生物化学与分子生物学 第12章 复制.ppt

第三章第三章DNA复制复制DNAReplication遗传物质的分子机制遗传物质的分子机制分子生物学的核心分子生物学的核心Watson&Crick：一种遗传物质，必须能行使一种遗传物质，必须能行使两种功能，即两种功能，即自我复制自我复制和和对细胞的高度特异性对细胞的高度特异性的影响的影响。遗传物质的基本属性遗传物质的基本属性：自我复制自我复制 控制性状的表达控制性状的表达 产生突变产生突变 n生物体的遗传信息以密码的形式编码在生物体的遗传信息以密码的形式编码在DNA分分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序；子上，表现为特定的核苷酸排列顺序；n遗传信息通过遗传信息通过DNA的复制由亲代传递给子代；的复制由亲代传递给子代；nDNA双螺旋模型的提出是双螺旋模型的提出是DNA复制的理论基础。复制的理论基础。DNA是生物遗传的主要物质基础：是生物遗传的主要物质基础：复制的复杂性复制的复杂性dsDNAssDNA的能量供求的能量供求构型的变化构型的变化 超螺旋超螺旋线状，开环状线状，开环状多种酶类的互作多种酶类的互作ReplisomeDNA复制起始控制机理知之甚少复制起始控制机理知之甚少复制的准确性复制的准确性（修复，校正）（修复，校正）研究试材的特殊性研究试材的特殊性（温度敏感型（温度敏感型，突变抑制体系突变抑制体系）DNA复制速度复制速度（E.coli105bp/min）缺乏统一的模式缺乏统一的模式（dsDNA，ssDNA，LinearDNA等）等）n1DNA的半保留复制的半保留复制n2复制单位、起点和复制方式复制单位、起点和复制方式n3复制速度复制速度n4引物引物n5DNA的半不连续复制的半不连续复制第一节第一节DNA的复制概述的复制概述1DNA的半保留复制的半保留复制（semi-conservative）n1.1概念概念复制时，复制时，DNA两条链解开，以每两条链解开，以每条链为摸板，按碱基互补配对原条链为摸板，按碱基互补配对原则合成互补链，形成的两个子代则合成互补链，形成的两个子代DNA分子与原来的亲代分子与原来的亲代DNA分分子完全相同，每个子代子完全相同，每个子代DNA分子分子中一条链来自亲本，一条链为新中一条链来自亲本，一条链为新合成的。合成的。1.2实验依据：实验依据：MeselsonMeselson&Stahl(1958)&Stahl(1958)E.coliE.coli:放射性同位素（放射性同位素（放射性同位素（放射性同位素（15N15N）标记）标记）标记）标记&CsClCsCl密度梯度离心密度梯度离心密度梯度离心密度梯度离心nDNA分子上每一条链都含有合成它的互补分子上每一条链都含有合成它的互补链所必需的全部遗传信息链所必需的全部遗传信息n半保留复制是双链半保留复制是双链DNA普遍采用的复制机普遍采用的复制机制制n在半保留复制中碱基配对是核酸分子间传在半保留复制中碱基配对是核酸分子间传递遗传信息的结构基础递遗传信息的结构基础nDNA分子在代谢上是稳定的分子在代谢上是稳定的n1.3生物学意义：生物学意义：保证保证DNA代谢的稳定性。经过多代的复制，子代代谢的稳定性。经过多代的复制，子代DNA仍可以保持与最初亲本的一致性。仍可以保持与最初亲本的一致性。n稳定性是相对的，变异是绝对的稳定性是相对的，变异是绝对的在各种理化因素的作用下，在各种理化因素的作用下，DNA会发生损伤；会发生损伤；在复制、转录的过程中，在复制、转录的过程中，DNA会发生错误；会发生错误；在生长发育的过程中，在生长发育的过程中，DNA可能进行修饰、删可能进行修饰、删除、扩增和重排。除、扩增和重排。