半自动生化分析仪.ppt

生化分析仪第一单元 半自动生化分析仪的相关基本概念1.1 半自动生化分析仪将生物化学分析过程中的加样.加试剂.去干扰物.混合.保温反应.自动监测.打印报告及实验后的清洗等步骤进行半自动化连续操作的仪器。1.2 结果对比同一项目应用不同的检测系统按照特定的要求进行测定，按照统计学原理，将不同检测系统的测定结果进行比较的过程。1.3 嗍源性通过一条具有规定不确定度的不间断的比较链，使测量结果或测量标准的值能够与规定的参考标准，通常是与国家标准或国际标准联系起来的特性。1.4 摩尔消光系数在特定条件下，一定波长的光，光径为1.00cm时，通过所含吸光物质的浓度为1.00mol/L时的吸光度。1.5 准确度一次性测量结果与被测量真值的接近程度，它涵盖正确度和精密度，它往往以不准确度来衡量。1.6 正确度大量测量的均值与真值的接近程度。1.7 精密度在规定条件下获得的独立测量结果之间的接近程度。精密度按条件不同可进一步分为重复性中间精密度和重现性。重复性是指在相同条件（时间、校准、操作者、仪器等）获得的精密度，即所谓的批内精密度；中间精密度是指一种或几种条件因素发生变化，但在同一实验室内获得的精密度，重现性则是在不同实验室，不同条件下获得的精密度，故又称实验室间的精密度，用SD、CV表示不精密度。1.8 系数K值称为酶活性的定量系数，主要用于临床酶活性测定的计算与校正。K=V106/vLV代表反应体系体积L代表比色杯光径v代表样本体积代表摩尔消光系数1.9 标准物质一类充分均匀，并且有一个（或多个）确定的特性值的材料或物质，用以校准仪器设备、评价测量方法，或给其它物质赋值。1.10 一级标准物质（一级参考物质）具有最高计量学特性，由一级参考方法（决定性方法）进行定值，用来校准二级参考方法的标准物质。1.11 二级标准物质（二级参考物质）由二级参考方法（参考方法）进行定值，用来校准常规标准方法（厂家选定方法）的标准物质。1.12 校准物用于校准，分度或修正测量值的物质或装置，这种物质或装置必须跟踪国家或国际的标准或装置。由常规标准方法（厂家选定方法）定值，用于终用户实验室常规方法的校准。1.13 质控物用于常规工作中检查分析过程或仪器准确性和精密性的物质。1.14 最佳条件下的变异（OCV）指在某一实验室，在理想和恒定条件下对同一质控物进行反复测定所得出的变异，其目的在于观察用某一方法作某试验的最佳工作质量，是一个实验室能达到的最低变异（最好精密度）。1.15 常规条件下的变异（RCV）指在实验室常规分析条件下获得的精密度结果，质控物随大批病人标本在常规条件下进行测定，所得数据可用于室内质控。1.16 质量控制QC是质量管理的一部分，致力于满足质量要求，质量控制的目的是满足组织自身和其服务对象的质量要求，是保证检验结果可靠的重要手段。1.16 室内质量控制 IQC指实验室内为达到质量控制要求所采取的操作技术和活动，及实验室工作人员采用一系列统计学方法，评价本实验室测定结果的可靠程度，判断检验报告是否可发出，以及发现质量环节中的影响因素，误差程度，并进一步排除的过程。其目的主要是检测和控制常规工作中的精密度，提高常规工作中日内和日间标本检测的一致性。1.17 室间质量评价 EQA由第三方机构采用一系列的办法，连续地、客观地评价实验室的实验结果，并发现实验室本身不易发现的检测结果的不准确性，了解各实验室之间结果的差异，帮助其校正，使其结果具有可比性。这种评价是一种回顾性评价，是在建立实验室结果室间的可比性。1.18 延迟时间试剂与样品混合后到监测开始之间的时间，一般用于连续监测法。