实验6.酶促反应动力学.ppt

实验六实验六 酶促反应动力学酶促反应动力学 pH、温度、激活剂、抑制剂、温度、激活剂、抑制剂对酶促反应速度的影响对酶促反应速度的影响 生物化学实验之生物化学实验之山东师范大学生命科学学院山东师范大学生命科学学院【实验目的实验目的】1.了解了解pH、温度、激活剂、抑制剂对、温度、激活剂、抑制剂对酶活力的影响。酶活力的影响。2.学习测定酶最适学习测定酶最适pH值的方法。值的方法。【实验原理实验原理】对环境酸碱度敏感是酶的特点之一。酶对环境酸碱度敏感是酶的特点之一。酶表现最大活力时的表现最大活力时的pH值称为酶的最适值称为酶的最适pH值。值。一般酶的最适一般酶的最适pH值在值在48之间。之间。酶的催化作用受温度的影响很大，反应酶的催化作用受温度的影响很大，反应速度达到最大值时的温度称为酶的最适温度。速度达到最大值时的温度称为酶的最适温度。大多数动物酶的最适温度为大多数动物酶的最适温度为3740，大多，大多数植物酶的最适温度为数植物酶的最适温度为5060。激活剂能增加酶的活力，抑制剂会激活剂能增加酶的活力，抑制剂会降低酶的活力。如降低酶的活力。如 Cl-是唾液淀粉酶的是唾液淀粉酶的激活剂，激活剂，Cu2+则是该则是该酶的抑制剂。酶的抑制剂。在不同在不同pH、温度以及激活剂、抑制、温度以及激活剂、抑制剂存在下，唾液淀粉酶对淀粉水解活力剂存在下，唾液淀粉酶对淀粉水解活力的高低可通过水解混合物遇碘呈现颜色的高低可通过水解混合物遇碘呈现颜色的不同来判断。的不同来判断。淀粉及其水解产物遇碘呈现不同的淀粉及其水解产物遇碘呈现不同的颜色：颜色：淀粉呈蓝色；淀粉呈蓝色；大分子糊精（紫色糊精）呈紫色大分子糊精（紫色糊精）呈紫色 ；其次的糊精（红色糊精）呈红色；其次的糊精（红色糊精）呈红色；小分子糊精及麦芽精为无色。小分子糊精及麦芽精为无色。【器材与试剂器材与试剂】（一）器材（一）器材 1.恒温水浴锅恒温水浴锅 2.试管试管 3.试管架试管架 4.锥形瓶（锥形瓶（50 ml或或100ml）5.移液器（移液器（1000l、100l）（二）试剂（二）试剂 1.0.5淀粉溶液淀粉溶液（含有（含有0.3NaCl）2.0.2molL Na2HPO4溶液溶液 3.0.1molL柠檬酸溶液柠檬酸溶液 4.KII2溶液溶液 5.新鲜唾液新鲜唾液 6.0.1淀粉溶液淀粉溶液 7.1 NaCl溶液溶液 8.1 CuSO4溶液溶液 9.稀碘液稀碘液【实验步骤实验步骤】1.pH值对酶活力的影响值对酶活力的影响 (1)取大试管取大试管6支，编号。按下表制备支，编号。按下表制备pH 5.0 8.0的的5种缓冲溶液。种缓冲溶液。编编号号试剂试剂0.2mol/L Na2HPO4(ml)0.1mol/L柠柠檬酸檬酸(ml)缓缓冲液冲液pH11.551.455.021.91.16.032.30.76.842.80.27.652.90.18.062.30.76.8 (2)向每支试管加入向每支试管加入0.5%淀粉溶液淀粉溶液2mL。注：第注：第6号试管与第号试管与第3号试管的内容物相同。号试管的内容物相同。(3)测定淀粉完全水解所需的时间：测定淀粉完全水解所需的时间：先向第先向第6号试管中加稀释号试管中加稀释50200倍的唾液倍的唾液2ml，摇匀后放入，摇匀后放入37恒温水浴中保温。恒温水浴中保温。