2、复制单位、起点和复制方式、复制单位、起点和复制方式n2.1复制单位：复制子复制单位：复制子nAunitofthegenomeinwhichDNAcontainaregionfromorigin（复制起点）（复制起点）toterminus（复制终点）（复制终点）.n基因组中能独立复制的单位基因组中能独立复制的单位n原核生物单复制子，真核生物多复制子原核生物单复制子，真核生物多复制子根据：根据：越靠近越靠近origin的基因转导的频率越高的基因转导的频率越高 4a4b3c3d2e2f1g1h aobcaobdecaobdfgecaobdfh 复制的不同步性、复制的不同步性、断裂的随机性断裂的随机性replicationorigin:在基因在基因a和和b之间之间复复制制起起点点的的确确定定实实验验分子杂交确定各分子杂交确定各基因片段的频率基因片段的频率2.2复制起点：一般富含复制起点：一般富含AT？单单起点、起点、单单方向方向多多起点、起点、单单方向方向单单起点、起点、双双方向方向多多起点、起点、双双方向方向2.3复制方式：具有多样性复制方式：具有多样性n单起点或多起点单起点或多起点;单向或双向单向或双向;对称或不对称对称或不对称确定复制方向实验确定复制方向实验autoradiographyE.coli实验步骤：实验步骤：E.coli先用先用低放射性低放射性的的3H-dTTP标记；标记；几几分分钟钟后后，E.coli转转移移入入高高放放射射性性的的3H-dTTP培培养基中继续标记；养基中继续标记；提取提取DNA进行放射自显影；进行放射自显影；根据底片感光银粒密度的分布判断复制的方向。根据底片感光银粒密度的分布判断复制的方向。结论：结论：单向复制单向复制银粒的密度：银粒的密度：一端高，一端低一端高，一端低；双向复制双向复制银粒的密度银粒的密度:中间低，两端高中间低，两端高。Differentdensitiesofradioactivelabelingcanbeusedtodistinguishunidirectionalandbidirectionalreplication.n真核生物染色体真核生物染色体DNA线性双链线性双链多复制子多复制子n病毒病毒DNA形态形态多样（环形、线形、双链或单链）多样（环形、线形、双链或单链）复制方式多样（双向、单向、对称或不对称）复制方式多样（双向、单向、对称或不对称）n生物染色体多为双向对称式复制生物染色体多为双向对称式复制例外：例外：Bs双向，但两复制叉移动距离不同双向，但两复制叉移动距离不同n滚动环式（噬菌体滚动环式（噬菌体X174DNA）和和D环式（线粒环式（线粒体体DNA）是单向复制的特殊形式。是单向复制的特殊形式。n真核生物复制叉移动的速度真核生物复制叉移动的速度1000-3000bp/min;n原核生物复制叉移动的速度原核生物复制叉移动的速度50,000bp/minn真核生物比原核生物慢真核生物比原核生物慢?（复制时解开核小体，复制后又重新形成核小体）（复制时解开核小体，复制后又重新形成核小体）3复制速度复制速度4、引物、引物（primer）n所有所有DNA聚合酶均不能起始聚合酶均不能起始DNA的合成的合成n引物是一段同模板引物是一段同模板DNA配对的短核酸序配对的短核酸序列，为列，为DNA合成提供合成提供3-OH末端末端E.coliRifSRifS+M13E.coliE.coliRifR+S.S.DNAvirusRF无无M13RFRifampinM13Rifampin有有M13RF有有M13RF M13RifampinM13表达、组装、释放表达、组装、释放DNA复制需要复制需要RNA引物的发现引物的发现M13RF的形成需要的形成需要RNApolymerase合成一段合成一段RNA分子作为引物；分子作为引物；RF启动后，启动后，RNA引物已经形成，引物已经形成，Rifampin的抑的抑制无效。制无效。