1.19 双波长由主波长和副波长构成的两个波长，采用双波长可以消除某些干扰物对实验的影响。主波长是指测定某物质时，生成的产物颜色对光吸收的特有波长，副波长是指测定某物质时，为消除其它干扰物质在主波长造成测定干扰所设定的波长。1.20 反应杯空白在特定波长下，光通过充盈蒸馏水和空气的反应杯（反应池）所测得的吸光度值。（特定条件下杯空白有特定要求 A值）1.21 试剂空白在各特定条件下（各种试剂），光通过以蒸馏水或生理盐水代替样品和相应测定项目试剂构成的反应体系所测得的吸光度值。（大多数情况下使用）1.22 样品空白在各特定条件下，光通过蒸馏水或生理盐等样品和相应测定项目不含有引起反应的一种或多种成分的试剂构成的反应体系所测得的吸光度值；或由生物样品和相应测定项目构成的反应体系产生反应最初时间所测得的吸光度值。1.23 分光（后分光）后分光的光路为光源样品分光元件检测器。其光源是先照射到样品杯（样品池），然后再通过光栅分光，再用检测器检测任何一个波长的吸光度。其优点是不需要移动仪器的任何部件即可同时选用双波长或多波长进行测定。（目前半自动生化分析仪也采用后分光，全自动几乎都采用后分光）1.24 终点分析法终点分析法是基于反应达到平衡时，反应产物的吸收光谱特征及其吸收强度的大小，对物质进行定量分析的一类方法。1.25 连续监测法通过适当的仪器，连续测定反应中其一反应产物或底物的浓度随时间变化的多点数据，求出反应的初速度，同时间接计算被测物浓度的方法为连续监测法。1.26 决定性方法（一级参考方法）指准确度最高，系统误差最小，经过详细研究未发现产生误差的原因，其测定结果与“真值”最接近，主要用于一级标准物质的定值，不直接用于鉴定常规方法的准确性。1.27 参考方法（二级参考方法）指准确度与精密度已被充分证实，且被公认的权威机构颁布的方法，其干扰因素少，系统误差小，重复测定中的随机误差可忽略不计。由一级标准物质校准，主要用于二级标准物质的定值。1.28 实验室常规方法指性能指标符合临床或其它目的的需要，有足够的精密度、准确度和特异性，及适当的分析范围的方法。1.29 实验室认可权威机构对检测/校准实验室有能力进行指定类型的检测/校准做出一种正式承认的程序。（如开展PCR实验室认可）1.30 实验室认证认证机构依据程序对实验室工作或服务是否符合规定的要求给予确认，给确认合格者出具合格证书，并由认证体系确保认证及其证书的使用法规、协议及程序的有效性。（ISO 15189医学实验室认证）（ISO 17025检测校准实验室认证）（二）生化分析仪分类2.1 根据反应装置的结构分类2.1.1 连续流动式在微机控制中下，通过比例泵将标本和试剂注入到连续的管道系统中，在一定的温度下，在管道内完成混合、保温、比色测定、信号放大、运算处理，最后将结果显示并打印出来。由于不同含量的标本通过同一管道，前一标本不可避免会影响后一标本的结果，这就是所谓的携带污染，这已成为制约此系统应用的一个重要因素，半自动多采用这种方式。2.1.2 离心式先将样品和试剂分别置于转盘相应的凹槽内，当离心机开机后，受离心力的作用，试剂和样品相混合发生反应经过适当的时间后，各样品最后流入转盘外圈的比色凹槽内，通过比色计检测。2.1.3 分立式目前临床实验室所用的大部分分析仪都属此类。分立式分析仪的特点为模拟手工操作的方式设计仪器并编制程序，以机械臂代替手工，按照程序进行有序地操作，完成项目检测及数据分析。