DNA琼脂糖凝胶电泳.ppt
DNADNA琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳实实 验验 二二学时：学时：3 31 1、掌握琼脂糖凝胶电泳分离核酸的、掌握琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理和方法。原理和方法。2 2、学习核酸染色的方法。、学习核酸染色的方法。一、实验一、实验目的目的：（一）电泳技术：（一）电泳技术：1 1、电电泳泳定定义义：是是指指带带电电粒粒子子在在电电场场中中向向与与其其自自身身所带电荷相反的电极方向移动的现象。所带电荷相反的电极方向移动的现象。根根据据电电泳泳支支持持介介质质的的不不同同，可可分分为为滤滤纸纸，醋醋酸酸纤纤维维薄薄膜膜，淀淀粉粉、琼琼脂脂糖糖、聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳等等。电电泳泳技技术术的的应应用用非非常常广广泛泛，从从分分离离小小分分子子如如氨氨基基酸酸、肽肽、激激素素、核核苷苷酸酸到到复复杂杂的的大大分分子子如如蛋蛋白白质质、核核酸酸甚甚至至病病毒毒颗颗粒粒的的分分离离鉴鉴定定都都依依赖赖于于电泳技术。电泳技术。二、实验原理二、实验原理:（1 1）带电颗粒的大小和形状：）带电颗粒的大小和形状：颗粒越大，电泳速度颗粒越大，电泳速度越慢，反之越快；越慢，反之越快；（2 2）颗粒的电荷数：）颗粒的电荷数：电荷越少，电泳速度越慢，反电荷越少，电泳速度越慢，反之越快；之越快；（3 3）溶液的粘度：溶液的粘度：粘度越大，电泳速度越慢，反之粘度越大，电泳速度越慢，反之越快；越快；（4 4）溶液的）溶液的pHpH值：值：影响被分离物质的解离度，离等影响被分离物质的解离度，离等电点越近，电泳速度越慢，反之越快；电点越近，电泳速度越慢，反之越快；2 2、影响电泳的主要因素：影响电泳的主要因素：（5 5）电场强度：）电场强度：电场强度越小，电泳速度越慢，反电场强度越小，电泳速度越慢，反之越快；之越快；（6 6）离子强度：）离子强度：离子强度越大，电泳速度越慢，反离子强度越大，电泳速度越慢，反之越快；之越快；（7 7）电渗现象：）电渗现象：电场中，液体相对于固体支持物的电场中，液体相对于固体支持物的相对移动；相对移动；（8 8）支持物筛孔大小：）支持物筛孔大小：孔径小，电泳速度慢，反之孔径小，电泳速度慢，反之则快。则快。l琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶电泳是用电泳是用琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶作为支持介质的一种电作为支持介质的一种电泳分离方法，是一种简便、快速分离鉴定核酸的方法，已泳分离方法，是一种简便、快速分离鉴定核酸的方法，已成为分子生物学及基因工程研究中常用实验方法之一。成为分子生物学及基因工程研究中常用实验方法之一。l琼脂糖琼脂糖英文名英文名agarose，是从是从琼脂琼脂中提取出来的，由中提取出来的，由半半乳糖乳糖和和3.6-3.6-脱水脱水-半乳糖半乳糖相互结合的相互结合的链状多糖链状多糖。琼脂糖和琼脂糖和琼脂琼脂都可在不同浓度的水溶液下可形成都可在不同浓度的水溶液下可形成多孔的凝胶多孔的凝胶，电泳，电泳中具有中具有分子筛效应分子筛效应。（二）琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理：（二）琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理：lDNADNA分子分子在在pH高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动（中向正极移动（电荷效应电荷效应）。lDNA分子泳动速率的大小除与分子泳动速率的大小除与DNA分子的带电量有关分子的带电量有关外，还与外，还与DNA分子的大小和空间构象有关（琼脂糖凝胶分子的大小和空间构象有关（琼脂糖凝胶的的分子筛效应分子筛效应）。）。l电泳时，用电泳时，用溴酚蓝溴酚蓝做前沿指示剂，指示做前沿指示剂，指示DNA样品在凝样品在凝胶中的确切位置。胶中的确切位置。l溴乙啶溴乙啶是一种荧光染料，可插入是一种荧光染料，可插入DNA双螺旋结构的两双螺旋结构的两个碱基对之间，与个碱基对之间，与DNA分子形成络合物，在紫外光的激分子形成络合物，在紫外光的激发下发出橙黄色的荧光。这次实验使用发下发出橙黄色的荧光。这次实验使用溴乙啶替代品溴乙啶替代品（DNAgreen）DNAgreen核酸染料vDNAgreen是一种花箐类染料，具有安全、灵敏作为各种核酸电泳的染色剂。