扫描电子显微镜(制样).ppt

扫描电子显微镜扫描电子显微镜 （Scanning Electron Microscopy SEM）材化0801 孟岩 李民 王洪志 张俊扫描电子显微镜扫描电子显微镜 （Scanning Electron Microscopy SEMScanning Electron Microscopy SEM）19421942年年 第一台扫描电子显微镜第一台扫描电子显微镜 6060年代年代 分辨率和图像质量的大大的改善分辨率和图像质量的大大的改善 8080年代年代 广泛应用于医学、生物学等领域广泛应用于医学、生物学等领域 9090年代年代 高分辨型扫描电镜的分辨率高分辨型扫描电镜的分辨率0.2nm0.2nm 扫描电镜与透射电镜结构比较扫描电镜与透射电镜结构比较 1 1 照明系统结构和原理基本相同照明系统结构和原理基本相同 都是由电子枪和聚光镜等来完成照明工作都是由电子枪和聚光镜等来完成照明工作 2 SEM 2 SEM 没有中间镜和投影镜，但增加了没有中间镜和投影镜，但增加了 二次电子探测器二次电子探测器、扫描偏转线圈扫描偏转线圈、显像管等显像管等 3 SEM 3 SEM 样品室比样品室比 TEM TEM 大，位置不同大，位置不同 4 SEM 4 SEM 与与 TEM TEM 真空系统、水冷系统和电源系统真空系统、水冷系统和电源系统 的结构和功能基本相似的结构和功能基本相似。如细菌、血细胞、培养细胞的整体形态、大如细菌、血细胞、培养细胞的整体形态、大 小、表面突起和细胞间的相互关系小、表面突起和细胞间的相互关系 消化道、血管等空腔组织的表面结构消化道、血管等空腔组织的表面结构 骨等硬组织形貌以及生物材料的形状结构等骨等硬组织形貌以及生物材料的形状结构等 景深长，视野广、图像富有立体感景深长，视野广、图像富有立体感 用于观察组织细胞的表面和断面的形貌用于观察组织细胞的表面和断面的形貌 扫描电镜特点扫描电镜特点 1 1、电子光学系统（镜筒）电子光学系统（镜筒）2 2、信号检测及显示系统信号检测及显示系统 3 3、电源和真空系统电源和真空系统 一、扫描电镜的基本结构一、扫描电镜的基本结构 第一节第一节 扫描电镜的结构和工作原理扫描电镜的结构和工作原理镜中图像 电子枪和透镜：电子枪和透镜：电子枪产生电子经透镜会聚成电子束（探针）电子枪产生电子经透镜会聚成电子束（探针）投射在样品表面投射在样品表面(约约10nm)10nm)扫描线圈扫描线圈:（偏转线圈）（偏转线圈）（偏转线圈）（偏转线圈）位于透镜和物镜之间，有两组扫描线圈（在显位于透镜和物镜之间，有两组扫描线圈（在显 像管也有两组）作用是控制电子束在像管也有两组）作用是控制电子束在X X、Y Y两个方向两个方向规律的运动规律的运动 样品室样品室:样品室较大，位于物镜的下方，室内有样品台、样品室较大，位于物镜的下方，室内有样品台、二次电子检测器、抽气管道和更换样品的窗口二次电子检测器、抽气管道和更换样品的窗口 （一）电子光学系统（镜筒）（一）电子光学系统（镜筒）二次电子探测器：二次电子探测器：由收集器、闪烁体、光导管和光电倍增管成由收集器、闪烁体、光导管和光电倍增管成 二次电子探器是扫描电镜的眼睛，其作用是二次电子探器是扫描电镜的眼睛，其作用是收集扫描样品发生的二次电子信号并将它变成显像收集扫描样品发生的二次电子信号并将它变成显像管的图像信号管的图像信号 显示系统：显示系统：显像管及电路组成，将电信号处理成最终影像显像管及电路组成，将电信号处理成最终影像(二二)信号检测及显示系统信号检测及显示系统 （三）电源和真空系统（三）电源和真空系统 电子枪发射电子，经透镜聚焦形成很细电子枪发射电子，经透镜聚焦形成很细 的电子束班（约的电子束班（约10nm10nm）称电子探针）称电子探针 电子探针打在样品表面，把样品表面原电子探针打在样品表面，把样品表面原 子外层的电子打落形成子外层的电子打落形成 二次电子二次电子 （二次电子的产生率主要与样品表面材料的性质及入二次电子的产生率主要与样品表面材料的性质及入二次电子的产生率主要与样品表面材料的性质及入二次电子的产生率主要与样品表面材料的性质及入射角的角度有关，入射角越大，二次电子的发射就越射角的角度有关，入射角越大，二次电子的发射就越射角的角度有关，入射角越大，二次电子的发射就越射角的角度有关，入射角越大，二次电子的发射就越多）多）多）多）二、扫描电镜的工作成像原理二、扫描电镜的工作成像原理 二次电子信息被收集转换和放大，变成二次电子信息被收集转换和放大，变成可供观察和拍摄的影像可供观察和拍摄的影像 由于二次电子产生的多少与电子束入射由于二次电子产生的多少与电子束入射角度及样品表面的起伏有关，所以在荧光屏角度及样品表面的起伏有关，所以在荧光屏上会得到样品表面形貌的立体图像上会得到样品表面形貌的立体图像 生物样品分为二大类生物样品分为二大类:含水组织含水组织 含水量少的组织含水量少的组织 第二节第二节 扫描电子显微镜样品制备技术扫描电子显微镜样品制备技术样品台 此类样品一般含有硅质、钙质、角质等成分此类样品一般含有硅质、钙质、角质等成分 表面不易变形和收缩表面不易变形和收缩(如毛发、牙齿等如毛发、牙齿等)这类标本处理较简单，只需表面清洁，就可这类标本处理较简单，只需表面清洁，就可 直接喷镀金属膜进行电镜观察直接喷镀金属膜进行电镜观察1 1、含水量少的硬组织、含水量少的硬组织 这类组织在生物样品中占多数这类组织在生物样品中占多数 大多数生物组织的含水量都在大多数生物组织的含水量都在80%80%以上以上 必须对样品进行特殊处理：必须对样品进行特殊处理：经经固定固定、脱水脱水、干燥干燥、镀膜导电等过程、镀膜导电等过程 2 2、另一类是含水量较高的组织、另一类是含水量较高的组织 样品制备过程中必须注意的三个关键技术样品制备过程中必须注意的三个关键技术：1 1、生物样品观察面的暴露、生物样品观察面的暴露 尽可能暴露出所观察组织的原貌尽可能暴露出所观察组织的原貌 2 2、生物样品的干燥、生物样品的干燥 在脱去组织中水分的同时又不引起形态的变形在脱去组织中水分的同时又不引起形态的变形 3 3、生物样品的导电、生物样品的导电 使样品具有导电性并能得到清晰的二次电子像使样品具有导电性并能得到清晰的二次电子像更多内容欢迎莅临天马行空官方博客：http:/ 取取 材材 充分暴露并保护好观察面充分暴露并保护好观察面 （10mm10mm2 25mm5mm）清清 洗洗 用生理盐水仔细漂洗观察面用生理盐水仔细漂洗观察面 固固 定定 2%2%戊二醛和戊二醛和1%1%锇酸固定锇酸固定 脱脱 水水 丙酮脱水，醋酸异戊酯置换丙酮脱水，醋酸异戊酯置换 干干 燥燥 临界点干燥临界点干燥 镀镀 膜膜 离子溅射镀膜或真空镀膜离子溅射镀膜或真空镀膜 SEMSEMSEMSEM观察观察观察观察常常规规样样品品制制备备程程序序 取材的基本要求和取材的基本要求和TEMTEM样品制备相同样品制备相同 样品可大一些（样品可大一些（8 810mm10mm2 2，高度可达，高度可达5mm5mm）扫描观察的部位常常是标本的表面扫描观察的部位常常是标本的表面 如气管表面、胃、肠粘膜表面等如气管表面、胃、肠粘膜表面等 要把观察的结构暴露出来要把观察的结构暴露出来 对易卷曲的样品可固定在滤纸上对易卷曲的样品可固定在滤纸上 以充分暴露待观察的组织表面以充分暴露待观察的组织表面 （一）取材（一）取材 扫描电镜对样品表面的清洁要求十分严格扫描电镜对样品表面的清洁要求十分严格 表面血液、粘液等必须清洗干净表面血液、粘液等必须清洗干净 可采用以下方法：可采用以下方法：1.1.等渗等渗生理盐水生理盐水或缓冲液仔细地漂洗或缓冲液仔细地漂洗 或用针筒反复冲洗或用针筒反复冲洗 2.2.对粘液物质过分粘稠，难以去除的标本对粘液物质过分粘稠，难以去除的标本 可采用可采用酶消化酶消化方法进行处理方法进行处理 3.3.