（大型分析仪都是）2.1.4 干片式采用干化学方法，将发生在液相反应物中的反应，转移到一个固相载体上，利用分光检测系统进行检测的一类仪器（单通道、多通道，单通道只能检测一个项目，但项目可更换，多通道每次可以同时检测多个项目）。（大型、中型、小型）（试剂开放程度，封闭系统，开放系统）（三）分析仪的基本结构及工作原理3.1 样品系统：样品包括校准品，质控品和病人样品。样品分配系统：多由注射器，步进马达或传动泵，加样臂和样品探针。系统对样品可进行预稀释或加倍加样。3.2 试剂系统试剂系统一般由试剂储放和分配加液装置组成。3.3 条形码识别系统3.4 反应系统反应盘、混合装置、温控装置、清洗系统、管路系统。3.4.1 分析仪的温控装置分析仪通过恒温控制装置来保持孵育温度的稳定，反应混合物的孵育温度的调控是由计算机来控制的，理想的孵育温度波动应小于0.1。保持恒温的方式有三种：空气浴恒温水浴循环恒温恒温液循环间接加热式，比色池或比色杯和恒温液之间有极小的空气狭缝，恒温液通过加热狭缝里的空气来达到恒温，无需特殊保养。3.5 清洗系统预稀释清洗液，水。3.6 管路系统管路系统的老化或长期使用后反应废物的沉积和阻塞，常造成反应结果重复性差，应定期更换或清洁管路。3.7 比色系统3.7.1 光源：一般采用卤素灯或氙灯，卤素灯的工作波长约为300800nm，使用寿命一般为1000小时，部分分析仪采用的是长寿命的氙灯，24h待机可工作数年，工作波长为285-750nm，当光的发光强度不够时，仪器会自动报警，应及时更换。3.7.2 比色杯通常由石英、硬质玻璃或优质塑料，定期清洗，及时更换。3.7.3 单色器与检测器各类生化分析仪应用的是可见-紫外吸光谱法，即监测200-700nm光区某特定波长下发色基因吸光度的变化，辅以微机软件系统的计算来完成测定，可见-紫外吸光谱的基础是Lambert-Beer定律。传统的分光度测定普遍采用前分光，即在光源灯和样品杯之间先要用滤光片、棱镜或光栅分光，通过可调的狭缝，取得与样品“互补”的单色光之后，照射到样品杯，再用光电池或光电管作为检测器，测定样品对单色光的吸收量（吸光度）。而现代大多生化分析仪采用后分光测量技术。后分光测定：将一束白光（混合光）先照到样品杯，然后再用光栅分光，同时用一列发光二极管排在光栅后面作为检测器。后分光的优点是不需移动仪器比色系统中的任何部件，可同时选用双波长或多波长进行测定。还可降低比色的噪声，提高分析的精确度和减少故障。3.8 程序控制系统计算机是分析仪的大脑。标本、试剂的注加和识别，条码的识别，恒温控制、冲洗控制，结果打印，质控的监控，仪器各种故障报警等都由计算机控制完成。四、分析仪安装及使用前准备4.1 分析仪工作环境要求：工作空间、工作条件、环境温度及湿度。4.1.1 空间面积要足够，以保证仪器的操作、保养维修的方便及各种外围配套设备（UPS不间断电源）的安装。4.1.2 仪器工作条件，没有阳光直接照射，灰尘少，平坦没有震动，电源波动10%，仪器设置应尽量避免化学腐蚀物品，电磁辐射的污染。4.13 仪器工作环境的温度和湿度温度应控制在18-30，工作时波动小于2，部分仪器内设置了允许温度范围，当温度超过允许范围时仪器自动停止检测，工作环境湿度通常有严格要求，温度过高可能引起仪器部件的生锈发霉等情况降低使用寿命，而过于干燥则可能引起静电增加，灰尘吸附增加而干扰光路系统的稳定性。4.1.4 电源的要求要求始终连接符合要求的地线，并连接UPS不间断电源，最好延时30分钟以上。不正常状态下的关机可降低仪器使用寿命和测定数据的丢失。