.分光光度法定义与应用分光光度法定义与应用 1.1 定义定义:无论物质无论物质有无颜色，有无颜色，当当一定波长一定波长的光的光通过该物质的通过该物质的溶液溶液时，根据物质对光的吸收程度，时，根据物质对光的吸收程度，准确测定物质含量的方法。准确测定物质含量的方法。（什么叫比色法？）（什么叫比色法？）1.2 特点特点:灵敏、精确、快速和简便，在复杂组灵敏、精确、快速和简便，在复杂组分系统中，不需要分离，即能检测出其中所含的极分系统中，不需要分离，即能检测出其中所含的极少量物质。（少量物质。（1010-5-5 10 10-6-6 M)M)1.3 应用应用:生物化学微量物质定量分析测定研生物化学微量物质定量分析测定研究中广泛使用的方法之一，常用于糖，蛋白质，核究中广泛使用的方法之一，常用于糖，蛋白质，核酸，酶等的快速定量检测。酸，酶等的快速定量检测。2.分光光度计的基本结构和工作原理分光光度计的基本结构和工作原理2.1 分光光度计的分类分光光度计的分类 2.2 分光光度计工作原理分光光度计工作原理2.3 分光光度计的基本结构分光光度计的基本结构2.4 分光光度法的测量误差分光光度法的测量误差2.5 显色反应及其影响因素显色反应及其影响因素 2.1 分光光度计的分类分光光度计的分类分分光光光光度度计计的的分分类类红外红外分光光度计分光光度计:可见光分光光度计可见光分光光度计:紫外分光光度计紫外分光光度计:测定波长范围为测定波长范围为大于大于760 nm的红外光区的红外光区 测定波长范围为测定波长范围为400760 nm的可见光区的可见光区测定波长范围为测定波长范围为200200400 400 nmnm的紫外光区的紫外光区 2.2 分光光度计工作原理分光光度计工作原理 人人眼眼可可见见的的光光(一一种种频频率率较较大大的的电电磁磁波波)只只占占电电磁磁波波谱谱的的很很小小一一部部分分（400760nm）。电电磁磁波波按按频频率率大大小小，从从频频率率最最小小的的无无线线电电波波到到频频率率最最大大的的-射射线线排排成一列，即组成电磁波的波谱，如下图所示。成一列，即组成电磁波的波谱，如下图所示。2.2.1 分光光度计的光谱范围分光光度计的光谱范围 包包括括波波长长范范围围为为400760 nm的的可可见见光光区区和和波波长长范范围围为为200400 nm的的紫紫外外光光区区。不不同同的的光光源源都都有有其其特特有有的的发发射射光光谱谱，因因此此可可采采用用不不同同的的发发光光体体作作为为仪器的光源。仪器的光源。钨钨灯灯的的发发射射光光谱谱：钨钨灯灯光光源源所所发发出出的的400760nm波波长长的的光光谱谱，光光通通过过三三棱棱镜镜折折射射后后，可可得得到到由由红红、橙橙、黄黄、绿绿、蓝蓝、靛靛、紫紫组组成成的的连连续续色色谱谱；该色谱可作为可见光分光光度计的光源。该色谱可作为可见光分光光度计的光源。氢氢灯灯的的发发射射光光谱谱：氢氢灯灯能能发发出出185400 nm波波长的光谱，可作为紫外光光度计的光源。长的光谱，可作为紫外光光度计的光源。2.2.2 物质的吸收光谱（物质的吸收光谱（1）如果在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液，此如果在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液，此时在屏上所显示的光谱已不再是原光源的光谱，它时在屏上所显示的光谱已不再是原光源的光谱，它出现了几条暗线，即光源发射光谱中某些波长的光出现了几条暗线，即光源发射光谱中某些波长的光因溶液吸收而消失，这种被溶液吸收后的光谱称为因溶液吸收而消失，这种被溶液吸收后的光谱称为该溶液的吸收光谱。该溶液的吸收光谱。不同物质的吸收光谱是不同的。因此根据物质不同物质的吸收光谱是不同的。因此根据物质最大吸收光谱，可以鉴别溶液中所含的物质。最大吸收光谱，可以鉴别溶液中所含的物质。2.2.2 物质的吸收光谱（物质的吸收光谱（2）当当光光线线通通过过某某种种物物质质的的溶溶液液时时，透透过过的的光光的的强强度度减减弱弱。因因为为有有一一部部分分光光在在溶溶液液的的表表面面反反射射或或分分散散，一一部部分分光光被被组组成成此此溶溶液液的的物物质质所所吸吸收收，只只有一部分光可透过溶液。