用用5%5%的的苏打水苏打水清洗清洗 （二）清洗（二）清洗 清洗后应立即固定清洗后应立即固定 由于样品体积较大，固定时间应适当延长由于样品体积较大，固定时间应适当延长 逐级增高浓度的丙酮或乙醇脱水逐级增高浓度的丙酮或乙醇脱水 然后进入中间液然后进入中间液（醋酸异戊酯：与（醋酸异戊酯：与（醋酸异戊酯：与（醋酸异戊酯：与COCOCOCO2 2 2 2互溶性很好）互溶性很好）互溶性很好）互溶性很好）置换置换 （三）固定（三）固定 （四）脱水（四）脱水 样品经脱水后，仍被脱水剂占有样品经脱水后，仍被脱水剂占有 必须除去脱水剂，使其真正干燥必须除去脱水剂，使其真正干燥 干燥会引起样品体积变化和表面改变，干燥会引起样品体积变化和表面改变，要保存生物样品表面的微细结构又要使生要保存生物样品表面的微细结构又要使生物样品达到干燥的目的就要避免表面张力物样品达到干燥的目的就要避免表面张力的影响的影响 现有的方法：现有的方法：1 1、临界点干燥法临界点干燥法 2 2、冷冻干燥法冷冻干燥法 3 3、空气干燥法等空气干燥法等 。（五）干燥（五）干燥 目的是避免表面张力的影响，较好地保存目的是避免表面张力的影响，较好地保存 样品的微细结构样品的微细结构 利用物质在临界状态时表面张力等于零利用物质在临界状态时表面张力等于零 的特性，使样品的液体完全气化并以气体的特性，使样品的液体完全气化并以气体 方式排掉，来达到标本干燥的目的方式排掉，来达到标本干燥的目的 1.1.临界点干燥法临界点干燥法 物质有固体、液态和气态三种状态物质有固体、液态和气态三种状态 通常以单相状态存在，温度和压力改变时互通常以单相状态存在，温度和压力改变时互相转化相转化 每一种物质都有所谓每一种物质都有所谓“临界状态临界状态”（即临界即临界即临界即临界温温温温 度度度度，此时，液体的表面张力系数为零），此时，液体的表面张力系数为零），此时，液体的表面张力系数为零），此时，液体的表面张力系数为零），物质不能以物质不能以 液态继续存而要变成气体，这时的气体无论在液态继续存而要变成气体，这时的气体无论在 多大的压强下都不会变成液体多大的压强下都不会变成液体 利用液体利用液体COCO2 2（临界状态（临界状态31 31）置换醋酸异戊酯）置换醋酸异戊酯 原理：原理：生物样品经过脱水、干燥处理后，其表面不生物样品经过脱水、干燥处理后，其表面不带电，导电性能也差，当入射电子束打到标本上带电，导电性能也差，当入射电子束打到标本上时，就会产生电荷的积累，形成充电和放电效应，时，就会产生电荷的积累，形成充电和放电效应，影响周围电子束的扫描和二次电子的发射，严重影响周围电子束的扫描和二次电子的发射，严重影响成像甚至无法成像影响成像甚至无法成像 因此，必须给标本喷镀一层薄薄的导电金属，因此，必须给标本喷镀一层薄薄的导电金属，使样品具有导电性，增加二次电子发射量，提高使样品具有导电性，增加二次电子发射量，提高样品的亮度和反差。样品的亮度和反差。方法有：方法有：1.1.离子溅射法离子溅射法 2.2.金属喷镀法金属喷镀法等等 （六）镀膜（六）镀膜 将需要喷镀的金属制成阴极靶，样品放在阳极上将需要喷镀的金属制成阴极靶，样品放在阳极上 容器内抽真空并通入一些惰性气体如氮、氖等容器内抽真空并通入一些惰性气体如氮、氖等 两极间加电场后产生辉光放电两极间加电场后产生辉光放电 气体电离产生的阳离子轰击阴极金属靶气体电离产生的阳离子轰击阴极金属靶 使金属原子溅射出来在电场的加速下飞向样品使金属原子溅射出来在电场的加速下飞向样品 1.1.离子溅射法离子溅射法 (Ion sputter)(Ion sputter)阴极阴极阳极阳极样品样品气体气体 两极间加电场两极间加电场 后，产生辉光后，产生辉光 放电放电 气体电离产生气体电离产生 阳离子轰击阴阳离子轰击阴 极金属靶极金属靶 金属原子溅射金属原子溅射 出来飞向样品出来飞向样品 在真空条件下把所要喷镀的金属加热在真空条件下把所要喷镀的金属加热 使其在真空下蒸发并喷射到标本表面使其在真空下蒸发并喷射到标本表面 在样品表面形成一层金属膜使样品导电在样品表面形成一层金属膜使样品导电 常用常用:金、铂、钯等金、铂、钯等2 2、金属喷镀法、金属喷镀法制作人:孟岩，李民，王洪志，张俊