microbial-genetics 3细菌和放线菌的基因重组和遗传分析.ppt

第三章第三章 细菌和放线菌的基因细菌和放线菌的基因重组和遗传分析重组和遗传分析 真核微生物：基因重组涉及整个染色体真核微生物：基因重组涉及整个染色体 减数分裂减数分裂原核生物：基因重组仅涉及部分染色体原核生物：基因重组仅涉及部分染色体或个别基因或个别基因 转化、接合、转导转化、接合、转导第一节第一节 转化作用转化作用（Transformation）转化：某一基因型细胞从周围介质转化：某一基因型细胞从周围介质中吸收来自另一基因型细胞中吸收来自另一基因型细胞DNADNA而而使受体细胞基因型和表型发生相应使受体细胞基因型和表型发生相应变化的现象。变化的现象。A.TransformationTransfer of free DNA to a bacterial genome.free DNAfree DNArecipient cellgeneral recombination一般重组一般重组(同源重组同源重组)Transformant 转化子转化子chromosomeGeneral recombination is not necessary because plasmids have origins of replicationtransformantfree DNA(plasmid)TBGriffith in 1928,肺炎双球菌转化现象肺炎双球菌转化现象自然转化的原核生物种类自然转化的原核生物种类大肠杆菌大肠杆菌肺炎双球菌肺炎双球菌枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌流感嗜血菌流感嗜血菌一、转化作用的发现一、转化作用的发现Griffith转化研究转化研究(1928)二、转化作用过程二、转化作用过程1 1、受体细胞感受态出现、受体细胞感受态出现2 2、转化因子的吸附和渗入、转化因子的吸附和渗入3 3、转化因子的整合、转化因子的整合1 1、感受态出现、感受态出现感受态感受态(CompetenceCompetence)：细菌从周围环境：细菌从周围环境吸收吸收DNA DNA 分子，并且不易被细胞内的限分子，并且不易被细胞内的限制性内切酶分解时所处的一种特殊生理制性内切酶分解时所处的一种特殊生理状态。状态。处于感受态的细胞转化率高处于感受态的细胞转化率高 Competence:The capacity of cells to take up free DNAa.Some cells are naturally competentb.In some cells,competence can be induced by chemical and physical treatmentc.In most cells,competence can be induced by electroporation.TB感受态：感受态：在特定生长阶段或特定条件在特定生长阶段或特定条件下出现，一般出现在细胞对数期后；下出现，一般出现在细胞对数期后；不同细胞维持感受态时间不同；不同细胞维持感受态时间不同；实验：实验：肺炎双球菌抗链霉素菌株肺炎双球菌抗链霉素菌株DNA DNA 转化无抗性菌株转化无抗性菌株感受态诱导感受态诱导如果细胞没处于感受态可以诱导：如果细胞没处于感受态可以诱导：细胞由营养丰富的培养液细胞由营养丰富的培养液贫瘠的培养液贫瘠的培养液高浓度高浓度CaClCaCl2 2和改变温度结合处理：适合于和改变温度结合处理：适合于独立的独立的DNA DNA 复制子，如质粒和病毒，转化率复制子，如质粒和病毒，转化率很高。很高。对数生长期的对数生长期的大肠杆菌大肠杆菌(受体菌受体菌)悬浮于悬浮于冰预冷的低渗冰预冷的低渗0.1mol/L0.1mol/L氯化钙氯化钙溶液中处溶液中处理理15-3015-30minmin 使细菌细胞膜通透性使细菌细胞膜通透性增加（成为感受态细胞）增加（成为感受态细胞）向大肠杆菌中向大肠杆菌中加入外源加入外源DNADNA，使之吸附使之吸附于细胞表面于细胞表面4242短暂的短暂的热处理热处理，促进外源促进外源DNADNA进入感受态细胞进入感受态细胞.感受态诱导感受态诱导(实验实验)对于对于不能自然形成感受态的细胞不能自然形成感受态的细胞，可以采，可以采用用 PEGPEG（聚乙二醇）诱导转化聚乙二醇）诱导转化,这类细菌首这类细菌首先用细胞壁降解酶除去肽聚糖层，在先用细胞壁降解酶除去肽聚糖层，在PEGPEG存存在下，质粒和噬菌体在下，质粒和噬菌体DNADNA可以可以高效高效导入原生导入原生质体。