ConclusionThefirstevidencesupportingRNAprimingRifampin 是是E.coliRNApolymerase 的抑制剂的抑制剂 引物引物nRNA引物（多数）引物（多数）nDNA引物引物n引物蛋白引物蛋白35OK!How?53535DNA的半不连续复制（的半不连续复制（semi-discontinuousreplication）3519681968年，冈崎年，冈崎：3 3H-H-dTTPdTTP标记标记+碱性密度梯度离心：碱性密度梯度离心：发现短时间内分离的发现短时间内分离的DNADNA中有大量中有大量10001000ntnt的的DNADNA小片小片段段；一段时间后一段时间后，检测到，检测到 DNADNA大片段。大片段。DNADNA ligaseligase 变异的温度敏感菌株，在变异的温度敏感菌株，在ligaseligase不起作不起作用的温度下，有大量的用的温度下，有大量的DNADNA短片段积累。短片段积累。说明：说明：DNADNA复制中先合成较短片段（复制中先合成较短片段（冈崎片段冈崎片段），再），再连成长链连成长链DNADNA。5.1半不连续复制的发现半不连续复制的发现冈崎片段的数量冈崎片段的数量 新合成新合成DNADNA的一半，原因：的一半，原因：U U代替代替T T掺入到掺入到DNADNA中造成。中造成。DNADNA中的中的U U被糖苷酶切除，随后进被糖苷酶切除，随后进行修复。此过程可产生一些小片段。行修复。此过程可产生一些小片段。糖苷酶变异株，糖苷酶变异株，DNADNA中的中的U U不再被切除不再被切除新合成新合成DNADNA一一半出现于冈崎片段；另一半直接进入大的片段。半出现于冈崎片段；另一半直接进入大的片段。说明：说明：DNADNA复制时，一条链连续，另一条链不连续。复制时，一条链连续，另一条链不连续。即半不连续复制。即半不连续复制。n5.2概念：概念：DNA复制时，前导链的合成复制时，前导链的合成是连续的是连续的,而后随链的合成是不连续的，而后随链的合成是不连续的，这种复制方式称为半不连续复制这种复制方式称为半不连续复制前导链前导链(leadingstrand)DNA复制时，合成方向复制时，合成方向与复制叉移动的方向一致并连续合成的链。与复制叉移动的方向一致并连续合成的链。n后随链后随链(laggingstrand)DNA复制时，合成方向复制时，合成方向与复制叉移动的方向相反，形成许多不连续的冈与复制叉移动的方向相反，形成许多不连续的冈崎片段，最后再连成一条完整的崎片段，最后再连成一条完整的DNA链。链。n冈崎片段：冈崎片段：DNA复制过程中，由复制过程中，由DNA聚合酶合成聚合酶合成的可连接为后随链的的可连接为后随链的DNA短片段。短片段。n原核生物原核生物1000-2000nt(一个顺反子的长度一个顺反子的长度)，真核生物真核生物100-200nt（核小体的长度）。核小体的长度）。n1dATPn2dGTPn3dCTPn4dTTPDNA聚合酶聚合酶模板、模板、RNA引物、引物、Mg2+DNA+nPPi(n=n1+n2+n3+n4)1DNA复制的总反应复制的总反应：第二节、原核生物第二节、原核生物DNA复制复制n底物底物:dNTP(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)n模板模板:单链的单链的DNA母链母链nRNA引物引物:寡核苷酸寡核苷酸(10nt60nt)nDNA聚合酶聚合酶:n其他酶和蛋白因子其他酶和蛋白因子:引物酶、解链酶，解引物酶、解链酶，解旋酶，单链结合蛋白，连接酶旋酶，单链结合蛋白，连接酶2E.coli DNA复制的酶体系复制的酶体系nDNA聚合酶聚合酶n解螺旋酶解螺旋酶n单链结合蛋白单链结合蛋白n拓扑异构酶拓扑异构酶n引物合成酶引物合成酶n连接酶（岗崎片段）连接酶（岗崎片段）2.1DNA聚合酶聚合酶n催化核酸链的延长反应催化核酸链的延长反应n以以4种种dNTP为底物为底物n反应需接受模板指导反应需接受模板指导n链延伸需有引物链延伸需有引物3-OH存在存在n链延伸方向为链延伸方向为5-3n产物产物DNA极性与模板相对极性与模板相对n需需Mg离子存在离子存在单体酶单体酶,多功能酶。