vDNAgreen最大吸收峰在510nm左右，另外在254-380nm还有一个吸收峰，与核酸结合后发射绿色荧光，因此在紫外凝胶透射仪上可以检测出DNA样品。v作为EB的一种替代品。（1）核酸大小与琼脂糖凝胶电泳分离的关系核酸大小与琼脂糖凝胶电泳分离的关系凝胶中，凝胶中，DNA片段迁移率与片段迁移率与DNA分子大小成反比分子大小成反比(20kb)，因此因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。可测出未知片段的大小。（2）核酸构象与琼脂糖凝胶电泳分离的关系核酸构象与琼脂糖凝胶电泳分离的关系不同构型不同构型DNA的移动速度次序为：闭环的移动速度次序为：闭环DNA直线直线DNA开环的双链开环的双链环状环状DNA(当琼脂糖浓度太高时，环状当琼脂糖浓度太高时，环状DNA不能进入胶中不能进入胶中)。（3）不同大小的不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。分离。琼脂糖浓度琼脂糖浓度/%/%0.30.60.70.91.21.52.0线状线状DNADNA大小大小/kb/kb60-520-110-0.87-0.56-0.43-0.22-0.1注：注：DNADNA片段在片段在5-500bp5-500bp之间时，一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳之间时，一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGEPAGE）进行电泳分离。进行电泳分离。（三）琼脂糖凝胶电泳分离核酸的影响因素（三）琼脂糖凝胶电泳分离核酸的影响因素（1 1）操作简单、制备容易快速、凝胶机械性能好、电泳速度）操作简单、制备容易快速、凝胶机械性能好、电泳速度快、分离快、分离DNADNA片段范围广、样品不需事先处理就可以进行电泳。片段范围广、样品不需事先处理就可以进行电泳。（2 2）凝胶结构均匀，对样品吸附小，电泳图谱清晰，分辨率）凝胶结构均匀，对样品吸附小，电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。高，重复性好。（3 3）琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外）琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光检测及定量测定。光检测及定量测定。（4 4）电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制）电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。成干膜可长期保存。因此，因此，琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶电泳已成为分子生物学及基因工程研究电泳已成为分子生物学及基因工程研究中常用实验方法之一，中常用实验方法之一，DNADNA样本的分离、纯化、鉴定以及相对样本的分离、纯化、鉴定以及相对分子质量测定常用琼脂糖凝胶电泳。分子质量测定常用琼脂糖凝胶电泳。（四）（四）琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶电泳具有以下优点：电泳具有以下优点：DNAMarker荧光染料荧光染料EB染色染色后，在紫外灯后，在紫外灯(305nm)下观下观察到的电泳结果：察到的电泳结果：1 1、实验材料：、实验材料：提取的小麦苗中的提取的小麦苗中的DNADNA2 2、仪器：仪器：(1)(1)稳压稳流电泳仪稳压稳流电泳仪 (2)(2)可调微量移液器可调微量移液器 (3)(3)水平电泳槽水平电泳槽 （4 4）暗箱紫外透射仪等。）暗箱紫外透射仪等。3 3、试剂：、试剂：（1 1）电泳缓冲液：）电泳缓冲液：TrisTris-硼酸EDTAEDTA（50TBE50TBE）pH8.3pH8.3。（2 2）加加样样缓缓冲冲液液：0.25%0.25%溴溴酚酚蓝蓝（BPBBPB），40%40%蔗蔗糖糖，DNAgreenDNAgreen。(4)(4)琼脂糖凝胶：琼脂糖凝胶：浓度为浓度为0.7%0.7%。三、实验材料、仪器和试剂三、实验材料、仪器和试剂：1 1、凝胶板的制备：、凝胶板的制备：（1 1）取取琼琼脂脂糖糖0.7 0.7 g g，加加1 1TBETBE缓缓冲冲溶溶液液100ml100ml，于于沸沸水水浴浴中中至至熔熔化化，制制成成0.7%0.7%的琼脂糖胶液。的琼脂糖胶液。