有一部分光可透过溶液。入射光入射光=反射光反射光 分散光分散光 吸收光吸收光 透过光透过光 如如果果我我们们用用蒸蒸馏馏水水(或或组组成成此此溶溶液液的的溶溶剂剂)作作为为“空空白白”去去校校正正反反射射、分分散散等等因因素素造造成成的的入入射射光的损失，则：光的损失，则：入射光入射光=吸收光吸收光 十十 透过光透过光 2.2.3 物质吸光度（物质吸光度（A）与）与透射比（透射比（T）的）的关系关系 设设 I0 为经过空白校正后入射光的强度；为经过空白校正后入射光的强度；I 为透过光的强度。为透过光的强度。根据实验得知根据实验得知 I=I0 10c l 式式中中，c 表表示示吸吸收收物物质质的的摩摩尔尔浓浓度度；l 表表示示吸吸收收物物质质的的光光径径，用用cm表表示示；表表示示吸吸收收物物质质的的摩摩尔尔消消光光系系数数，它它表表示示物物质质对对光光的吸收特性，不同物质的的吸收特性，不同物质的数值不同。数值不同。所以所以 I/I0 =10c l 令令 T（透射比）透射比）=I/I 0 T=10cl 若以若以T对吸收物质的浓度作图，则得下图中的曲线。对吸收物质的浓度作图，则得下图中的曲线。由上式可得由上式可得 1g（1/T）=c l log（l/T）即为物质的吸光度（即为物质的吸光度（A）A=c l 2.2.4 Lambert-Beer定律（定律（A=cl）上上式式说说明明：物物质质的的吸吸光光度度与与吸吸收收物物质质的的浓浓度度和和液液层层的的厚厚度度成成正正比比。这这就就是是光光吸吸收收的的基基本本定定律律-Lambert-Beer（朗伯朗伯-比耳）定律。比耳）定律。物质的浓度与透射比及吸光度的关系物质的浓度与透射比及吸光度的关系 2.3 分光光度计的基本结构分光光度计的基本结构 无论哪一类分光光度计都包括无论哪一类分光光度计都包括 ：光源、单色器、吸收池、检测器和测量仪表。分光光光源、单色器、吸收池、检测器和测量仪表。分光光度计各部件的次序如图所示度计各部件的次序如图所示:5个基本部件个基本部件 分光光度计的基本部件（分光光度计的基本部件（1 1）:光光 源源:分光光度计上常用的光源有两种：钨丝分光光度计上常用的光源有两种：钨丝灯或氢灯，在可见光区、近紫外光区和近红外光区常灯或氢灯，在可见光区、近紫外光区和近红外光区常用钨丝灯作为光源；在紫外光区多使用氢弧灯。用钨丝灯作为光源；在紫外光区多使用氢弧灯。单单色色器器：把把混混合合光光波波分分解解为为单单波波长长光光的的装装置置。在分光光度计中多用在分光光度计中多用 作为色散元件。作为色散元件。吸吸收收池池：（比比色色杯杯、比比色色皿皿、比比色色池池）一一般般由由玻玻璃璃、石石英英或或熔熔凝凝石石英英制制成成，用用来来盛盛被被测测的的溶溶液液。在在低低于于350 nm的的紫紫外外光光区区工工作作时时，必必须须采采用用石石英英池池或或熔熔凝凝石英池。石英池。棱镜或光栅棱镜或光栅 分光光度计的基本部件（分光光度计的基本部件（2 2）:吸吸收收池池（比比色色皿皿）必必须须与与光光束束方方向向垂垂直直。此此外外，每每套套比比色色皿皿的的质质料料、厚厚度度应应完完全全相相同同，以以免免产产生生误误差差。比比色色皿皿上上的的指指纹纹、油油污污或或壁壁上上的的沉沉积积物物都都会会显显著著地地影影响其透光性，因此在使用前务必彻底清洗。响其透光性，因此在使用前务必彻底清洗。检测器检测器 测量装置测量装置 一般常用的紫外光和可见光分光光度一般常用的紫外光和可见光分光光度计有计有3种测量装置，即电流表、记录器和数字示值种测量装置，即电流表、记录器和数字示值读数单元。现代的仪器常附有自动记录器，可自动读数单元。现代的仪器常附有自动记录器，可自动描出吸收曲线。描出吸收曲线。有光电池、光电管和光电倍增管三种。有光电池、光电管和光电倍增管三种。棱镜与光栅棱镜与光栅 棱棱 镜：镜：光波通过棱镜时，不同波长的光折射率光波通过棱镜时，不同波长的光折射率不同；因而能将不同波长的光分开。玻璃对紫外线的不同；因而能将不同波长的光分开。玻璃对紫外线的吸收力强，故玻璃棱镜多用于可见光分光光度计。石吸收力强，故玻璃棱镜多用于可见光分光光度计。