多功能酶。具有具有5 5 3 3聚合酶功能（对聚合酶功能（对dNTPdNTP的选择）；的选择）；33 5 5外切酶活性（校对功能）外切酶活性（校对功能）55 33外切酶活性外切酶活性功能：功能：DNADNA损伤的修复，损伤的修复，DNADNA复制时复制时RNARNA引物切除及其空隙的填补引物切除及其空隙的填补vDNADNA聚合酶聚合酶ArthurKornberg(1958)ArthurKornberg(1958)5至至3的聚合活性（的聚合活性（53）：）：3OH对对dNTP的的磷酸进行亲核攻击，形成磷酸进行亲核攻击，形成3，5磷酸二酯键。磷酸二酯键。n35外切酶活性：正常复制时该活性很低，外切酶活性：正常复制时该活性很低，一旦出现错配的碱基，聚合反应停止，一旦出现错配的碱基，聚合反应停止，35外外切活性将错配的核苷酸切除切活性将错配的核苷酸切除-校正作用；校正作用；核酸外切酶活性核酸外切酶活性3535外切酶活性：外切酶活性：切除错配的核苷酸切除错配的核苷酸5353外切酶活性：外切酶活性：切除引物切除引物 切除突变的片段切除突变的片段缺口平移缺口平移(nick translation)：DNA pol在缺口在缺口处一方面由处一方面由53外切活性切除缺口下游的核苷酸，外切活性切除缺口下游的核苷酸，另一方面又由聚合活性从另一方面又由聚合活性从53方向合成新的方向合成新的DNA链，使缺口位置向链，使缺口位置向3端移动。端移动。用于制备放射性标记用于制备放射性标记的的DNA探针探针。Klenow片段片段：DNA pol经枯草杆菌蛋白酶处经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大亚基，丧失理后产生的大亚基，丧失53外切活性；外切活性；Nick translation replaces part of a pre-existing strand of duplex DNA with newly synthesized material.多亚基酶多亚基酶具有具有53聚合酶功能聚合酶功能,但聚合活力低但聚合活力低；35外切酶活性（校对功能）外切酶活性（校对功能）功能：功能：DNA损伤的修复损伤的修复vDNADNA聚合酶聚合酶：vDNA聚合酶聚合酶：真正的复制酶真正的复制酶核心酶：核心酶：亚基有主要的聚合活性亚基有主要的聚合活性;亚基有亚基有35外切酶活性外切酶活性组建核心酶组建核心酶10种种22个亚基组成不对称聚合体个亚基组成不对称聚合体亚基亚基亚基亚基亚基功能亚基功能2聚合活性聚合活性235外切酶校对功能外切酶校对功能2组建核心酶组建核心酶2核心酶二聚化核心酶二聚化2形成形成复合物复合物1形成形成复合物复合物,1形成形成复合物复合物1形成形成复合物复合物1形成形成复合物复合物42个个亚基形成滑动夹子亚基形成滑动夹子,以提高酶以提高酶的持续合成能力的持续合成能力夹夹子子装装 配配 器器DNA聚合酶聚合酶III全酶的亚基组成全酶的亚基组成DNApolDNApolDNApol不同种类亚基数目不同种类亚基数目1710（22）53聚合活性聚合活性53外切活性外切活性35外切活性外切活性聚合速度聚合速度(nt/min)1000120024001500060000持续合成能力持续合成能力32001500500000主要功能主要功能修复、切除引物修复、切除引物修复修复复制复制q大肠杆菌三种大肠杆菌三种DNA聚合酶的比较聚合酶的比较DNA聚合酶催化反应的特点聚合酶催化反应的特点n以单链以单链DNADNA为模板为模板n以以dNTPdNTP为原料为原料n引物提供引物提供3-OH3-OHn聚合方向为聚合方向为53532.2解螺旋酶解螺旋酶(helicase)通过水解通过水解ATP获得能量打开获得能量打开DNA双链。