实验八、聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳.ppt
实验八实验八 SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质垂直板电泳分离蛋白质一、目的要求一、目的要求1.学习电泳原理和技术2.学习和掌握SDS聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质技术二、二、原理原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N，Nmethylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，N，N四 甲 基 乙 二 胺(N，N，N，Ntetramethyl ethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate(NH4)2S2O8，简称 AP)或 核 黄 素(ribofavin即 vita min B2，C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简 称PAGE)。聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；(3)对pH和温度变化较稳定；(4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。表3.4 分子量范围与凝胶浓度的关系 分子量范围 适用的凝胶浓度/(%)蛋 白 质 104 20-30 1-4104 15-20 1-5104-1105 10-15 1105 5-10 5105 2-5 核酸(RNA)104 1520 104105 5-10 105-2106 2-2.6聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两大类。目前常用的多为圆盘电泳(如图1)和板状电泳(如图2)，两者电泳原理完全相同。图1 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A为正面,B为剖面)(1)样品胶pH6.7 (2)浓缩胶pH6.7 (3)分离胶pH8.9 (4)电极缓冲液pH8.3图2 夹心垂直板电泳槽示意图 图3 凝胶模示意图1.样品槽模板 2.长玻璃板 1.导线接头 2.下贮槽 3.凹形橡胶框 4.样品槽模板 5.固定螺丝 6.上贮槽 7.冷凝系统 返回不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。（1）样品浓缩效应(a)凝胶孔径不连续性：(b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性；在pH6.7的凝胶缓冲体系中前导离子或快离子：HC1解离出的氯根(C1-)尾随离子(trailing ion)或慢离子：甘氨酸根 mclclmppmGG(Cl代表氯根，P代表蛋白质，G代表甘氨酸根)有效迁移率=m，m为迁移率，为解离度)当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质；（c)电位梯度的不连续性：(2)分子筛效应(3)电荷效应 图4 电泳过程示意图A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子，慢离子B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。图5 不连续系统浓缩效应示意图 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate,简称SDS)，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。因此可以利用SDS-PAGE测定蛋白质分子量。三、试剂与器材三、试剂与器材试剂：10%SDS、凝胶贮液（30ACr-0.8%Bis)、分离胶缓冲液（3.0 mol/L pH8.9TrisHCl 缓冲液）、浓缩胶缓冲液（0.5 mol/L pH6.7TrisHCl 缓冲液）、10%过硫酸铵、10%TEMED、pH8.3Tris-Gly电极缓冲液、1%琼脂糖溶液、0.05考马斯亮兰R250、7%醋酸器材：垂直板电泳槽、稳压稳流电泳仪 、脱色摇床五、五、操作方法操作方法1.安装夹心式垂直板电泳槽 (1)装上贮槽和固定螺丝销钉，仰放在桌面上。(2)将长、短玻璃板分别插到凵形硅橡框的凹形槽中，注意勿用手接触灌胶面的玻璃。(3)将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。(4)将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双手以对角线的方式旋紧螺丝帽。(5)竖直电泳槽，在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙内加入已融化的1%琼脂(糖)。其目的是封住空隙，凝固后的琼脂(糖)中应避免有气泡。3.制备凝胶板 将混合后的分离胶溶液，用细长头的滴管加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约1 cm。用1 mL注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸水(约34 mm)，用于隔绝空气，使胶面平整。约30-60 min凝胶完全聚合，则可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界线。将上、下贮槽的蒸馏水倒去，将混合均匀后的浓缩胶溶液，用细长头的滴管加到长、短玻璃板的窄缝内(即分离胶上方)，距短玻璃上缘0.5 cm处，轻轻加入样品槽模板.在上、下贮槽中加入蒸馏水，但不能超过短玻璃板上缘。静置电泳槽，10 min左右，上胶即可聚合，再放置10-20 min，加入电极缓冲液，使液面没过短玻璃板约0.5 cm，轻轻取出样品槽模板，即可加样。4.样品的处理及加样 将样品按0.51 mg/mL加样品溶解液，溶解后，将其转移到带塞的小离心管中，轻轻盖上盖子(不要塞紧，以免加热时迸出)，在100沸水浴中加热3min，取出冷却后加样。用微量进样器取25 l上述混合液，通过缓冲液，小心地将样品加到凝胶凹形样品槽底部。5.电泳将电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接，接通冷却水，打开电泳仪开关，开始时电流为10 mA，待样品进入分离胶后，将电流调至20-30 mA，当溴酚蓝染料距硅胶框1 cm时，停止电泳，关闭电源及冷却水。6.染色与脱色电泳结束后，取下凝胶模，卸下硅胶框，用不锈钢药铲或镊子撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记，在两侧溴酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标记。加入染色液染色1-2 h，再用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率。7.结果处理量出加样端距细铜丝间的距离(cm)以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离(cm)，按下式计算相对迁移率mR:相对迁移率mR=蛋白质样品距加样端迁移距离(cm)溴酚蓝区带中心距加样端距离(cm)六、注意事项六、注意事项（1）安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧固定螺丝，避免缓冲液渗漏。（2）用琼脂(糖)封底及灌胶时不能有气泡，以免电泳时影响电流的通过。（3）样品中应含一定浓度的蔗糖溶液，目的是用以防止样品因对流而被稀释。（4）加样时样品不能超出凹形样品槽。加样槽中不能有气泡，如有气泡，可用注射器针头挑除。七、思考题七、思考题(1)为什么要在样品中加少许溴酚兰和一定浓度的蔗糖溶液？蔗糖及溴酚兰的作用分别是什么？