石英棱镜可在整个紫外光区传播光，故在紫外光分光光英棱镜可在整个紫外光区传播光，故在紫外光分光光度计中广为应用。度计中广为应用。衍射光栅：衍射光栅：在石英或玻璃表面上刻划许多平行线在石英或玻璃表面上刻划许多平行线(每英寸约刻每英寸约刻15 00030 00015 00030 000条条)。由于刻线处不透光，。由于刻线处不透光，通过光的干涉和衍射使较长的光波偏折角度大，较短通过光的干涉和衍射使较长的光波偏折角度大，较短的光波偏折角度小，因而形成光谱。的光波偏折角度小，因而形成光谱。棱镜单色器装置示意图棱镜单色器装置示意图 光源照到棱镜（或光栅）以前，先要经过一个入射狭缝，光源照到棱镜（或光栅）以前，先要经过一个入射狭缝，再通过平行光镜使成为平行光束投到棱镜上。透过棱镜的光再再通过平行光镜使成为平行光束投到棱镜上。透过棱镜的光再经另一聚光镜，在此聚光镜的焦面内可得一清楚的光谱图。如经另一聚光镜，在此聚光镜的焦面内可得一清楚的光谱图。如在焦线处放一出射狭缝，转动棱镜使光谱移动，就可以从出射在焦线处放一出射狭缝，转动棱镜使光谱移动，就可以从出射狭缝射出所需要的单色光。整个装置称为狭缝射出所需要的单色光。整个装置称为“单色器单色器”检测器检测器-光电池光电池 光电池光电池 装在一个特制的匣装在一个特制的匣子里面由子里面由3层物质组成的圆形或层物质组成的圆形或长方形薄片。第一层是一种导电长方形薄片。第一层是一种导电性良好的金属，这是光电池的负性良好的金属，这是光电池的负极。中间极薄的一层是半导体硒，极。中间极薄的一层是半导体硒，第第3层是铁，这是光电池的正极。层是铁，这是光电池的正极。当光电池受光照射以后，半导体当光电池受光照射以后，半导体硒的表面逸出电子，这些电子只硒的表面逸出电子，这些电子只向负极方向移动，而不向正极移向负极方向移动，而不向正极移动，因此在上下两金属片间产生动，因此在上下两金属片间产生一个电位差，线路连通时即产生一个电位差，线路连通时即产生电流电流 检测器检测器-光电管光电管 光电管光电管 光电管是由封装在真光电管是由封装在真空透明封套里的一个半圆柱型空透明封套里的一个半圆柱型阴极和一个丝阳极组成。阴极阴极和一个丝阳极组成。阴极的凹画上有一层光电发射材料，的凹画上有一层光电发射材料，此种物质经光照射可发射电子。此种物质经光照射可发射电子。当在两极间加有电位时，发射当在两极间加有电位时，发射出来的电子就流向丝阳极而产出来的电子就流向丝阳极而产生光电流。对于相同的辐射强生光电流。对于相同的辐射强度，它所产生的电流约为光电度，它所产生的电流约为光电池所产生电流的池所产生电流的1/4。由于光电。由于光电管具有很高的电阻，所以产生管具有很高的电阻，所以产生的电流容易放大的电流容易放大。检测器检测器-光电倍增管光电倍增管 光电倍增管光电倍增管 它比普通的它比普通的光电管优越，它可将第一次发光电管优越，它可将第一次发射出的电子数目放大到数百万射出的电子数目放大到数百万倍倍。当电子打在兼性阳极上。当电子打在兼性阳极上时，能引起更多的电子自表面时，能引起更多的电子自表面射出。这些射出的电子又被第射出。这些射出的电子又被第二个兼性阳极所吸引，同样再二个兼性阳极所吸引，同样再产生更多的电子。产生更多的电子。此过程重复此过程重复9次后，每个光子可形成次后，每个光子可形成106107个电子。这些个电子。这些电子最后被收集在阳极上。所得到的倍增电流可进一步加以电子最后被收集在阳极上。所得到的倍增电流可进一步加以放大和测量。放大和测量。2.4 分光光度法的测量误差分光光度法的测量误差分分光光光光度度法法的的测测量量误误差差选择适宜波长的入射光选择适宜波长的入射光控制吸光度控制吸光度A的遍数范围的遍数范围选择适当的参比溶液选择适当的参比溶液仪器测仪器测量误差量误差测量条测量条件选择件选择 2.4.1 仪器测量误差仪器测量误差 由由朗朗伯伯-比尔定律可知，只有在一定的浓度范围比尔定律可知，只有在一定的浓度范围内，即一定的吸光度范围同内，由分光光度计测量所内，即一定的吸光度范围同内，由分光光度计测量所引起的测定结果的相对误差才是较小的；当透光率接引起的测定结果的相对误差才是较小的；当透光率接近近0或或1.0时，其相对误差趋于无限大时，其相对误差趋于无限大；一般在百分透一般在百分透光率在光率在1080%的范围内（即吸光度在的范围内（即吸光度在10.1），浓度），浓度测量相对误差较小；对于精密度高的仪器。