4.2 清洗系统的要求蒸馏水、去离子水、反渗透水（五）分析仪的分析方法5.1 紫外可见分光光度法根据物质分子对紫外线可见光区辐射的吸收特性，对物质的组成进行定性或定量及结构分析的方法，属分子吸收光谱法。紫外可见分光光度法具有较高的灵敏度和准确度，方法快速可靠，仪器设备简单，许多分析方法被推荐为国际标准和我国国家标准分析方法。Lambert-Beer定律是光吸收的基本定律，其数学表达式为：A=Kbc 式中，A为吸光度，K为吸光系数，是与入射光的辐射波长及吸收物质的性质有关的常数；b为液层厚度，单位为cm，c为吸收物质的浓度。当浓度的单位为mol/L时，K的单位为L/molcm，称为摩尔吸收系数，通常用表示。摩尔吸收系数表示物质对某一波长的辐射的吸收特性。愈大，表示物质对某波长辐射的吸收力愈强，测定的灵敏度愈高。5.2 终点法终点测定法是最常用的分析法。优点是吸光度信号变化大，吸光度稳定，对温度、时间、显色试剂的用量与配方要求不高，所以是重复性好、精密度高的方法。缺点是时间长，某些仪器的效率会降低。终点法分为一点终点法、两点终点法和多点终点法。5.2.1 一点终点法临床化学自动分析仪将生物样品与相应的试剂在反应系统（反应杯）内充分混合，在一定温度下，经过一定时间的反应，通过比色系统测得反应平衡后在特定的波长下，一定时间的吸光度值，读取的吸光度值由微机系统处理并计算测定结果。5.2.2 两点终点法首先生物样品与所用双试剂中不与标本发生反应的试剂1充分混合，在一定温度下，一定反应时间，特定波长下，读取吸光度值，然后追加启动反应试剂，在反应达到平衡时，第二次读取吸光度值（或与所用单试剂充分混合后在最初时间读取吸光度值，一定时间后读取第二次吸光度值）。最后对两次吸光度值由微机系统处理并计算测定结果。5.2.3 多点终点法在一个通道内一次进行多个反应相关的终点法测定。某些仪器设置有此方法。5.3 固定时间法指在时间-吸光度曲线上选择两个测光点，此两点既非反应初始吸光度亦非终点吸光度，这两点的吸光度差值用于结果计算。有时也称此法为两点法。该种方法有助于解决某些反应的非特异性问题。5.4 连续监测法目前，酶浓度测定有两种方法，两点速率法和多点速率法，它是测定酶所催化的反应速度，间接计算出酶的含量。在酶促反应过程中，不是任何时期的反应速率都和酶浓度成正比。当酶促反应刚一开始，底物处于过量状态，酶与底物开始结合，生成复合物，底物浓度开始下降，此时产物尚未生成。当复合物分解，生成产物，酶促反应速度急骤上升，经过很短的作用时间后，产物的生成量或底物的减少量与反应时间成线性关系，反应速度保持恒定不变，这一时期称为零级反应期。随酶促反应继续进行，底物不断消耗，酶促反应条件逐渐变化，酶促反应速度逐渐减慢，产物生成或底物减少量的变化曲线遂趋平坦，这一时期称为一级反应期。此时的反应速率常常不能准确反映酶的含量，只有当底物饱和度时，酶促反应速度才能保持恒速，此时的酶促反应速度和酶浓度才有线性关系。生化分析仪是由微机控制的恒温比色，并记录酶促反应全过程的仪器，因此采用连续监测法来测定酶活性，大大提高了测定的准确性和分析速度。连续监测法是通过适当的仪器，连续测定（每230秒监测一次）酶促反应过程中产物或底物的浓度随时间变化的情况。在反应速度恒定期，以单位时间酶反应初速度来计算酶的活力单位。5.5 波长的选择5.5.1 波长的正确选择有利于提高测定的灵敏度和减少测定误差。光度学方法有单波长和双波长之分，有的仪器可用三波长，多波长以及两波长比率等。有的仪器可作导数光谱分析。单波长测定易受样品溶血、黄疸、脂浊等因素干扰。双波长分析就是选择主波长同时选择副波长，在计算时用主波长的吸光度减去副波长的吸光度。