质体。-例如：例如：Bacillus subtilis利用利用 PEGPEG技术可以技术可以使使80%80%的细胞被转化，的细胞被转化，10107 7转化子转化子ugug质粒质粒DNADNA。对于对于不能自然形成感受态的细胞，也不能不能自然形成感受态的细胞，也不能诱导产生感受态的细胞诱导产生感受态的细胞，可以用，可以用人工方法将人工方法将核酸导入核酸导入电击穿孔转化电击穿孔转化：用电转化仪产生的高压脉冲：用电转化仪产生的高压脉冲电流击穿细胞膜形成小孔，使电流击穿细胞膜形成小孔，使DNADNA分子通过小分子通过小孔瞬间进入细胞。小孔自动恢复原状孔瞬间进入细胞。小孔自动恢复原状.该法适合于该法适合于原核细胞和真核细胞。原核细胞和真核细胞。对于对于大肠杆菌大肠杆菌，10109 9-10101010转化子转化子ugDNAugDNA.电转化仪（转化细菌和真菌）电转化仪（转化细菌和真菌）3)Transformation Application:Recombinant DNA technology电击杯电击杯利用高压气体加速，将包裹了带目的基因的利用高压气体加速，将包裹了带目的基因的DNA溶液的高速微弹直接送入完整的受体细胞溶液的高速微弹直接送入完整的受体细胞中。中。HeHe利用利用Gene gun转化转化DNA二、转化作用过程二、转化作用过程1 1、受体细胞感受态出现、受体细胞感受态出现2 2、转化因子的吸附和渗入、转化因子的吸附和渗入3 3、转化因子的整合、转化因子的整合2 2、转化因子的吸附和渗入、转化因子的吸附和渗入转化因子转化因子(线形线形)首首先吸附在感受态细先吸附在感受态细胞表面凹陷处，胞表面凹陷处，由核酸内切酶作用由核酸内切酶作用将将 DNADNA切成切成4-54-5MDMD的片段，的片段，再由核酸外切酶作再由核酸外切酶作用将双链的一个单用将双链的一个单链分解，链分解，另一单链与感受态另一单链与感受态特异蛋白特异蛋白结合，进结合，进入细胞。入细胞。感受态特异蛋白感受态特异蛋白细胞分泌小蛋白细胞分泌小蛋白,而导致细菌而导致细菌感受态的形成感受态的形成,在营养缺乏的在营养缺乏的饥饿状态下，细胞易产生感饥饿状态下，细胞易产生感受态因子受态因子 在自然转化中感受态因子与细胞表面在自然转化中感受态因子与细胞表面受体相互作用产生自溶素，自溶素可受体相互作用产生自溶素，自溶素可使细胞表面的使细胞表面的DNA 结合蛋白和核酸酶结合蛋白和核酸酶裸露。核酸酶可完全降解裸露。核酸酶可完全降解DNA，所以，所以自然转化很难发生。自然转化很难发生。3 3、转化因子整合、转化因子整合1 1）受体）受体DNADNA部分双链松开，供体和受体部分双链松开，供体和受体DNADNA单链碱基配对单链碱基配对2 2）供体）供体DNADNA整合于受体染色体上，与之配对的受体整合于受体染色体上，与之配对的受体DNADNA单链被单链被DNADNA酶降解酶降解3 3）不与供体）不与供体DNADNA配对的另一条受体配对的另一条受体DNADNA单链被切下降解单链被切下降解4 4）供体）供体DNADNA单链复制成双链单链复制成双链细菌转化细菌转化三、三、转化在遗传分析中的应用转化在遗传分析中的应用1、基因连锁检测、基因连锁检测实验：肺炎双球菌实验：肺炎双球菌R/AmpR/Amps s（受体）和受体）和S/S/AmpAmpr r型型（供体）进行转化。（供体）进行转化。S/S/AmpAmpr rDNADNA+R/Amp+R/Amps s R/R/AmpAmpr r or S/or S/AmpAmpS S说明每次转化说明每次转化,受体菌只能得到供体菌某一形受体菌只能得到供体菌某一形状状.共转化共转化：受体菌吸收外源：受体菌吸收外源DNA DNA 后，两后，两个遗传形状同时改变的现象。个遗传形状同时改变的现象。共转化的两个基因可以是共转化的两个基因可以是连锁或非连连锁或非连锁锁的关系。如何判断两个基因是不是的关系。如何判断两个基因是不是连锁关系连锁关系？根据转化子的产生和供体根据转化子的产生和供体DNADNA的浓度的浓度关系进行判断。关系进行判断。(1)如果如果ab是连锁的，是连锁的，当当DNA浓度下降时（下降浓度下降时（下降10倍），倍），ab转化频率的转化频率的下降趋势与下降趋势与 a或或b相同相同（下降（下降10倍倍).