测量相对误差较小；对于精密度高的仪器。当吸度当吸度A=0.7-0.2时（百分透光率约为时（百分透光率约为20-60%，测量误差约，测量误差约为为1%。2.4.2 测量条件选择测量条件选择 （1）选择适宜波长的入射光：）选择适宜波长的入射光：由于有色物质对光有由于有色物质对光有选择性吸收，为了使测定结果有较高的灵敏度，必须选择性吸收，为了使测定结果有较高的灵敏度，必须选择溶液最大吸收波长的入射光。选择溶液最大吸收波长的入射光。（2）控制吸光度）控制吸光度A的准确的读数范围：的准确的读数范围：由朗伯由朗伯-比比耳定律可知，吸光度只有控制在耳定律可知，吸光度只有控制在0.20.7读数范围内时，读数范围内时，测量的准确度较高。测量的准确度较高。（3）选择参比溶液：）选择参比溶液：参比溶液是用来调节仪器工作参比溶液是用来调节仪器工作零点的。若样品溶液，试剂，显色剂无无色可用蒸馏零点的。若样品溶液，试剂，显色剂无无色可用蒸馏水作参比溶液；反之应采用不加显色剂的样品液作参水作参比溶液；反之应采用不加显色剂的样品液作参比溶液。比溶液。2.5 显色反应及其影响因素显色反应及其影响因素显显色色反反应应及及其其影影响响因因素素显显色反应色反应一般要求一般要求影响显色影响显色反应因素反应因素选择性好选择性好灵敏度高灵敏度高生成的有色化合物性质稳定生成的有色化合物性质稳定显色剂与有色物颜色反差大显色剂与有色物颜色反差大显色反应要易于控制显色反应要易于控制显色剂显色剂用量用量反应液的酸碱度反应液的酸碱度（pH）反应温度反应温度显色反应时间显色反应时间干扰离子的影响干扰离子的影响 2.5.1 显色反应一般要求显色反应一般要求 （1）选择性好：）选择性好：显色剂最好只与一种被测组分起显色显色剂最好只与一种被测组分起显色反应；反应；（2）灵敏度高）灵敏度高：灵敏度高，能进行微量组分的测定；灵敏度高，能进行微量组分的测定；（3）有色化合物性质稳定：）有色化合物性质稳定：确保前后测定准确。确保前后测定准确。（4）显色剂与有色物颜色反差大：）显色剂与有色物颜色反差大：两者最大吸收波长两者最大吸收波长之差应大于之差应大于60nm；（5）显色反应要易于控制：显色反应要易于控制：结果的确保实验再现性。结果的确保实验再现性。2.5.2 影响显色反应的主要因素影响显色反应的主要因素 （1）显色剂用量：）显色剂用量：通过实验来确定最适用量；通过实验来确定最适用量；（2）反应液的酸碱度（）反应液的酸碱度（pH）溶液酸碱度直接影响金溶液酸碱度直接影响金属离子与显色剂存在形式以及有色化合物组成的稳定性。属离子与显色剂存在形式以及有色化合物组成的稳定性。（3）反应温度：反应温度：不同的显色反应需要不同的反应温不同的显色反应需要不同的反应温度，一般显色反应可在室温下完成。度，一般显色反应可在室温下完成。（4）显色反应时间：）显色反应时间：显色反应的速度有快有慢。显色反应的速度有快有慢。（5）干扰离子的影响：）干扰离子的影响：应采用适当方法消除其影响。应采用适当方法消除其影响。3.7200型分光光度计的正确使用方法型分光光度计的正确使用方法 3.1 结构和工作原理结构和工作原理 3.1.1 仪器结构仪器结构 3.3 注意事项注意事项3.2 使用方法使用方法3.1.3 特特 点点3.1.2 工作原理工作原理 3.1.1 7200型分光光度计仪器结构型分光光度计仪器结构 7200型型光光栅栅分分光光光光度度计计由由光光源源、单单色色器器、试试样样室室、光光电电管管、线线性性运运算算放放大大器器、对对数数运运算算放放大大器器及及数数字字显显示器等部件组成，基本结构如下图所示。示器等部件组成，基本结构如下图所示。1光光源源；2单单色色器器；3试试样样室室；4光光电电管管；5线线性性运算放大器；运算放大器；6对数运算放大器；对数运算放大器；7数字显示器数字显示器 3.1.2 7200型分光光度计工作原理（图）型分光光度计工作原理（图）7 2 0 0型型光光栅栅分分光光光光度度计计光光学学系系统统示示意意图图 1.光光源源灯灯；2.滤滤光光片片；3.球球面面反反射射镜镜；4.