双波长的优点：消除噪音干扰。减少杂散光影响。减少样品本身光吸收的干扰。当样品中存在非化学反应的干扰物如甘油三酯、血红蛋白、胆红素等时，会产生非特异性的光吸收，双波长方式可以部分消除这类光吸收干扰。5.5.2 测定波长选择有三个主要条件待测物质在该波长下的光吸收最大。其吸收峰宜较宽而纯，而不是处于尖峰或陡肩，一般不选光谱中的末端吸收峰，换句话说，该吸收峰处的吸光度随波长变化较小。常见干扰物在该波长下的光吸收最小。试剂盒说明一般已提供波长参数。实际波长选择需要了解待测物质和干扰组分对不同波长单色光的吸收程度，即以波长为横坐标、吸光度为纵坐标作吸收光谱曲线（光吸收曲线）。六、分析仪的质量控制建立各项目的标准操作程序。室内质控和结果分析。参加全国或地方的室间质量评价的活动。6.1 校准6.1.1 校准方法6.1.1.1 用校准品进行校准：用校准品进行校准应注意如下问题：选择合适的校准品，以保证检测结果的可溯源性；根据试验项目确定校准的频度，校准的频度过高，加重不必要的工作及浪费资源，同时易引入系统偏差；校准的频度过低，不能保证结果的准确性。室内质控出现异常的趋势或者偏移时的项目应重新校准；注意区别定值质控血清和校准品，决不可用定值质控血清代替校准品进行校准。校准方式可采用两点或多点校准，但对于多数的免疫比浊法应采用多点校准。校准方式可采用两点或多点校准，但对于多数的免疫比浊法应采用多点校准。两点法校准采用一个浓度的校准品和一个试剂空白，标准曲线为直线；多点法校准工作曲线可以为对数、指数、量程法等非线性曲线。6.1.1.2 应用实际K值进行校准迄今为止，某些仪器还是用理论K值或者厂家给出的K值进行计算。一个物质的摩尔吸光度是一个定值，而理论K值的计算与物质的摩尔吸光系数、光径、样本及试剂加注量等因素有关。在不同的检测系统，由于仪器的性能不一，特别是仪器的加样系统的误差、分光系统的误差、干涉滤光片或光栅等半波宽度偏大导致的杂光以及多波长同时使用等，使仪器达不到理论上的最佳状态，从而导致该仪器的实际K值与理论K值不一致。因此，不宜直接使用理论K值进行计算。如果使用厂家配套的检测系统，厂家提供的K值实际上是该检测系统的实际K值，在仪器经厂家校准的前提下，可以直接使用。6.1.1.3 在公认的酶活性标准品问世前需使用K值进行酶活性的计算。应提倡使用实际K值进行计算。使用实际K值应注意如下问题：不同的仪器，实际K值不同；同一仪器的不同时期，特别是仪器进行了维修甚至更换了重要的部件时，实际K值不同；不同的检测系统，实际K值不同。6.1.2 标准物质（参考物质）的特征6.1.2.1 均质性好：在使用标准物质时常是取其中一部分，而标准物质的标示值是对一批标准物质定值的数据，因此均匀性好是标准物质使用的重要特征。如冻干血清复溶混匀前飞溅、悬浮性颗粒（如全血细胞校准物和质控物）混匀方法不当，均可造成取样的量值不能代表整体量值。6.1.2.2 性能稳定：标准物质的稳定性是指标准物质长时间贮存时，在外界环境条件的影响下物质特性量值和物理化学性质保持不变的能力。具有良好稳定性的标准物质，应在规定的期限内按规定的条件贮存。6.1.2.3 量值准确：量值准确是标准物质的基本特征，标准物质作为同一量值的一种计量标准，即凭借该准确特性量值校准仪器测量方法、进行量值传递、保证检测质量。标准物质的特性量值必须由具有良好仪器设备的实验室组织有经验的技术人员，采用准确、可靠的测量方法定值。