（2 2）胶胶床床两两头头贴贴上上防防水水胶胶带带，形形成成8mm8mm高高的的挡挡墙墙，压压紧紧胶胶带带，置置水水平平台台面面上。上。（3 3）插入梳子，梳齿下端离板底插入梳子，梳齿下端离板底0.50.51mm1mm。（4 4）当当琼琼脂脂糖糖胶胶液液温温度度降降到到6060的的时时候候,将将6060凝凝胶胶不不间间断断倒倒入入胶胶床床，高高3 34mm4mm，避免产生气泡，室温下凝固。，避免产生气泡，室温下凝固。（5 5）完完全全凝凝固固后后，撕撕掉掉胶胶带带，置置于于电电泳泳槽槽中中，加加入入电电泳泳缓缓冲冲液液，高高于于胶胶面面1 12mm2mm，从一头轻轻斜拉从一头轻轻斜拉 梳子，除去产生的气泡。梳子，除去产生的气泡。四、实验步骤：四、实验步骤：3 3、加样：、加样：将将样样品品DNADNA溶溶液液与与加加样样缓缓冲冲液液以以5 5：1 1的的体体积积比比混混合合，用用微微量量进进样样器器加加样样，每每加加完完一一个个样样品品，冲冲洗洗三三次次。加加样样量量151520 20 l l（加加样样时时应应防防止止碰碰坏坏样样品品孔孔周周围围的的凝凝胶胶面面以以及及穿穿透透凝凝胶底部）。胶底部）。4 4、电泳：电泳：为为了了获获得得电电泳泳分分离离DNADNA片片段段的的最最大大分分辨辨率率，电电场场强强度度不不应应高高于于5V/cm5V/cm（两两电电极极间间的的距距离离）开开始始时时用用较较高高电电压压(80V)(80V)，样样品品一一进进入入胶胶内内则则将将电电压压调调至至5V/cm 5V/cm。当当染染料料前前沿沿移移至至底底边边1-2mm1-2mm时，电泳毕。时，电泳毕。5 5、染色、观察、显微照相与记录、染色、观察、显微照相与记录：关关闭闭电电源源，取取出出胶胶床床，浸浸入入0.5g/mL0.5g/mL的的EBEB溶溶液液中中，30min30min后后取取出出。在在紫紫外外检检测测仪仪下下观观察察凝凝胶胶中中的的DNADNA（红红橙橙色色荧荧光），并进行显微照相。最后要求绘制光），并进行显微照相。最后要求绘制DNADNA电泳图谱。电泳图谱。五、思考题：五、思考题：影响电泳的主要因素影响电泳的主要因素?*荧光染料荧光染料EBEB染色的原理和优点是什么？染色的原理和优点是什么？1 1、原理：、原理：EBEB：即即3,8-3,8-二二氨氨基基-5-5-乙乙基基-6-6-苯苯基基菲菲锭锭溴溴盐盐(Ethidium(Ethidium Bromide)Bromide)。EBEB是是一一种种扁扁平平分分子子，它它可可以以嵌嵌入入核核酸酸相相邻邻的的碱碱基基之之间间，在在紫紫外外线线激激发发下下，发发出出红红橙橙色色荧光。它与荧光。它与DNADNA的结合几乎没有碱基序列特异性。的结合几乎没有碱基序列特异性。溴化乙锭嵌入碱基分子中，导致溴化乙锭嵌入碱基分子中，导致DNA在复制过程中错配在复制过程中错配。所所以以溴溴化化乙乙锭锭是是一一种种强强诱诱变变剂剂，具具有有高高致致癌癌性性。在在实实验验过过程程一定要带上手套！一定要带上手套！2 2、优点：、优点：（1 1）染色比较简便、快捷，一般在）染色比较简便、快捷，一般在101015min15min就可反应。就可反应。（2 2）EBEB对核酸分子无破坏作用，这是其它染料所不能做对核酸分子无破坏作用，这是其它染料所不能做 到的。到的。（3 3）EBEB灵敏度高，可检测出灵敏度高，可检测出10ng10ng或更少的或更少的DNADNA含量。含量。（4 4）既可用于）既可用于DNADNA也可用于也可用于RNARNA的检测。的检测。（5 5）EBEB可加到样品中，也可加到凝胶中，可随时用紫外可加到样品中，也可加到凝胶中，可随时用紫外 灯检测电泳的进程和效果。灯检测电泳的进程和效果。（6 6）EB-DNAEB-DNA复合物中的复合物中的EBEB发出的荧光比游离的发出的荧光比游离的EBEB强强1010倍，倍，因此不需洗净凝胶中游离的因此不需洗净凝胶中游离的EBEB也可检测出也可检测出DNADNA的条带。的条带。3 3、缺点：、缺点：溴溴乙乙啶啶是是一一种种强强的的致致突突变变剂剂，在在操操作作和和配配制制试试剂剂时时应应戴戴手手套套。含含溴溴乙乙啶啶的的溶溶液液不不能能直直接接倒倒入入下下水水道道，应应进进行行处理。处理。（1 1）每）每100ml100ml溶液中加入溶液中加入100mg100mg粉状活性炭；粉状活性炭；（2 2）室温下放置）室温下放置1 1小时，不时的摇动；小时，不时的摇动；（3 3）用新华一号滤纸过滤，弃滤液；）用新华一号滤纸过滤，弃滤液；（4 4）用塑料袋封装滤纸和活性炭，作为有害废物处理。）用塑料袋封装滤纸和活性炭，作为有害废物处理。*溴溴乙乙啶啶在在260260分分解解，在在标标准准条条件件下下进进行行焚焚化化后后不不会会有有危危险险性。性。终于下课了！终于下课了！