入入射射狭狭缝缝；5.保保护护玻玻璃璃；6.平平面面反反射射镜镜；7.准准直直镜镜；8.光光栅栅；9.保保护护玻玻璃璃；10.出出射射狭缝；狭缝；11.聚光镜；聚光镜；12.试样室；试样室；13.光门；光门；14.光电管；光电管；3.1.2 7200型分光光度计工作原理（文）型分光光度计工作原理（文）由由光光源源灯灯(1)发发出出连连续续辐辐射射光光线线，经经滤滤光光片片(2)和和球球面面反反射射镜镜(3)至至单单色色器器的的入入射射狭狭缝缝(4)聚聚焦焦成成像像，光光束束通通过过入入射射狭狭缝缝(4)经经平平面面反反射射镜镜(6)到到准准直直镜镜(7)产产生生平平行行光光，射射至至光光栅栅(8)上上色色散散后后又又以以准准直直镜镜(7)聚聚焦焦在在出出射射狭狭缝缝(10)上上形形成成一一连连续续光光谱谱，由由出出射射狭狭缝缝选选择择射射出出一一定定波波长长的的单单色色光光，经经聚聚光光镜镜(11)聚聚光光后后，通通过过试试样样室室(12)中中的的测测试试溶溶液液部部分分吸吸收收后后，光光经经光光门门(13)再再照照射射到到光光电电管管(14)上上。调调整整仪仪器器，使使透透光光度度为为100，再再移移动动试试样样架架拉拉手手，使使同同一一单单色色光光通通过过测测试试溶溶液液后后照照射射到到光光电电管管上上。如如果果被被测测样样品品有有光光吸吸收收现现象象，光光量量减减弱弱，由由光光电电转转换换元元件件将将变变化化的的光光信信号号转转变变为为电电信信号号，经经线线性性运运算算放放大大器器和和对对数数运运算算放放大大器器处处理理，将将光光能能的的变变化化程程度度通通过过数数字字显显示示器器显显示示出出来来。可可根根据据需需要要直直接接在在数数字字显显示示器器上上读读取取透透光光度度(T)、吸吸光度光度(A)或浓度或浓度(C)。3.1.3 特点特点 （1）具有低杂色光，高分辩率的单光束光路结构的单色器；具有低杂色光，高分辩率的单光束光路结构的单色器；（2）具有良好的稳定性，重现性和精确的测量读数；具有良好的稳定性，重现性和精确的测量读数；（3）明亮清晰的数字显示器可显示透射比，吸光度，浓度和明亮清晰的数字显示器可显示透射比，吸光度，浓度和所设置的波长，提高了仪器的读数准确性；所设置的波长，提高了仪器的读数准确性；（4）采用最新微机处理技术，仪器具有自动设置采用最新微机处理技术，仪器具有自动设置0%T和和100%等控制功能；等控制功能；（5）仪器配有标准的仪器配有标准的RS-232双向通讯接口，不仅可向计算机双向通讯接口，不仅可向计算机发送测试参数，还可接收计算机发出的指令。发送测试参数，还可接收计算机发出的指令。（6）在在已知标准溶液浓度前提下，测定未知样品浓度；已知标准溶液浓度前提下，测定未知样品浓度；（7）在已知标准溶液浓度斜率前提下，测定未知样品浓度。）在已知标准溶液浓度斜率前提下，测定未知样品浓度。3.2 7200型分光光度计使用方法型分光光度计使用方法（基本操作基本操作 1 1）3.2.1 基本操作基本操作 （1）通电）通电-仪器自检仪器自检-预热预热20min；（2）用用键设置测试方式：键设置测试方式：透射比（透射比（T），），吸光度吸光度（A），），已知标样浓度方式（已知标样浓度方式（C）和已知标样浓度斜率（和已知标样浓度斜率（K）方式；方式；（3）波长选择：用波长调节旋钮设置所需的单色光波长）波长选择：用波长调节旋钮设置所需的单色光波长;（4）放样顺序：）放样顺序：打开样品室盖，在打开样品室盖，在14号放置比色皿槽中，依号放置比色皿槽中，依次放入次放入%T校具（黑体），参比液，样品液校具（黑体），参比液，样品液1和样品液和样品液2。（5）校具（黑体）校）校具（黑体）校“0.000”：将将%T校具（黑体）置入光路，校具（黑体）置入光路，在在T方式下按方式下按“%T”键，此时仪器自动校正后显示键，此时仪器自动校正后显示“0.000”3.2 7200型分光光度计使用方法型分光光度计使用方法（基本操作基本操作2）（6）参比液校）参比液校“100”%T或或“0.000”A：将参比液拉入光路中，将参比液拉入光路中，按按“0A/100%T”键调键调0A/100%T，此时仪器显示此时仪器显示“BLA”，表示仪器表示仪器正在自动校正，校正完毕后显示正在自动校正，校正完毕后显示“100”%T或或“0.000”A后后,表示校表示校正完毕，可以进行样品测定。