6.1.2.4 具有与待测物质类似的组成或特征：为消除由于标准物质与与待测物质两者除了待测物外其他物质及组份的不同，而对分析结果产生的影响，选用标准物质确定待测物质量值时，应选择与待测物质在组成或特性相近似的标准物质，这是使用标准物质的一条重要原则。近年来检验医学十分重视基质效应问题。克服基质效应的方法是使标准物质和被测标本处于相同的基质环境6.1.2.5 批量生产6.1.2.6 标准物质证书6.1.3 校准物一种用于校准、分度或修正测量值的物质或装置，这种物质和装置必须跟踪国家或国际的标准物质或装置。校准物应具有与标准物质相同的特征。6.2 室内质量控制（IQC）6.2.1 室内质控的主要方法：室内质控方法有多种，各临床实验室应根据各自情况和测定项目选择适合本实验室的室内质控方法。常用的质控方法有均值-标准差质控图法（Levey-Jennings质控图）。该法由于仅需要单一浓度的未定值血清，绘图方法简便易懂，有较为成熟的理论和实际经验，因此成为目前临床实验室最常用的一种室内质量控制方法。6.2.2 Levey-Jennings质控图绘制选择含量均匀、稳定性良好的质控血清，在常规条件下，在至少10天内测定20或更多个独立批获得至少20次质控结果（日内、日间反复测定20次），计算均值和标准差。控制图中Y轴为质控物的测定值，一般至少标出X3 s，X2s，Xs；X轴为测定次数（可具体的以日期或分析批号表示）。控制图上通常包含五条线，为中心线、警告。6.2.3 质控物的水平和检测频率6.2.3.1 通常应至少选择2个水平的质控物，一个生理水平和一个病理水平，两个水平质控品的浓度值应在测定方法的线性范围内。6.2.3.2 质控品检测的频率无具体规定，推荐每个独立测定批都应做质控，每个工作日应至少做两次质控。6.2.4 Westgard多规则质控法常用质控规则（1）12s规则：一个水平测定值处于2s3s界限内，可作为“警报”信号。（2）13s规则：一个水平测定值超过3s界限，为“失控”。（4）R4s规则：同一批中两个水平质控一个超出+2s限值，另一个超出-2S限值，为“失控”，或同一水平连续两次测定，一次超出+2S限值，另一次超出-2S限值，也为“失控”。6.2.5 室内质控的实际操作设定靶值设定控制限更换质控品绘制质控图及记录质控结果质控方法（规则）的应用 失控后的分析及处理6.2.6 室内质控数据的管理每月室内质控数据保存：每月上报质控数据图月报表室内质控数据的周期性评价：比较当月与以往各测定项目质控数据的平均值、标准差和变异系数，发现问题，及时纠正。6.2.7 较理想的质控物应具备以下一些特性人血清基质，分布均匀；无传染性；添加剂和抑菌剂的数量尽可能少；瓶间变异小；冻干品得溶后稳定时间足够长；有效期应在1年以上。6.3 室间质量评价（EQA）能力验证（PT）能力验证是室间质量评价技术方案之一，也是实验室认可的一项重要内容。能力验证指的是利用实验室间比对确定实验室的检测能力。目前室间质量评价多采用此种方法。七、分析仪使用试剂盒的评价通过国家食品药品监督管理局（SFDA）的批准。产品名称，应参照SFDA颁布的“体外诊断试剂分类目录”确定产品的名称、规格型号，应规定可进行的测试次数，也可用包装规格表示。检测原理 简单扼要说明测定原理及名称。试剂的成分 明确说明试剂中组成成分的数量、比例及浓度。单位应采用国际标准单位。试剂的稳定性检测程序参考范围及其参考人群的说明诊断试剂的性能评估注意事项八、临床生物化学实验方法的选择与评价方法选择的要求实用性：一般应具备微量快速；费用低廉；应用安全；便于急诊。可靠性：一般具有较高的精密度和准确度，以及较大的检测能力。