(2)如果如果ab是不连锁的是不连锁的，ab转化频率是转化频率是 a和和b的乘的乘积；当积；当DNA浓度下降时，浓度下降时，ab转化频率的下降将远转化频率的下降将远远超过远超过a和和b（下降（下降100倍倍)。外源外源DNA(a和和b基因基因)转化转化2 2、遗传学图谱的绘制、遗传学图谱的绘制如果确定了两个共转化基因存在连锁关系，如果确定了两个共转化基因存在连锁关系，可以根据可以根据共转化频率共转化频率来进行基因定位来进行基因定位.同一染色体片段两个基因位置越近，共转同一染色体片段两个基因位置越近，共转化频率越高。化频率越高。共转化频率可以用共转指数代表。共转化频率可以用共转指数代表。共转指数共转指数=a a+b b+（a a+b b-+a a-b b+a a+b b+）共转指数越大，两个基因相距越近共转指数越大，两个基因相距越近.7类转化子3个基因相对位置？个基因相对位置？共转指数共转指数=a+b+(a+b-+a-b+a+b+)共转指数越大，两个基因相距越近共转指数越大，两个基因相距越近.每两个基因共转指数每两个基因共转指数=1-1-重组值重组值,分别为分别为 trp2-his2:trp2-his2:0.66,0.66,trp2-tyr1:trp2-tyr1:0.0.6060 his2-tyr1:his2-tyr1:0.0.8787共转指数越大，两个基因相距越近共转指数越大，两个基因相距越近.3 3个基因相对位置：个基因相对位置：trp2-his2-tyr1 trp2-his2-tyr1一一 接合现象的发现接合现象的发现E.coliE.coli k12 k12两个营养两个营养缺陷型混合，以缺陷型混合，以 1010-8 8出现野生型。出现野生型。第二节第二节 接合作用接合作用细细菌菌接接合合作作用用对接合现象的解释：对接合现象的解释：（1）可能是细菌接合后发生基因重组的结果；）可能是细菌接合后发生基因重组的结果；（2）细菌并没有接合，而是交换了）细菌并没有接合，而是交换了DNA（转化）；转化）；（3）细菌细胞并没有接合，而是通过培养基交换）细菌细胞并没有接合，而是通过培养基交换了养料，即互养；了养料，即互养；（4）细菌细胞并没有接合，而是亲本细菌发生了）细菌细胞并没有接合，而是亲本细菌发生了回复突变的结果；回复突变的结果；（5）虽经接合而未发生基因重组，只是形成异核）虽经接合而未发生基因重组，只是形成异核体或杂合二倍体。体或杂合二倍体。接合作用的证明接合作用的证明1、转化作用的排除、转化作用的排除 由于在报道由于在报道接合试验结果接合试验结果之前转化实验之前转化实验已经是众所周已经是众所周知，因此有人知，因此有人怀疑该结果是怀疑该结果是由转化所导致由转化所导致的。的。1950年，年，B.D.Davis设计设计了了U形管实验否形管实验否定了这一推测定了这一推测（见右图）（见右图）2、互养的排除、互养的排除 营养缺陷型细菌通过培养基交换养料而产生的营养缺陷型细菌通过培养基交换养料而产生的现象称为互养。现象称为互养。Lederberg 和和 Tatum将培养过一种营养缺陷型将培养过一种营养缺陷型细菌的培养基经过灭菌、过滤，然后加入到另一细菌的培养基经过灭菌、过滤，然后加入到另一营养缺陷型菌培养物中。即使前一种菌在培养、营养缺陷型菌培养物中。即使前一种菌在培养、灭菌、过滤之前曾发生过裂解，也不能是后一种灭菌、过滤之前曾发生过裂解，也不能是后一种菌产生原养型。菌产生原养型。3、回复突变的排除、回复突变的排除 若要发生两种突变的回复突变，其几率为若要发生两种突变的回复突变，其几率为1012，这是不可能的。这是不可能的。4、异核体和杂合二倍体的排除、异核体和杂合二倍体的排除ABABABABAB异核体异核体杂合二倍体杂合二倍体单倍重组体单倍重组体 异核体和杂合二倍体的遗传性状不稳定，在传异核体和杂合二倍体的遗传性状不稳定，在传代过程中会发生性状分离，但事实恰恰相反，原代过程中会发生性状分离，但事实恰恰相反，原养型菌落的基因型是稳定的，证明是单倍重组体。养型菌落的基因型是稳定的，证明是单倍重组体。二二、F F 因子与接合作用因子与接合作用（一）接合作用条件（一）接合作用条件：两种菌：两种菌接触接触、供体、供体菌含有菌含有 F F因子因子（致育因子）（致育因子）1 1、F F因子因子F F因子是一种独立于染色体之外的遗传因因子是一种独立于染色体之外的遗传因子，为质粒子，为质粒。