组织细胞培养技术.ppt

组织细胞培养技术授课教师:左 丽 贵阳医学院免疫学教研室组织细胞培养的基本概念组织细胞培养的基本概念 n组织培养的发展史 n组织培养细胞生物学 n建立细胞系（株）的要求 n细胞培养的应用研究 n细胞培养的常用术语及解释 组织培养的发展史组织培养的发展史 n早期培养 n组织培养的建立与发展 n现代组织培养 早期培养n组织培养的萌芽试验:1885年德国人Roux首先尝试了用温生理盐水培育鸡胚神经板组织数月，而且首次采用了“Tissue culture”这个名词。n1898年 Ljunggren将人体皮肤保存在腹水中几天至几周后再移植手术获得成功。n1903年Jolly用玻片悬滴法培养蜂螺白细胞存活近一个月n1906年Beebe等用动物血清培养狗的传染性淋巴瘤细胞达72小时。组织培养的建立与发展nHarrison（1906）和Carrel（1910）用淋巴液培养蛙胚神经组织数周，从此标志着体外培养组织细胞的基本模式的建立。nCarrel（1923）设计了卡氏培养瓶，进一步研究细胞的营养问题。nStrengeway（1926）设计了表玻璃培养法，为研究动物器官在体外的发育与功能作出贡献。现代组织培养n1950年，在美国遇到大规模开发脊髓灰质炎疫苗的机会，利用组织培养法，并加以改良简化，使研究培养更加普遍广泛。n我国应用组织培养进行微生物学研究的也比较早，鲍鉴清（1952）、唐仲伟（1953）、陈瑞铭（1954）、汤非凡（1957）等学者均获得成功。今天，组织培养技术已成为日常的工作手段，在生物学、医药学、农业、环境等方面，以及与细胞学研究相关的领域内，应用极广，是一种利用价值极高的技术。组织培养细胞生物学组织培养细胞生物学 n体内外细胞的差异与分化 n体外培养细胞的分型 n组织培养细胞的生长和增殖过程 n培养细胞的遗传学特征 体内外细胞的差异与分化n由于失去了神经、激素等体液的调节和细胞间相互影响，经多次传代增殖，久之则发生如下变化：分化现象逐渐减弱或不显，形态与功能趋于单一化，或传一定代数后衰老死亡；发生转化，获不死性而成为能无限传代的连续细胞系或恶性细胞系。体外培养细胞的分型n贴壁型细胞 上皮细胞型 成纤维细胞型 游走细胞型 n悬浮型细胞 上皮细胞型 成纤维细胞型 组织培养细胞的生长和增殖过程n细胞周期 n细胞培养一代的生长过程 n培养细胞的生命期 细 胞 周 期nM期（分裂期）主要完成细胞遗传物质的分配nG1期（DNA合成前期）主要发生 DNA合成前的有关生化变化nS期（DNA合成期）主要发生DNA合成nG0期（分裂前期）DNA含量加倍，以及RNA的合成和染色质的螺旋化细胞培养一代的生长过程n传代是将细胞从一个培养瓶皿转移到另一培养瓶皿内生长 n培养一代（单个细胞可倍增36倍）三个阶段：游离期 指数增殖期 停止期 细胞分裂数量n作为判定细胞生长是否旺盛的一个重要指标，以细胞分裂指数（mitotic index,MI）来表示。nMI是指计数100个培养细胞中的分裂细胞数。n一般细胞的MI为0.20.5，无限传代细胞系或肿瘤细胞的MI可高达 35。培养细胞的生命期n原代培养期 原代培养与体内原组织很相似，具异质性，相互依存性强，细胞克隆形成率低。此期一般持续14周。n传代期 持续时间最长，其特点是细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型。n衰退期 在传代期培养时应注意两个问题n为保持二倍体细胞性质，细胞应在传代后早期冻存（不出10代内冻存）。n少数细胞系在此期可能发生自发或诱发转化，获得不死性而成为无限细胞系，此时细胞核型多变成异倍体。培养细胞的遗传学特征n染色质（chromatin）与染色体（chromosomes）染色质和染色体是细胞中同一遗传物质的不同表现形式 间期细胞核中的染色质在进入细胞分裂时变成染色体。应用特殊药物如秋水仙素能阻抑细胞停止在细胞分裂中期，此时染色体呈标准形态，是研究染色体形态结构最好的阶段。n细胞性别女性 称Barr体，紧贴在核膜内面。男性 颗粒状Y小体，位于胞核近中央位。建立细胞系（株）的要求建立细胞系（株）的要求 n细胞株 n原种 n检测、鉴定 用选择法或克隆形成法从用选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培的具有特殊性质或标志的培养物称细胞株。养物称细胞株。一般在原代或一般在原代或23代后即大代后即大量冻存，作为原种量冻存，作为原种（stock cells），取一支细胞进行传代，取一支细胞进行传代繁殖，用毕再冻存，这样可保繁殖，用毕再冻存，这样可保证长期使用和延缓衰老证长期使用和延缓衰老 。当当连续传连续传1010代左右时，代左右时，可按建系、建株要求进行可按建系、建株要求进行检测或鉴定。检测或鉴定。国际上知名的细胞库nATCC（American Type Culture CollectionnIMR（Institute for Medical Research）The Human Genetic Mutant Cell Repository，Institute for Medical Research Copewood and Davis Streets，Camden，NJ 08 103 USAnJCRB细 胞 库（Japanese Cancer Research Resources Bank Cell Bank）nECACC（European Collection of Animal Cell Cultures）ATCC入库检测项目入库检测项目 n组织来源和已传代数：应说明细胞供体所属物种，来自人或动物，个体性别、年龄、取材的器官和组织。肿瘤组织应说明临床和病理诊断及病历号等。细胞培养传代情况。n培养条件及方法：说明使用培养基、血清种类及用量、抗生素、适宜pH等。n细胞活力、细胞生长曲线、分裂指数、倍增时间等。n冻存液ATCC入库检测项目入库检测项目n融解后细胞生长特性。