正完毕，可以进行样品测定。（7）样品测定：）样品测定：将两样品液分别拉入光路中，此时若在将两样品液分别拉入光路中，此时若在“T”方式下则可依次显示样品的透射比（透光度）；若在方式下则可依次显示样品的透射比（透光度）；若在“A”方方式下，则显示测得的样品吸光度。式下，则显示测得的样品吸光度。3.2 7200型分光光度计使用方法型分光光度计使用方法（浓度测定浓度测定）7200型分光光度仪不仅可以测定未知样品的透射比（型分光光度仪不仅可以测定未知样品的透射比（T）和吸和吸光度（光度（A）这两项基本操作，还可进行未知样品浓度测定。这两项基本操作，还可进行未知样品浓度测定。（1）在已知标准溶液浓度前提下，测定未知样品浓度。）在已知标准溶液浓度前提下，测定未知样品浓度。（2）在已知标准溶液浓度斜率前提下，测定未知样品浓度。）在已知标准溶液浓度斜率前提下，测定未知样品浓度。备注：以上两种浓度测定的方法请大家参照实验教学备注：以上两种浓度测定的方法请大家参照实验教学教材课后自学。教材课后自学。3.3 7200型光栅分光光度计的使用注意事项（型光栅分光光度计的使用注意事项（1 1）(1)预热是保证仪器准确稳定的重要步骤。预热是保证仪器准确稳定的重要步骤。(2)比比色色皿皿的的清清洁洁程程度度，直直接接影影响响实实验验结结果果。因因此此，特特别别要要将将比比色色皿皿清清洗洗干干净净。先先用用自自来来水水将将用用过过的的比比色色皿皿反反复复冲冲洗洗，然然后后用用蒸蒸馏馏水水淋淋洗洗，倒倒立立于于滤滤纸纸片片上上，待待干干后后再再收收回回比比色色皿皿盒盒中中。必必要要时时，还还要要对对比比色色皿皿进进行行更更精精细的处理，如用浓硝酸或铬酸洗液浸泡、冲洗。细的处理，如用浓硝酸或铬酸洗液浸泡、冲洗。(3)比色皿与分光光度计应配套使用，否则会引起较比色皿与分光光度计应配套使用，否则会引起较大的实验误差。大的实验误差。3.3 7200型光栅分光光度计的使用注意事项（型光栅分光光度计的使用注意事项（2 2）(4)比比色色皿皿内内盛盛液液应应为为其其容容量量的的2/3，过过少少会会影影响响实实验结果，过多易在测量过程中外溢，污染仪器。验结果，过多易在测量过程中外溢，污染仪器。(5)拿拿放放比比色色皿皿时时，应应持持其其“毛毛面面”，杜杜绝绝接接触触光光路路通通过过的的“光光面面”。如如比比色色皿皿外外表表面面有有液液体体，应应用用绸绸布布拭干，以保证光路通过时不受影响。拭干，以保证光路通过时不受影响。(6)若若待待测测液液浓浓度度过过大大，应应选选用用短短光光径径的的比比色色皿皿，一一般般应应使使吸吸光光度度读读数数处处于于0.10.8范范围围内内为为宜宜。由由于于测测定定空空白白、标标准准和和待待测测溶溶液液时时使使用用同同样样光光径径的的比比色色皿皿，故故不不必考虑因光径变化而引起的影响必考虑因光径变化而引起的影响。4.4.UV-754型紫外型紫外-可见分光光度计正确使用方法可见分光光度计正确使用方法 4.1 紫外分光光度法概述紫外分光光度法概述 4.2 UV-754型紫外型紫外-可见分光光度计结构和工作原理可见分光光度计结构和工作原理 4.1.1 仪器结构仪器结构 4.1.2 工作原理工作原理 4.3 UV-754型紫外型紫外-可见分光光度计可见分光光度计使用方法使用方法 4.4 UV-754型紫外型紫外-可见分光光度计可见分光光度计使用注意事项使用注意事项 4.1 紫外分光光度计法概述（紫外分光光度计法概述（1）4.1.1 定义定义 用紫外光源通过分光光度技术对物质进用紫外光源通过分光光度技术对物质进行测定的方法叫作紫外分光光度法。所使用的仪器叫作紫行测定的方法叫作紫外分光光度法。所使用的仪器叫作紫外分光光度计。外分光光度计。4.1.2 原理原理 因为许多化合物的分子结构中存在共轭因为许多化合物的分子结构中存在共轭双键，在双键，在200400nm的紫外光区具有吸收光的特性，所的紫外光区具有吸收光的特性，所以无需进行显色反应便能直接测定以无需进行显色反应便能直接测定。4.1.3 应应用用 常常用用于于对对蛋蛋白白质质和和核核酸酸进进行行定定性性、定定量量测测定定。