含有含有F F因子的供体因子的供体F F+细胞细胞和不含和不含F F因子的因子的受体受体F F-细胞细胞接触后，接触后，F F-细胞全部变成细胞全部变成F F+细胞细胞DonorRecipientF因子因子/F质粒质粒F F因子基因组分三个区段因子基因组分三个区段1 1）控制自主复制控制自主复制：含有复制：含有复制酶基因（酶基因（rep rep）、）、不相溶不相溶性基因性基因incinc和环型和环型DNADNA复制复制起点起点oriVoriV（双向复制）双向复制）.2 2）转移区段转移区段：由：由2323个基因组个基因组成一个具有转移功能的操成一个具有转移功能的操纵子，含性菌毛形成基因纵子，含性菌毛形成基因以及以及oriToriT（滚环复制和基滚环复制和基因转移起点，单向复制）因转移起点，单向复制）.3 3）3 3个插入序列和一个转座元个插入序列和一个转座元.接合作用的另外一个条件：接合作用的另外一个条件：供体菌供体菌带有性菌毛带有性菌毛，接合第一步：性菌毛识别接合第一步：性菌毛识别受体细胞，供体性菌毛接受体细胞，供体性菌毛接触受体触受体F F-细胞，很快两细细胞，很快两细胞直接接触形成胞质桥通胞直接接触形成胞质桥通道；胞质桥是道；胞质桥是F F因子转移因子转移通道，但性菌毛不是。通道，但性菌毛不是。接合第二步：接合第二步：F F因子在复因子在复制同时通过胞质桥通道进制同时通过胞质桥通道进入受体细胞。入受体细胞。2、F F 因子存在状态及其因子存在状态及其它们之间的关系它们之间的关系根据根据F F因子的存在状态将因子的存在状态将大肠杆菌分为大肠杆菌分为4 4种：种：F F-细胞细胞：不含：不含F F因子因子F F+细胞细胞：含游离于染色体：含游离于染色体之外的之外的F F因子因子HfrHfr细胞细胞：F F+整合到细菌整合到细菌染色体上染色体上F F细胞细胞：F F+从细菌染色从细菌染色体上误差脱离形成体上误差脱离形成F F细细胞。胞。(二二)细菌接合的三种方式细菌接合的三种方式F plasmiddonor cell(F+)F-pilusThe F-pilus is used for cell-cell attachmentrecipient cell(F-)chromosomechromosomeF+F-Crossesreplication andtransfer of ssDNAF+exconjugantF+Note that the recipient cell becomes F+oriT胞质桥胞质桥F因子一条单链因子一条单链在在oriT（转移和合转移和合成位点）打开，成位点）打开，5 端通过通道进入受端通过通道进入受体体 受体细胞和供体受体细胞和供体细胞中两个单链采细胞中两个单链采取滚环复制，取滚环复制，F因因子全部转移。子全部转移。供体染色体供体染色体DNA 并不转移。并不转移。滚滚环环复复制制 滚环复制的电镜照片 Hfr F-CrosseschromosomeHfr strainintegratedF plasmidF plasmidintegrationFormation of Hfr strainF+strainMechanism of Hfr x F-Crosses缺刻螺旋酶缺刻螺旋酶Hfr部分基因组转移，部分基因组转移，转移频率比转移频率比F+F-高高1000倍以上，为倍以上，为高频高频重组重组转移时首先在转移时首先在oriT开开始，然后小部分始，然后小部分F因因子，接着染色体基因子，接着染色体基因组，最后是大部分组，最后是大部分F因子，因子，Hfr全部基因组转移全部基因组转移很难，所以很难，所以Hfr F-仍为仍为F-细胞。细胞。在在F F F F-接合作用中，接合作用中，F F因子能专因子能专一导入一导入F F-细胞使受体成为细胞使受体成为F F细胞。细胞。整个过程与整个过程与F F+F F-接合作用相同。接合作用相同。3）F F-接合作用接合作用An improperly excised F plasmid containing a segment of bacterial chromosomal DNA.F x F-Crosses:HfrFimproperexcisionF-plasmidFMechanism of F x F-CrossesFFFFFF-FF-oriT5-P3-OH三、中断杂交试验及基因定位三、中断杂交试验及基因定位基因定位：基因定位：通过遗传重组等手段确定不同通过遗传重组等手段确定不同的基因在染色体上的位置及相对距离，从的基因在染色体上的位置及相对距离，从而获得遗传图谱。