多聚酶链式反应扩增DNA片段第1课时.pptx

K.B.MullisK.B.Mullis1993199319931993年获诺贝尔生生理学奖年获诺贝尔生生理学奖年获诺贝尔生生理学奖年获诺贝尔生生理学奖 课题课题2 2 多聚酶链式反应扩增多聚酶链式反应扩增DNADNA片段片段基础知识（一）（一）DNA分子的结构分子的结构1、DNADNA分子的基本组成单位分子的基本组成单位分子的基本组成单位分子的基本组成单位:2、脱氧核苷酸的结构模式、脱氧核苷酸的结构模式:脱氧核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，简称脱氧核苷酸简称脱氧核苷酸简称脱氧核苷酸简称脱氧核苷酸。基础知识（一）（一）DNA分子的结构分子的结构3、脱氧核苷酸链的结构模式、脱氧核苷酸链的结构模式:脱脱脱脱氧氧氧氧核核核核苷苷苷苷酸酸酸酸链链链链 的的的的 羟羟羟羟 基基基基(-(-OH)OH)末末末末端端端端称称称称为为为为33端端端端，而而而而磷磷磷磷酸酸酸酸基基基基团团团团的的的的末末末末端端端端称称称称为为为为55端端端端。GATGCACT氢氢氢氢键键键键5端端3端端5端端3端端基础知识基础知识基础知识（一）（一）DNA分子的结构分子的结构4、DNA的平面结构模式的平面结构模式:基础知识（二）（二）PCR原理原理请阅读请阅读教材教材P58内容并结合视频分析：内容并结合视频分析：1、DNADNA复复复复制制制制需需需需要要要要哪哪哪哪些些些些基基基基本本本本条条条条件件件件？它它们们分分别别起起什么作用？什么作用？解旋酶：打开解旋酶：打开解旋酶：打开解旋酶：打开DNADNA双链；双链；双链；双链；DNADNA母链：提供母链：提供母链：提供母链：提供DNADNA复制的模板；复制的模板；复制的模板；复制的模板；4 4种脱氧核苷酸：合成子链的原料；种脱氧核苷酸：合成子链的原料；种脱氧核苷酸：合成子链的原料；种脱氧核苷酸：合成子链的原料；DNADNA聚合酶：催化合成聚合酶：催化合成聚合酶：催化合成聚合酶：催化合成DNADNA子链；子链；子链；子链；引引引引物物物物：使使使使DNADNA聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶能能能能够够够够从从从从引引引引物物物物的的的的33端端端端开开开开始始始始连连连连接脱氧核苷酸。接脱氧核苷酸。接脱氧核苷酸。接脱氧核苷酸。基础知识（二）（二）PCR原理原理请阅读请阅读教材教材P58内容，分析内容，分析：3、DNA DNA聚合酶的作用有何特性聚合酶的作用有何特性聚合酶的作用有何特性聚合酶的作用有何特性？DNADNA聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶不不不不能能能能从从从从头头头头开开开开始始始始合合合合成成成成DNADNA，而而而而只只只只能能能能从从从从33端延伸端延伸端延伸端延伸DNADNA链，因此，链，因此，链，因此，链，因此，DNADNA复制需要引物。复制需要引物。复制需要引物。复制需要引物。2、什什么么是是引引物物？若若要要在在体体外外克克隆隆DNA，需需要要加入几种特定的引物？加入几种特定的引物？【提提示示】引引物物是是指指能能与与DNA母母链链的的一一段段碱碱基基序序列列互互补补配配对对的的一一小小段段DNA或或RNA片片段段。克克隆隆DNA时应加入两种引物。时应加入两种引物。基础知识（二）（二）PCR原理原理请阅读请阅读教材教材P58内容，分析：内容，分析：4、为为为为什什什什么么么么DNADNA的的的的合合合合成成成成方方方方向向向向总总总总是是是是从从从从子子子子链链链链的的的的55端端端端向向向向33端延伸端延伸端延伸端延伸？DNADNA聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶不不不不能能能能从从从从头头头头开开开开始始始始合合合合成成成成DNADNA，而而而而只只只只能能能能从从从从33端端端端延延延延伸伸伸伸DNADNA链链链链。当当当当引引引引物物物物与与与与DNADNA母母母母链链链链通通通通过过过过碱碱碱碱基基基基互互互互补补补补配配配配对对对对结结结结合后，合后，合后，合后，DNADNA聚合酶就能从引物的聚合酶就能从引物的聚合酶就能从引物的聚合酶就能从引物的33端开始延伸端开始延伸端开始延伸端开始延伸DNADNA链。链。链。链。基础知识（二）（二）PCR原理原理请阅读请阅读教材教材P59内内容，分析：容，分析：5、在生物体外如何将在生物体外如何将在生物体外如何将在生物体外如何将DNADNA的双螺旋打开的双螺旋打开的双螺旋打开的双螺旋打开？DNADNA的的的的热热热热变变变变性性性性原原原原理理理理：在在在在80-80-1001000 0C C的的的的温温温温度度度度范范范范围围围围内内内内，DNADNA的的的的双双双双螺螺螺螺旋旋旋旋结结结结构构构构将将将将解解解解体体体体，双双双双链链链链分分分分开开开开，这这这这个个个个过过过过程程程程就就就就称称称称为为为为变变变变性性性性。