蛋蛋白白质质分分子子中中所所含含酪酪氨氨酸酸、色色氨氨酸酸和和苯苯丙丙氨氨酸酸等等芳芳香香族族氨氨基基酸酸残残基基在在波波长长280nm处处具具有有最最大大吸吸收收峰峰。故故常常用用波长波长280nm处的吸光度测定蛋白质的浓度。处的吸光度测定蛋白质的浓度。4.1 紫外分光光度计法概述（紫外分光光度计法概述（2）4.1.4 特点特点 （1）组成核酸的碱基也含有共轭双键，其最大吸收峰的波长组成核酸的碱基也含有共轭双键，其最大吸收峰的波长在在260nm处。但在处。但在280nm处也有一定的光吸收，对蛋白质的测定有处也有一定的光吸收，对蛋白质的测定有一定的干扰作用。若分别测定一定的干扰作用。若分别测定280nm和和260nm处的吸光度，可通过处的吸光度，可通过经验公式消除核酸对蛋白质测定的影响。经验公式消除核酸对蛋白质测定的影响。（2）可对微量蛋白质（）可对微量蛋白质（110g/L）不需显色，进行直接定量不需显色，进行直接定量测定测定。因此操作简便，而且可回收样品。此外，盐类在因此操作简便，而且可回收样品。此外，盐类在280nm处无处无光吸收，少量盐类也不会影响测定结果。光吸收，少量盐类也不会影响测定结果。（3）紫外分光光度法完全符合紫外分光光度法完全符合Lambert-Beer定律的基本原理。定律的基本原理。在其它条件保持一致的情况下，被测溶液的吸光度与被测溶液的浓在其它条件保持一致的情况下，被测溶液的吸光度与被测溶液的浓度成正比。度成正比。4.2 UV-754型分光光度计的结构和工作原理型分光光度计的结构和工作原理 4.2.1 仪仪器器结结构构 由由光光源源(钨钨灯灯或或氚氚灯灯)、单单色色器器、试试样样室室、接接受受器器(光光电电管管)、微微电电流流放放大大器器、A/C 转转换换器器、打打印印机机、键键盘盘和和显显示示器器等等部部件件组组成成。微微处处理理机机(CPU)通通过过输输入入、输输出出口口(I/O)对对微微电电流流放放大器、显示器和打印机等部件进行大器、显示器和打印机等部件进行 控制，实现仪器的整体功能。控制，实现仪器的整体功能。4.2.2 工作原理（图）工作原理（图）UV-7 7 5 5 4 4型型紫紫外外-可可见见分分光光光光度度计计光光学学系系统统示示意意图图 1.氚灯；氚灯；2.钨灯；钨灯；3.滤光镜；滤光镜；4.聚光镜；聚光镜；5.入射狭缝；入射狭缝；6.平面；平面；7.准直镜；准直镜；8.光栅；光栅；9.出射狭缝；出射狭缝；10聚光镜；聚光镜；11试样室；试样室；12.光门；光门；13.光电管光电管 4.2.2 工作原理（文）工作原理（文）由由光光源源氚氚灯灯或或钨钨灯灯（1或或2）发发出出连连续续辐辐射射光光线线经经滤滤光光镜镜（3）和和聚聚光光镜镜（4）至至单单色色器器入入射射狭狭缝缝（5）处处聚聚焦焦成成像像，再再经经平平面面反反射射镜镜（6）反反射射至至准准直直镜镜（7）产产生生平平行行光光射射至至光光栅栅（8）在在光光栅栅上上色色散散后后又又经经准准直直镜镜（7）聚聚焦焦在在出出射射狭狭缝缝（9）上上成成一一连连续续光光谱谱，经经出出射射狭狭缝缝射射出出的的光光在在聚聚光光镜镜（10）聚聚光光后后分分别别通通过过试试样样室室（11）中中的的空空白白溶溶液液（或或对对照照溶溶液液）、标标准准溶溶液液或或样样品品溶溶液液，被被部部分分吸吸收收后后光光经经光光门门（12）再再照照射射到到光光电电管管（13）上上。被被光光电电管管接接收收的的光光信信号号再再被被转转换换成成电电信信号号，后后者者通通过过输输入入、输输出出口口（/O），见见上上图图。进进入入微微处处理理机机进进行行调调零零、变变换换对对数数、浓浓度度计计算算以以及及打打印印数数据据等等处处理理，将将检测结果通过显示器和打印系统显示出来。检测结果通过显示器和打印系统显示出来。4.3 UV-754型分光光度计型分光光度计使用方法（外型）使用方法（外型）4.3.1 UV-754型紫外可见分光光度计的外观图型紫外可见分光光度计的外观图 1.试试样样架架拉拉手手；2.键键盘盘部部分分；3.数数据据打打印印；4.波波长长刻刻度度盘盘；5波长手轮；波长手轮；6电源汗关；电源汗关；7氚灯触发按钮；氚灯触发按钮；8光源室。