而获得遗传图谱。细菌基因转移的三种方式（接合、转导、细菌基因转移的三种方式（接合、转导、转化）都可以用来进行细菌基因组作图。转化）都可以用来进行细菌基因组作图。1 1、中断杂交（、中断杂交（interrupted matinginterrupted mating）技术技术 19571957年由年由wollmanwollman和和JacobJacob首次进行中断杂首次进行中断杂交实验交实验 1)1)利用利用HfrFHfrF-的接合过程，在不同时间取的接合过程，在不同时间取样，并把样品猛烈搅拌以分散接合中的细样，并把样品猛烈搅拌以分散接合中的细菌，然后分析菌，然后分析受体受体细菌基因型，以时间细菌基因型，以时间(分分钟钟)为单位绘制遗传图谱，该图谱是细菌染为单位绘制遗传图谱，该图谱是细菌染色体上基因顺序的直接反映。色体上基因顺序的直接反映。2)2)在杂交过程中，按照特定时间间隔取样，在杂交过程中，按照特定时间间隔取样，用高速搅拌器将杂交的用高速搅拌器将杂交的HfrHfr和和F F-分开，涂补分开，涂补于不同选择性培养基上培养。于不同选择性培养基上培养。这种在接合的特定时间内人为的中断杂交这种在接合的特定时间内人为的中断杂交以测定重组子基因型的的方法称以测定重组子基因型的的方法称中断杂交中断杂交实验实验。3 3）在）在HfrFHfrF-的接合过程中，的接合过程中，HfrHfr细细胞染色体从胞染色体从F F因子的因子的oriToriT位点开始逐位点开始逐渐向渐向F F-细胞转移，靠近细胞转移，靠近oriToriT位点的基位点的基因有更多机会出现在因有更多机会出现在F F-细胞中，越是细胞中，越是后面的基因转移几率越小。后面的基因转移几率越小。4）供体菌和受体菌）供体菌和受体菌：供体菌：供体菌：HfrHfr：strstrs sthrthr+leuleu+aziazis sT1T1s slaclac+galgal+受体菌受体菌：F F-strstrr rthrthr-leuleu-aziazir rT1T1r rlaclac-galgal-将将4 410108 8HfrHfr和和2 210107 7 F F-对数期细菌混合，对数期细菌混合，培养。培养。每隔一定时间取样，在组织捣碎机中搅每隔一定时间取样，在组织捣碎机中搅拌以分散接合着的拌以分散接合着的HfrHfr和和F F-细胞细胞稀释，接种到含稀释，接种到含链霉素链霉素的培养基中，筛的培养基中，筛选选thrthr+leuleu+strstrr r重组子，再对每一个重重组子，再对每一个重组子的非选择性标记组子的非选择性标记aziazi、T1T1、laclac、galgal进行测定进行测定供体菌：供体菌：Hfr：strsthr+leu+azisT1slac+gal+受体菌受体菌：F-：strrthr-leu-azirT1rlac-gal-混合混合8 8分钟取样，所得菌落的非选择性标分钟取样，所得菌落的非选择性标记全部和记全部和F F-相同，说明还没有任何相同，说明还没有任何HfrHfr基基因进入受体中，因进入受体中，9 9分钟开始出现分钟开始出现aziazis s敏感菌落，说明敏感菌落，说明aziazis s基因进入基因进入F F-细胞中细胞中1111分钟出现对分钟出现对T Ts s敏感的敏感的F F-菌落菌落1818分，出现分，出现laclac+2424分，出现分，出现galgal+T1r2.2.大肠杆菌环形基因图大肠杆菌环形基因图1 1）F F因子可整合到大肠杆菌不同位置，所以从因子可整合到大肠杆菌不同位置，所以从F F+可以得到各种可以得到各种HfrHfr，它们，它们DNADNA转移的方向和起点转移的方向和起点不同不同2 2）wollmanwollman和和JacobJacob对分离得到的多株对分离得到的多株HfrHfr菌进菌进行杂交中断实验，首次推断大肠杆菌染色体基行杂交中断实验，首次推断大肠杆菌染色体基因组是环形的因组是环形的3 3）其遗传图谱须用多株）其遗传图谱须用多株F F因子整合在不同位置的因子整合在不同位置的HfrHfr菌才能完成菌才能完成大肠杆菌基因组大肠杆菌基因组很大（很大（全部转移全部转移需要需要100分钟分钟），），一一 转导作用的发现转导作用的发现第三节、转导作用（第三节、转导作用（transduction）19511951莱德伯格和津德发现转导作用莱德伯格和津德发现转导作用转导作用转导作用：由噬菌体介导的遗传物质单方面转移：由噬菌体介导的遗传物质单方面转移的作用的作用以鼠伤寒沙门氏菌为材料以鼠伤寒沙门氏菌为材料:LT-2(met:LT-2(met-hishis-)和和LT-LT-22(phe22(phe-trptrp-tyrtyr-)培养数小时培养数小时,在在LT-22LT-22一端出现一端出现野生型。