n接种存活率n细胞生物学检测 细胞形态、特异结构、细胞核型n物种检测 检测同工酶谱，主要为G6PD和LDH，以证明细胞有否交叉污染。ATCC入库检测项目入库检测项目n无菌检测 包括细菌、真菌、支原体、病毒等n反转录酶检测n细胞建立者n检测者n鉴定组织细胞培养的应用研究细胞培养的应用研究 n细胞培养在病毒学中的应用n细胞生物学的基础研究n淋巴细胞培养技术的应用n细胞作为毒性实验及安全性实验的工具细胞培养的应用研究细胞培养的应用研究n细胞工程学研究手段已基本建立n遗传疾病的产前检查n体外培养细胞的转化n细胞培养药物测试n在杂交瘤技术中的应用n细胞培养在现代生物技术中应用很广，如基因分离，基因测序与表达、基因转移与重组，癌基因研究等 常用术语及解释 n*为国际组织培养协会对专业术语的统一规定n体外培养（in vitro）：原意为在试管中，现常与组织培养一词通用，译为体外培养。n 组织培养（tissue culture）：维持组织在体外生长，也泛指体外培养。n器官培养（organ culture）：在体外维持器官、器官的部分或器官的原基生存和生长的方法。n*细胞培养(cell culture）：即细胞（包括单个细胞）在体外条件下的生长。在细胞培养中，细胞不再形成组织。n细胞融合（cell fusion）：两个独立的细胞融合成一个细胞。可用聚乙二醇（PEG）或仙台病毒诱发。n*细胞杂交（cell hybridization）：两个或多个不同的细胞融合。导致一个含核体(aynkaryo）的形成。n体外培养转化（in vitro transformation）：细胞在体外培养中发生与原细胞遗传性状不同的变化，但不一定具有致癌性。n 单倍体（haploid）：正常细胞染色体基本数（每一染色体只有一种）。n 整倍体（euploid）：具有两个以上单倍体数目的细胞。n非整倍体（aneuploid）：细胞核内染色体数为单倍染色体数的非整倍数时称非整倍体。n 二倍体（diploid）：具有两套染色单体数目的细胞（2n）.n*原代培养（primary culture）：从体内取出细胞或组织的第一次培养。n再培养（subculture）：同传代。n*传代（passage）也称再培养无论是否稀释，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代或传代培养。也称再培养。n单层培养（monolayer culture）：培养细胞在底物上长成单层。n 悬浮培养（suspension culture）：细胞在培养液中是悬浮状态生长。n*贴壁依赖性（anchorage-dependent）为细胞需贴附于底物或支持物上才能生长的性质。n贴壁依赖性细胞(anchorag dependent cell)：由它们繁衍出来的细胞（或培养物）只有贴附于不起化学作用的物体（如玻璃或塑料等无活物体）的表面时，才能生长，生存或维持其功能。n 无贴壁性（anchorageindependent）：不依赖于贴附底物或支持物上生长的性质。n 汇合（confluent）：细胞相互连接成片占据所有底物面积。n 近汇合（sub-confluent）：细胞在底物上生长接近，但尚未完全汇合。n超汇合（super confluent）：单层培养细胞附在底物上生长，汇合后发展成多层状态。n接触抑制（contact inhibition）：细胞汇合相互接触后失去运动的现象。n密度抑制（density inhibition）：细胞数量到一定数量后引起抑制增殖的现象。n群体密度（population density）：培养底物单位面积上单层细胞数目。n饱和密度（saturation density）：在特殊培养条件下，每平方厘米（单层培养）或每毫升细胞悬液内可达到的最大细胞数。n*细胞系（cell line）：原代培养物经首次传代成功后即为细胞系。n亚系（subline）：由原细胞系分离出的具有与原细胞系不同性状的细胞系。n*细胞株（cell strain）：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养物称细胞株。n亚株（substrain）：由原细胞株分离出的具有原株性状不同的细胞株。n*细胞一代时间（cell generation time）：单个细胞两次连续分裂的时间间隔。n代或世代（generation）：细胞经过一次分裂完成的过程；实际应用往往指再培养（Subcultur）。n*群体倍增时间（population doubling time）：在对数生长期进行计算的细胞增加一倍所需的时间，如从 1 x 106个细胞增加到 2 x 106个细胞的时间间隔。n*克隆（clone）：由单个细胞通过有丝分裂形成的细胞群体。n克隆形成率（cloning effeciency）：向底物接种单细胞悬液能形成细胞小群的百分数。n 接种率（plating efficiency）：再培养细胞接种时能形成克隆的百分数；如每一克隆均来自单个细胞对，则与克隆形成率相同。n接种存活率（seeding efficiency）接种一定数量细胞后，在一定时间内，能附于底物上存活的细胞百分数。n二倍体细胞系或株（dipoid cell line or strain）：具有二倍体核型的细胞系或株。n有限细胞系（finite cell line）：细胞系形成后仅能维持有限传代次数，最后死亡。n连续或无限细胞系（continuous cell line or infinite cell line）：具有无限繁殖能力（获得不死性：immortality）和能反复进行传代细胞系。n连续或无限细胞株（continuous cell strain or infinite cell strain）：具有无限繁殖能力的细胞株。n组型图（idoogram）：细胞染色体按形态特征排列的图形。n核型（karyotype）：一个细胞的全部染色体组成和特征。参考文献1.鄂征主编组织培养技术人民卫生出版社2.张卓然主编.实用细胞培养技术.人民卫生出版社.