离子交换层析 原理步骤 详细.ppt

离子交换层析离子交换层析ion exchange chromatography一、原理一、原理 离子交换层析是用离子交换剂（具有离子交换性能的物质）作固定相，利用它与流动相中的某种离子进行可逆的交换性质来分离子型混合物的层析方法 低低盐盐高高盐盐分离结束去吸附带电荷不同蛋白质在特定pH值下有不同带电特性胶体洗脱与树脂结合力离子交换树脂如何分离蛋白质二、离子交换剂的类型二、离子交换剂的类型在在惰性载体惰性载体上引入带有电荷的上引入带有电荷的活性基团活性基团（一）按活性功能基团带电荷性质不同（一）按活性功能基团带电荷性质不同阳离子交换剂阳离子交换剂 带负电荷，与阳离子交换带负电荷，与阳离子交换阴离子交换剂阴离子交换剂带正电荷，与阴离子交换带正电荷，与阴离子交换 阴阴离离子子交交换换树树脂脂对对化化学学试试剂剂及及热热都都不不如如阳阳离子交换树脂稳定。离子交换树脂稳定。胶体胶体1.1.离子交换树脂离子交换树脂：(1)(1)类型类型聚苯聚苯乙烯树脂：乙烯树脂：（二）按载体种类不同（二）按载体种类不同苯乙烯苯乙烯二乙烯苯二乙烯苯聚苯乙烯聚苯乙烯母体母体母体母体交联剂交联剂交联剂交联剂聚丙烯酸阳离子交换树脂甲基丙烯酸 二乙烯苯特点：高交换量 pH电电荷高者荷高者离子离子大者大者浓度浓度大者大者（4）离子交换树脂对离子的亲和力）离子交换树脂对离子的亲和力阳离子树脂阳离子树脂n电价数：电价数：Na+Ca+Al+Ti+n原子价数相同，原子序数原子价数相同，原子序数 Li+Na+K+Pb+阴离子阴离子n强碱性交换树脂强碱性交换树脂CH3COO-F-OH-HCOO-CL-SCN-Br-CrO4=NO3-I-C2O4=SO4=n弱碱性交换树脂弱碱性交换树脂F-CL-Br-=I-=CH3COOMo4=PO4=NO3-酒石酸酒石酸根根柠檬酸根柠檬酸根C2O4=SO4=4条件下使用条件下使用,具有羧甲基具有羧甲基 2.离子交换纤维素离子交换纤维素3.离子交换凝胶分离大分子物质如：葡聚糖（Sephadex）聚丙烯酰胺（PAG）琼脂糖（Sepharose）操作过程：1.装柱 2.离子交换 3.洗脱带电荷量少带电荷量少，亲和力小亲和力小的先被洗脱下来的先被洗脱下来带电荷量多带电荷量多，亲和力大亲和力大的后被洗脱下来的后被洗脱下来 三、操作注意点三、操作注意点（一）离子交换剂的选择一）离子交换剂的选择原则：原则：根根据据被被分分离离物物质质的的性性质质选选择择同同一一性性质质离离子子交交换换剂剂中中选选用用对对被被分分离离物物质质各各组组分分之间结合力之间结合力差异大差异大的型号交换剂的型号交换剂1.被分离物质带何种电荷2.被分离物质分子的大小 大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素考虑因素：根据分离过程的实验条件 强酸强碱应用广泛 弱酸型只能在碱性范围内使用 弱碱型只能在酸性范围内使用3.被分离物质所处的环境4.被分离物质的物理化学性质5.被分离物质的大概数量原则：不能发生化学反应，避免使样品变性（二）缓冲液的选择 原则：所用洗脱液比吸着物质具有更活泼的离子或基团 改变pH或离子强度 增强洗脱液与离子交换剂的结合力 降低分离物与离子交换剂的结合力 洗脱方式：梯度洗脱(三)洗脱剂四、应用 分离多肽蛋白、氨基酸、核酸及其他带电的生物分子 实验：离子交换层析分离氨基酸一、原理：一、原理：Dowex50阳离子交换树脂 pH 4.2 +pI 9.7Mr 147pI 2.97Mr 133一、操作注意点：1、装柱和加样同凝胶层析 2、洗脱液（NaOH和柠檬酸）别混淆 3、控制流速：20滴/min 指出2个洗脱峰分别出现在几号管？分别是哪个氨基酸？三、结果要求：