野生型。LT-22LT-22带有带有P22P22温和噬菌体温和噬菌体,可以自由通过滤板。可以自由通过滤板。LT-2(metLT-2(met-hishis-)LT-22(pheLT-22(phe-trptrp-tyrtyr-)P22P22温和噬菌体温和噬菌体鼠伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌LT-22野生型野生型 二二 转导转导噬菌体类型噬菌体类型(一一)烈性噬菌体烈性噬菌体1 烈性噬菌体烈性噬菌体 噬菌体遗传学研究中应用得最早而且广泛的是噬菌体遗传学研究中应用得最早而且广泛的是T系列噬菌体系列噬菌体 第三节、转导作用（第三节、转导作用（transduction）这里值得注意的是T一偶数噬菌体的DNA中不含有一般的胞嘧啶而含有5-羟甲基胞嘧啶)。2 一级生长实验和单菌释放实验 一级生长实验：将噬菌体和细菌以1：10混合以保证每一噬菌体都有感染细菌的机会。吸附几分钟后将感染的细菌稀释到抗噬菌体血清中以除去游离的噬菌体，接着又稀释到培养液中进行培养，在培养过程中取样测定噬菌斑数。从感染到噬菌斑数上升前的一段时间称为潜伏期，从图3.33可以看到T4的潜伏期是24min。在潜伏期的噬菌斑数就是感染有噬菌体的细菌数.噬菌斑的最大数值是这些被感染的细菌所释放的全部噬菌体数；后一数值除以潜伏期噬菌斑数就可以得到每一被感染的细菌所释放的噬菌体的平均数，即释放量 单菌释放实验混合敏感细菌和噬菌体，吸附5min后立即将菌液稀释到每毫升中只含有23个被感染细菌，并立即取少量(例如0.2m1)分装到一系列试管中，使每试管平均只含有0.4-0.6个被感染细菌。经30min培养后将每一样品混合大量敏感细菌涂在培养基上。经培养以后可以看到大部分培养皿上没有噬菌斑，少数培养皿上出现个别的噬菌斑，这些是游离噬菌体所形成的噬菌斑；另外少数培养皿上出现几十甚或1000以上的噬菌斑，大部分是单个细菌所释放的噬菌斑。噬菌体T1的单菌释放量多数是100200。3 基因重组和连锁噬菌体的基因重组在噬菌体的基因重组在20世纪世纪40年代中首先年代中首先在大肠杆菌噬菌体在大肠杆菌噬菌体T2中发现。中发现。为了检测噬菌体中的基因重组，首先必须为了检测噬菌体中的基因重组，首先必须要有突变型。要有突变型。在噬菌体中最先发现的突变型有快速溶菌在噬菌体中最先发现的突变型有快速溶菌(rapidlysis，r)、寄主范围、寄主范围(host range,h)和小形噬菌斑和小形噬菌斑(minute plaque，m)等。等。突变型的噬菌斑突变型的噬菌斑r突变型的噬菌斑比野生型的噬菌斑大而且突变型的噬菌斑比野生型的噬菌斑大而且边缘清晰，边缘清晰，m突变型的噬菌斑比野生型的噬菌斑较小而突变型的噬菌斑比野生型的噬菌斑较小而边缘模糊，边缘模糊，h突变型能在抗野生型噬菌体的细菌上形成突变型能在抗野生型噬菌体的细菌上形成噬菌斑。噬菌斑。h突变型和野生型突变型和野生型h+可以用混合指示可以用混合指示菌方法鉴别菌方法鉴别h+只能裂解品系只能裂解品系B的野生型大肠杆菌，的野生型大肠杆菌，h能能裂解野生型细菌及抗裂解野生型细菌及抗T2细菌细菌(用用B/2表示表示)。把把h和和h+噬菌体和大量的野生型细菌和抗噬菌体和大量的野生型细菌和抗T2细菌混合接种。经过培养以后就可以看到细菌混合接种。经过培养以后就可以看到两种噬菌斑，两种噬菌斑，透明的一种是透明的一种是h突变型的噬菌突变型的噬菌斑，半透明的一种是野生型斑，半透明的一种是野生型(h+)的噬菌斑的噬菌斑(图图3.34)。寄主范围突变型寄主范围突变型h(hr+)和快速溶菌突变型和快速溶菌突变型r(h+r)噬菌体对寄主细菌噬菌体对寄主细菌B进行混合感染进行混合感染把释放出来的噬菌体接种在混合指示菌上。把释放出来的噬菌体接种在混合指示菌上。结果可以看到培养皿上出现的噬菌斑是结果可以看到培养皿上出现的噬菌斑是4种，种，小而透明的小而透明的(hr+)、大而半透明的、大而半透明的(h+r)、小小而半透明的而半透明的(h+r+)以及大而透明的以及大而透明的(hr)。