每隔每隔1min从试管中取从试管中取1滴混合液，置于白瓷板滴混合液，置于白瓷板上，加上，加1滴滴KI-I2溶液，检测淀粉水解程度，并测溶液，检测淀粉水解程度，并测定淀粉完全水解所需的时间。定淀粉完全水解所需的时间。按照第按照第6号试管的保温时间，依次将各号试管的保温时间，依次将各管迅速取出，并立即加入管迅速取出，并立即加入KII2溶液溶液2滴，充滴，充分摇匀。观察各管呈现的颜色，分摇匀。观察各管呈现的颜色，观察观察pH对对唾液淀粉酶活力的影响，并确定其最适唾液淀粉酶活力的影响，并确定其最适pH。(4)测定淀粉酶的最适测定淀粉酶的最适pH：每隔每隔1min依次向第依次向第1至第至第5号试管中加入号试管中加入上述稀释的唾液上述稀释的唾液2ml，摇匀，依次将，摇匀，依次将5支试管支试管放入放入37恒温水浴锅中保温。恒温水浴锅中保温。2.温度对酶活力的影响温度对酶活力的影响 取试管取试管3支，编号后按下表加入试剂：支，编号后按下表加入试剂：试管编号试管编号 试剂试剂123淀粉溶液淀粉溶液/mL1.51.51.5煮沸煮沸10min的唾液的唾液/mL_1新鲜的稀释唾液新鲜的稀释唾液/mL11_第第1、3 3号试管放入号试管放入37，第，第2 号试管放入冰水中，各号试管放入冰水中，各10 min10 min。取出后，。取出后，2 2号管分为两份，一份放入号管分为两份，一份放入3737。KI-I2溶液溶液/滴滴222记录观察结果记录观察结果3.激活剂和抑制剂对酶活力的影响激活剂和抑制剂对酶活力的影响（1）取试管）取试管3支，按下表编号加入相应试剂：支，按下表编号加入相应试剂：试试管管编编号号试试 剂剂0.10.1淀粉淀粉(ml)(ml)1 1NaClNaCl(ml)(ml)1%CuSO1%CuSO4 4(ml)(ml)H H2 2O O(ml)(ml)1:201:20唾液唾液(ml)(ml)1 12 21 11 12 22 21 11 13 32 21 1 1 1(2)摇匀，置摇匀，置37水浴中保温，每隔水浴中保温，每隔2min取取液体，用稀碘液检测淀粉水解程度，至淀粉液体，用稀碘液检测淀粉水解程度，至淀粉完全水解。完全水解。【注意事项注意事项】pH值对酶活力的影响实验：值对酶活力的影响实验：1.掌握第掌握第6号试管的水解程度是本实验成败的号试管的水解程度是本实验成败的 关键之一。关键之一。2.严格控制温度。在保温期间，水浴温度不能严格控制温度。在保温期间，水浴温度不能 波动，否则影响结果。波动，否则影响结果。3.严格控制反应时间严格控制反应时间,保证每管反应时间相同。保证每管反应时间相同。激活剂、抑制剂对酶活力的影响：激活剂、抑制剂对酶活力的影响：每管中加入的底物应是不含每管中加入的底物应是不含NaCl的的0.1淀粉淀粉 溶液。溶液。【思考题思考题】1.高温导致酶活性丧失的分子机理是什么？高温导致酶活性丧失的分子机理是什么？如何在酶的分离纯化中克服这种影响？如何在酶的分离纯化中克服这种影响？2.什么是酶的最适温度？有何实践意义？什么是酶的最适温度？有何实践意义？3.什么是酶的最适什么是酶的最适pH？它是否是一个常数？它是否是一个常数？它与哪些因素有关？这种性质对于选择测定酶活它与哪些因素有关？这种性质对于选择测定酶活力的条件有什么意义？力的条件有什么意义？4.酶反应的抑制作用有哪些类型？各根据什酶反应的抑制作用有哪些类型？各根据什么划分的？它们各有什么特点？么划分的？它们各有什么特点？