光源室。4.3 UV-754型分光光度计型分光光度计使用方法（键盘）使用方法（键盘）UV-754型紫外型紫外-可见分光光度计的键盘示意图可见分光光度计的键盘示意图 键盘详细内容说明如下：键盘详细内容说明如下：4.3 UV-754型分光光度计型分光光度计使用方法（键盘内容使用方法（键盘内容1 1）功能键：功能键：F1F8，暂无功能，备扩展使用。暂无功能，备扩展使用。T键：键：具有三种透光度状态调节功能。具有三种透光度状态调节功能。A/C键键：吸吸光光度度浓浓度度转转换换键键，按按此此键键可可分分别别表表示示“吸吸光光度度03A”、“吸吸光光度度00.lA”、“吸吸光光度度00.1A”和和“浓浓度度”四四种种状状态。态。送入键：只在送入键：只在“A/C键键”处于处于“浓度浓度”状态时才起作用。状态时才起作用。打印键：手动方式时有效，每按一次，便打印一次数据。打印键：手动方式时有效，每按一次，便打印一次数据。控控制制键键：在在分分别别使使用用“设设定定+”、“设设定定一一”、“倍倍率率”、“显显示示方方式式”和和“打打印印方方式式”各各键键时时，需需与与控控制制键键分分别别联联合合使使用用才才起起作用。作用。设设定定+键键：在在“A/C键键”处处于于“浓浓度度”状状态态时时才才能能设设定定“标标准准浓浓度度值值”、“斜斜率率K值值”或或“斜斜率率B值值”等等数数据据。其其功功能能是是将将设设定定数值增加。数值增加。4.3 UV-754型分光光度计型分光光度计使用方法（键盘内容使用方法（键盘内容2 2）设定设定-键：是使设定数值减小，操作与键：是使设定数值减小，操作与“设定设定+键键”类同。类同。倍倍率率键键：用用来来设设定定标标准准溶溶液液浓浓度度的的放放大大倍倍数数。有有“1”、“0.1”和和“0.01”三三档档，与与“控控制制键键”同同时时按按下下，倍倍率率便便发发生生相相应的变化。应的变化。显显示示方方式式键键：可可表表示示“积积分分”、“浓浓度度”和和“样样品品号号”三三种种状态。状态。(11)打打印印方方式式键键：存存在在“自自动动”（每每移移动动一一次次试试样样架架，仪仪器器自自动动打打印印一一次次数数据据）、“方方式式1”（手手动动方方式式，每每按按一一次次此此键键，仪仪器器打打印印一一次次数数据据）和和“方方式式2”（每每分分钟钟定定时时打打印印一一次次数数据据）三三种种状状态态。每每与与“控制键控制键”同时按一次此键便改变一个状态。同时按一次此键便改变一个状态。(12)送纸键：每按一次此键，仪器移动一次打印纸。送纸键：每按一次此键，仪器移动一次打印纸。(13)TAC：数字显示器显示测定结果或输入的数据数字显示器显示测定结果或输入的数据。4.3.2 UV-754型紫外可见分光光度计使用方法（型紫外可见分光光度计使用方法（1 1）（1）测试准备测试准备 将将盛盛有有“空空白白”或或“对对照照”溶溶液液的的比比色色皿皿处处于于试试样样室室光光路路位置；位置；选择波长选择波长 旋动波长手轮选定所需波长；旋动波长手轮选定所需波长；确确定定光光源源 波波长长在在200290nm时时，选选择择氚氚灯灯为为光光源源；波波长长在在290360nm时时，同同时时以以氚氚灯灯和和钨钨灯灯为为光光源源；波波长长在在360850nm时时，选择钨灯为光源；若使用氚灯，需按氚灯触发按钮启动；选择钨灯为光源；若使用氚灯，需按氚灯触发按钮启动；仪仪器器自自检检 显显示示器器显显示示“754”后后，数数字字显显示示出出现现“100.0”，表表明明仪仪器器通通过过自自检检程程序序，此此时时仪仪器器进进入入“0100”、“连连续续”和和“自动自动”状态（打印系统处于自动打印状态）；状态（打印系统处于自动打印状态）；仪器预热仪器预热30min后方可进行测试。后方可进行测试。4.3.2 UV-754型紫外可见分光光度计使用方法（型紫外可见分光光度计使用方法（2 2）（2）测试过程）测试过程 数数字字显显示示透透光光度度“100.0”(或或吸吸光光度度“0.00”)23s后后，将将盛盛有有标标准准溶溶液液的的比比色色皿皿移移至至光光路路，打打印印系系统统便便自自动动打打印印出出所所得得数数据；据；将将盛盛有有样样品品溶溶液液的的比比