前两种是亲本组合，后两种是重组类型前两种是亲本组合，后两种是重组类型大肠杆菌噬菌体大肠杆菌噬菌体T4的一个三点测交的一个三点测交(二二)温和噬菌体温和噬菌体 1 1 裂解反应和溶源化反应裂解反应和溶源化反应 溶源性细菌失去了它的原噬菌体后就成为非溶源性细菌。溶源性细菌失去了它的原噬菌体后就成为非溶源性细菌。非溶源性细菌接触温和噬菌体时可以发生裂解反应或溶源非溶源性细菌接触温和噬菌体时可以发生裂解反应或溶源化反应。化反应。1)溶源性细菌和非溶源性细菌相区别溶源性细菌和非溶源性细菌相区别溶源性细菌经紫外线、丝裂霉素溶源性细菌经紫外线、丝裂霉素C等处理后会大量地释放等处理后会大量地释放噬菌体。噬菌体。溶源性细菌也会自发地释放噬菌体。但是一般大约溶源性细菌也会自发地释放噬菌体。但是一般大约102103细菌中才有一个进行自发释放，而经处理后释放噬菌细菌中才有一个进行自发释放，而经处理后释放噬菌体的细菌可多达体的细菌可多达90。对于同一种噬菌体所表现的免疫性，即不能再为同一种噬对于同一种噬菌体所表现的免疫性，即不能再为同一种噬菌体所裂解或溶源化。菌体所裂解或溶源化。抗性细菌不带有噬菌体并且对抗性细菌不带有噬菌体并且对噬菌体不敏感，噬菌体不敏感，敏感细胞不带有噬菌体同时对敏感细胞不带有噬菌体同时对于噬菌体是敏感的，于噬菌体是敏感的，溶源性细菌本身带有噬菌体而溶源性细菌本身带有噬菌体而对于外来的噬菌体则不敏感。对于外来的噬菌体则不敏感。此外溶源性菌株能自发释放少此外溶源性菌株能自发释放少量噬菌体，所以接触敏感细菌量噬菌体，所以接触敏感细菌时出现局部溶菌现象。时出现局部溶菌现象。在涂满敏感细菌的培养皿在涂满敏感细菌的培养皿上接种少量溶源性细菌并上接种少量溶源性细菌并经培养以后，可以看到出经培养以后，可以看到出现了中央长有细菌的噬菌现了中央长有细菌的噬菌斑。斑。这种噬菌斑是由繁殖到达这种噬菌斑是由繁殖到达一定数量后的少数溶源性一定数量后的少数溶源性细菌所自发释放的噬菌体细菌所自发释放的噬菌体感染敏感细菌后形成的感染敏感细菌后形成的。2 2 温和噬菌体和寄主细菌在生理上的关系温和噬菌体和寄主细菌在生理上的关系用某一菌株的细菌所释放的用某一菌株的细菌所释放的去感染同一菌株的细菌时出斑率是去感染同一菌株的细菌时出斑率是1；不论从哪一菌株的细菌释放的不论从哪一菌株的细菌释放的去感染细菌去感染细菌C时出斑率都是时出斑率都是1；用它们感染用它们感染K12r或或Br时出斑率也是时出斑率也是l；但是凡是用从一株大肠杆菌所释放的但是凡是用从一株大肠杆菌所释放的去感染另一株大肠杆菌时，出斑都去感染另一株大肠杆菌时，出斑都是是10-4或更低；或更低；用用K12(P1)细菌所释放的细菌所释放的去感染去感染K12细菌时出斑率是细菌时出斑率是1；而用而用K12细菌所释放的细菌所释放的去感染去感染K12(PI)时出斑率只有时出斑率只有210-5。一种细菌为从另一种细菌所释放的所感染时出斑率的下降便是限制酶作用的结果。用来自同一种细菌的感染时出斑率是1，这是因为这些噬菌体的DNA都经过这种细菌的修饰酶的作用而变为不再能为它自身的限制酶所分解。外源DNA进入一个细菌细胞时或是被修饰而免于分解，或是在没有被修饰以前便被分解了。凡是能免于分解而成为成熟的噬菌体的DNA都已被修饰。这些噬菌体感染同一种细菌时它的DNA便不被分解。可是它去感染别种细菌时出斑大为下降，说明每一种细菌有它特有的限制修饰系统，为一种细菌所修饰的DNA只能避免被这种菌的限制酶所分解，可是不能避免为另一种细菌的限制酶所分解。限制缺陷型r的出斑率是1，进一步说明出斑率的下降是限制酶作用的结果。K(P1)对于K12细菌的出斑率1，说明K(P1)已经为K12(P1)细菌的修饰酶所修饰。这种限制修饰系统就是温和噬菌体P1为寄主细菌所带来的特性。K对于K12(P1)的出斑率是410-5，说明K12(P1)细胞中有与K12细菌不同的限制修饰系统。