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凝胶层析法凝胶层析法 第一节：引言一凝胶层析(Gel chromatography)凝胶层析也称：排阻层析(ellusion chromatography)、凝胶过滤(gel filtration)、分子筛层析(moleculer chromatography)。凝胶层析中常用凝胶的类型（4种主要类型）葡聚糖凝胶：商品名为Sephadex；琼脂糖凝胶 Sepharose；聚丙烯酰胺凝胶 Bio-Gel p；琼 脂 糖 及 葡 聚 糖 组 成 的 复 合 凝 胶 Superdex 二凝胶层析法特点：1设备简单，操作方便2对高分子物质有良好的分离效果3可测定生物大分子的分子量4脱盐5不改变样品的生物学性质 第二节：基本原理一凝胶层析的机理 1固定相：由惰性的凝胶颗粒组成。2流动相：也叫缓冲溶液，洗脱剂。二凝胶层析的物理特性：1排阻极限（排阻限）：指不能扩散进入凝胶颗粒网孔内部的最小溶质分子。2分级分离范围：某种凝胶允许溶质分子量在多大范围内能得到线性分离。3得水值：每克干胶吸收水的克数（mL数）。4床体积：凝胶和凝胶颗粒周围水分的总体积（mL/g干胶）。型号分离范围（分子量）吸水量（ml/g）床体积/干凝胶（ml/mg）G107001.00.123G151 5001.50.22.53.5G255 0002.50.246G50150020 0008.00.3911G753 00070 0007.50.51215G1004 00015 00010.01.01520G1505 000800 00015.01.52030G2005 00030 000020.02.03040 5凝胶颗粒形状和大小。.凝胶颗粒都成球形，内部有高密度网孔 结构。.颗粒大小有二种表示方法：a.以筛目的大小表示（目）；b.以干颗粒直径表示（m）。三凝胶层析分离的过程 1Vt (total volume)总体积：凝胶柱床容积。由三部分组成：Vt=Vo+Vi+Vg2Vo (outer volume)外水容积（外容积或孔隙容积）:存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相容积。3Vi (inner volume)内水容积，即凝胶颗粒内部所含水相的容积。4Vg 凝胶本身的容积。三凝胶层析分离的过程 三凝胶层析分离的过程 5 Ve (elution volume)洗 脱 容 积：Ve=Vo+KdVi。自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰）出现时所流出的容积。6Kd：样品组分在两相间的分配系数。7Kd:通过实验可求得。Ve=V0+KdVi Kd=(Ve-Vo)/Vi8Kd有下列几种情况：.当Kd=0时 Ve=Vo (全排阻)。.当Kd=1时 Ve=Vo+Vi (完全不被排阻).当 0 Kd1时 即VeVo+Vi 表示凝胶对组分有吸附作用。第三节：凝胶的条件和类型一凝胶的条件：1凝胶必须是化学惰性的。2凝胶的化学性质必须是稳定的。3凝胶上没有或只有极少量的离子交换 基团。4凝胶必须具有足够的机械强度。二凝胶的类型 第四节：凝胶层析的实验技术一凝胶的选择：1凝胶的交联度越高，孔径越小。2对大分子物质的分离，多采用琼脂糖。3对小分子物质的分离，多采用葡聚糖。4凝胶颗粒的粗细影响分离效果。二凝胶的用前处理1除去影响流速的过细颗粒 “水力浮洗法”：将颗粒粗细不均的凝胶悬浮在大体积的水中，让它自然沉降，过细的颗粒浮在上面，倒去即可。反复几次。2溶胀 使用前需直接在欲使用的洗脱液中浸泡溶胀。通常使用“热法”溶胀，即在沸水浴中，将悬浮于洗脱液中的凝胶浆逐渐升温到近沸，12小时即可。三装柱 1装柱：先在柱中加入约1/3高度的洗脱液，边搅拌边加入凝胶悬浮液。2平衡 3检查柱子是否均匀 四样品的上柱及洗脱 1柱床表面要平整。2使洗脱液流至距柱床表面12mm时关闭出口。3以层析允许最小体积的样品，用滴管慢慢加入（一般为0.5mL）。4水溶性物质的洗脱用水或具有不同离子强度和pH的缓冲液。非水溶性物质的洗脱用有机溶剂（苯，丙酮等）。五凝胶柱的保养和凝胶的保存 柱的保存：真空保存或低温保存（避免冻结）。凝胶的保存：1经常使用的凝胶以湿态保存为宜。2长期不用的凝胶可采用干燥保存法。第五节：影响凝胶层析的主要因素一柱长的影响1L/D（长度/直径）：比值高的柱子分辨率高；2柱长相同时：直径大 分辨率高；直径小 分辨率低。3分析时，采用直径较小的柱子；制备时，采用直径较大的柱子。4交联度小的凝胶柱不宜细而长，否则操作上有困难。二样品体积的影响1.分析工作时，样品体积为柱床体积的14%；制备分离时，样品体积为柱床体积的2530%。2.分离体积（Vsep=Ve1-Ve2）当样品体积Vsep时，两个相邻组分不能完全分离。三操作压的影响1洗脱时维持流速的恒定。2用恒流泵维持恒压，从而维持恒流。分子量的测定和计算计算一般都采用标准曲线法。只要测得几种标一般都采用标准曲线法。只要测得几种标准蛋白质相对分子质量的准蛋白质相对分子质量的VeVe，并以它们的，并以它们的相对分子质量的对数相对分子质量的对数(logMr)(logMr)对对VeVe作图得一作图得一直线，再测出待测样品的直线，再测出待测样品的VeVe，即可从图中，即可从图中确定它的相对分子质量。确定它的相对分子质量。