当当当当温温温温度度度度缓缓缓缓慢慢慢慢降降降降低低低低后后后后，两两两两条条条条彼彼彼彼此此此此分分分分离离离离的的的的DNADNA链链链链又又又又会会会会重重重重新新新新结结结结合成双链，这称为复性。合成双链，这称为复性。合成双链，这称为复性。合成双链，这称为复性。PCRPCR就就就就是是是是利利利利用用用用了了了了DNADNA的的的的热热热热变变变变性性性性原原原原理理理理，通通通通过过过过控控控控制温度来控制双链的解聚与结合。制温度来控制双链的解聚与结合。制温度来控制双链的解聚与结合。制温度来控制双链的解聚与结合。根据根据DNA的热变性原理的热变性原理，通过自动改变温度，通过自动改变温度，达到扩增达到扩增DNA片段的目的。片段的目的。水浴锅PCR扩增仪扩增仪基础知识（二）（二）PCR原理原理请阅读请阅读教材教材P59内内容，分析：容，分析：6、高高高高温温温温能能能能将将将将DNADNA的的的的双双双双螺螺螺螺旋旋旋旋打打打打开开开开，但但同同时时也也可可能使能使DNA聚合酶失活，怎么办？聚合酶失活，怎么办？耐耐耐耐高高高高温温温温的的的的TaqDNATaqDNA聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶的的的的发发发发现现现现和和和和应应应应用用用用解解解解决决决决了以上矛盾。了以上矛盾。了以上矛盾。了以上矛盾。基础知识（二）（二）PCR原理原理小小结：结：PCR反应需要在一反应需要在一定的定的中中才能进行，并需要提供才能进行，并需要提供：同同时通时通过过 使使DNA复制在体外反复进行。复制在体外反复进行。缓冲溶液（类似细胞核液）缓冲溶液（类似细胞核液）DNA模板模板两种引物两种引物四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸耐热的耐热的DNA聚合聚合酶（酶（如如TaqDNA聚合聚合酶）酶）控制温度控制温度基础知识 PCR一一般般要要经经历历30多多次次循循环环，每每次次循循环环可可以以分分为为三三步步：变变性性、复复性性和和延延伸伸。在在循循环环之之前前常常要要进进行行一一次次预预变性变性（目的是增加模板（目的是增加模板DNA彻底变性的概率）。彻底变性的概率）。（三）（三）PCR的反应过程的反应过程重复重复1 13 3步步3030轮轮基础知识（三）（三）PCR的反应过程的反应过程1变变性性：当当温温度度上上升升到到_0C以以上上时时，双链双链DNA解聚为单链。解聚为单链。90靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列基础知识（三）（三）PCR的反应过程的反应过程2复复性性：温温度度下下降降到到_0C左左右右，两两种种引引物物通通过过_与与两两条条单单链链DNA结合。结合。50碱基互补配对碱基互补配对靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列引物引物引物引物 引物引物引物引物 55553333555555553333555533333333基础知识（三）（三）PCR的反应过程的反应过程3延延伸伸：温温度度上上升升到到_ 0C左左右右，溶溶液液中中的的四四种种脱脱氧氧核核苷苷酸酸在在_的的作作用用下下，根根据据碱碱基基互互补补配配对对原原则则合合成成新新的的DNA链。链。72DNA聚合酶聚合酶靶序列靶序列靶序列靶序列 靶序列靶序列靶序列靶序列基础知识 从从第第二二轮轮循循环环开开始始，上上一一次次循循环环的的产产物物也也可可以以作作为为模模板板参参与与反反应应.DNA聚聚合合酶酶只只能能特特异异性性地地复复制制处处于于两两个个引引物物之之间间的的DNA序序列列，使使这这段段固固定定长长度度的的序序列列呈呈指指数扩增。数扩增。（三）（三）PCR的反应过程的反应过程想一想？在构建基因表达载体的时候，通过限制性内切酶和DNA连接酶把目的基因和载体连在一起。若目的基因序列不含载体的限制酶酶切位点，请问如何利用PCR技术在目的基因的两端加入限制酶酶切位点？体内体内DNADNA复制与复制与PCRPCR的技术区别：的技术区别：体内复制体内复制PCRPCR技术技术解旋解旋引物引物一般用一般用DNADNA片段片段DNADNA聚合酶聚合酶TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶复制特点复制特点半保留复制，边解旋半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。边复制，多起点复制。复制的方向复制的方向 子链的子链的55端向端向 3 3端端延伸延伸在解旋酶作用下，细胞在解旋酶作用下，细胞提供提供ATPATP，部分解开，部分解开加热到加热到9494o oC,C,双链全部双链全部解开，不需解旋酶解开，不需解旋酶一小段一小段RNARNA细胞自身的细胞自身的DNADNA聚合酶聚合酶（不耐高温）（不耐高温）半保留复制，完全解半保留复制，完全解旋后复制，从模板链旋后复制，从模板链的一端开始复制。的一端开始复制。子链的子链的55端向端向 3 3端端延伸延伸查一查？在进行体外扩增DNA时，为什么用高温变性，而不用解旋酶？