1 1、普遍性转导噬菌体、普遍性转导噬菌体 1 1）许多温和噬菌体和某些烈性噬菌体感染供体菌后，）许多温和噬菌体和某些烈性噬菌体感染供体菌后，在裂解过程中错误包装产生的在裂解过程中错误包装产生的.2 2）噬菌体包裹的主要为供体）噬菌体包裹的主要为供体DNADNA 3 3）以鼠伤寒沙门氏菌）以鼠伤寒沙门氏菌P22P22和大肠杆菌和大肠杆菌P1P1为代表为代表二、转导噬菌体的类型二、转导噬菌体的类型Potentially any donor gene can be transferred供体菌供体菌受体菌受体菌recipient celltransducing particlegeneral recombinationtransductantrecipient chromosome2 2、局限性转导噬菌体、局限性转导噬菌体1 1）温和噬菌体感）温和噬菌体感染供体菌后先经染供体菌后先经过溶源反应整合，过溶源反应整合，再经诱导产生的再经诱导产生的2 2）大肠杆菌温和大肠杆菌温和噬菌体噬菌体和和80803 3）携带很少供体）携带很少供体DNADNAprophage(integrated bacterial virus)improper excisiondonor cell(lysogen)transducingparticlesviralreplicationchromosome三、三、细菌转导的过程细菌转导的过程1 1局限性转导（局限性转导（specialized transductionspecialized transduction）1 1）定义：以噬菌体为媒介，只能使供体的）定义：以噬菌体为媒介，只能使供体的一个或少数几个一个或少数几个基因基因转移到受体的转导作用称局限性转导。例如：大肠杆菌转移到受体的转导作用称局限性转导。例如：大肠杆菌温和噬菌体温和噬菌体只能转导大肠杆菌的只能转导大肠杆菌的galgal和和biobio基因基因E.coli噬菌体噬菌体galbiogalbiogalbiogalbiogalbiobiogalattattp pattattb b2）Campbell 1962Campbell 1962年提出转导模型年提出转导模型温和噬菌体温和噬菌体是局限性转导的典型代表，该噬菌体含有一个线状的双链是局限性转导的典型代表，该噬菌体含有一个线状的双链DNADNA分子，其二端为互补的分子，其二端为互补的1212个核苷酸单链个核苷酸单链(即粘性末端即粘性末端coscos位点位点)，当，当感感染细胞时通过其粘性末端形成环状分子。染细胞时通过其粘性末端形成环状分子。环化的环化的DNADNA分子以其附着位点分子以其附着位点attpattp和染色体同源部分和染色体同源部分attbattb位点配对交换位点配对交换,整合到到寄主染色体上整合到到寄主染色体上,位于位于galgal和和biobio基因之间基因之间与寄主同步复制与寄主同步复制-原噬菌体原噬菌体E.coli噬菌体噬菌体galbiogalbiogalbiogalbiogalbiobiogalattattp pattattb bDNA分子脱离寄主染色体分子脱离寄主染色体 经过经过UVUV诱导诱导,脱离寄脱离寄主主,脱离方式有三种脱离方式有三种:正常脱离、向左偏离、正常脱离、向左偏离、向右偏离向右偏离整合噬菌体整合噬菌体发生错误发生错误脱离几率一般仅有脱离几率一般仅有1010-6-6得到转得到转导导噬菌体的频也噬菌体的频也仅有仅有1010-6-6-因为因为失去部分自身基失去部分自身基因因intint和和xisxis与整和相关与整和相关基因基因,因此多不能自我因此多不能自我复制复制,只能依靠错误脱只能依靠错误脱离产生的离产生的1010-6-6个个,故为故为属属于低频转导于低频转导.3）低频转导类型低频转导类型稳定转导：稳定转导：dgdg携带的携带的galgal基因与受体突基因与受体突变的变的galgal发生交换发生交换，galgal与与寄主一起复制，寄主一起复制，为稳定遗传为稳定遗传;几率占全部转导子几率占全部转导子/;dgdg入侵入侵galgal-细胞还有一种转导途径细胞还有一种转导途径,还能还能够整和到受体染色体够整和到受体染色体 DNADNA上上,但是通常不稳但是通常不稳定定,随着随着脱离受体又形成脱离受体又形成galgal-细胞细胞.温和噬菌体温和噬菌体进行局限性转导进行局限性转导不稳定转导：不稳定转导：dgdg携带的携带的galgal基因与受体基因与受体染色体不发生染色体不发生交换交换。以以附加体形附加体形式游离于式游离于受体细胞中。受体细胞中。受体细胞成为含正常受体细胞成为含正常galgal基因与突变的基因与突变的galgal基因的基因的杂基因子杂基因子。杂基因子中个别细胞的正常杂基因子中个别细胞的正常galgal会丢失，会丢失，所以所以转导不稳定。转导不稳定。4)高频转导高频转导：局限性转导存在的另外一局限性转导存在的另外一种转导方式种转导方式:dg和和同时感染寄主同时感染寄主(gal-)，首先整合到受首先整合到受体染色体上，体染色体上，dg通过单通过单交换整和交换