双链。每解开一对碱基需要水解每解开一对碱基需要水解2个个ATP分子。分子。E.coli 解旋酶主要为：解旋酶主要为：DnaB和和Rep蛋白蛋白nDnaB:沿沿5-3方向，结合于滞后链模板方向，结合于滞后链模板nRep蛋白：沿蛋白：沿3-5方向，结合于前导链模板方向，结合于前导链模板2.3单链单链DNA结合蛋白结合蛋白(SSB)与分开的单链与分开的单链DNA结合，防止它们再接结合，防止它们再接触并重新结成碱基对，触并重新结成碱基对，起着稳定解开的起着稳定解开的单链，阻止复性和保护单链部分不被核单链，阻止复性和保护单链部分不被核酸酶降解。酸酶降解。2.4DNA拓扑异构酶拓扑异构酶(topoisomerase)n兼有内切酶和连接酶的活力兼有内切酶和连接酶的活力,既能水解，既能水解，又能连接磷酸二酯键又能连接磷酸二酯键.n拓扑异构酶拓扑异构酶：使使DNA一条链发生断裂和一条链发生断裂和再连接。作用是松解负超螺旋，反应不再连接。作用是松解负超螺旋，反应不需要能量。需要能量。n拓扑异构酶拓扑异构酶：使使DNA两条链发生断裂两条链发生断裂和再连接。当引入负超螺旋时需要由和再连接。当引入负超螺旋时需要由ATP提供能量。提供能量。2.5引物酶和引发体引物酶和引发体引物酶引物酶(primase):n依赖依赖DNA的的RNA聚合酶。聚合酶。n催化催化RNA引物的合成。引物的合成。n在大肠杆菌，引物酶是在大肠杆菌，引物酶是dnaG基因的产物。基因的产物。RNA引物引物：在在DNA模板的复制起始部位由引物酶催模板的复制起始部位由引物酶催化化NTP的聚合，形成短片段的的聚合，形成短片段的RNA，为，为DNA聚合提供聚合提供3-OH末端。末端。引发体引发体(primosome)n由由DnaB、DnaA、DnaC以及其他复制因子一起以及其他复制因子一起形成复合体，再结合引物酶形成较大的聚合体，形成复合体，再结合引物酶形成较大的聚合体，结合到模板结合到模板DNA上。上。n复制开始时，在引发体的下游解开双链，再由引复制开始时，在引发体的下游解开双链，再由引物酶催化引物的合成。物酶催化引物的合成。2.6、DNA连接酶连接酶(ligase)连接酶连接酶DNA连接酶在连接酶在DNA复制、修复和重组过程均起重要作用。复制、修复和重组过程均起重要作用。T4连接酶还能连接无单链粘性末端的平头双链连接酶还能连接无单链粘性末端的平头双链DNA催化双链催化双链DNA切口上切口上5磷酸基与磷酸基与3羟羟基的共价连接。基的共价连接。连接反应需要能量。连接反应需要能量。不催化二条游离单链的结合。不催化二条游离单链的结合。复制叉：复制叉：DNADNA分子的正在复制部位，同分子的正在复制部位，同时进行着解链与合成，形成在显微镜下可时进行着解链与合成，形成在显微镜下可看到的叉状结构，称为复制叉。看到的叉状结构，称为复制叉。复制体：许多酶和蛋白质在复制叉上参复制体：许多酶和蛋白质在复制叉上参与作用，所形成的复合物称为复制体。与作用，所形成的复合物称为复制体。3原核生物原核生物DNA的复制的复制n3.1、复制的起始、复制的起始(initiation)复制起复制起点处双链的解开，点处双链的解开，RNA引物的合成引物的合成n3.2、复制的延长、复制的延长(elongation)DNA聚聚合酶合酶III向向RNA引物引物3端添加端添加dNTP，包括包括前导链的合成和滞后链的合成前导链的合成和滞后链的合成n3.3、复制的终止、复制的终止(termination)3.1复制的起始复制的起始n E.coli复制起点为复制起点为oriC，245bp，其序列和控，其序列和控制元件在细菌中十分保守。制元件在细菌中十分保守。n关键序列：关键序列：3个个13bp序列、序列、4个个9bp序列序列许多生物的复制原点都是富含许多生物的复制原点都是富含A、T的区段。的区段。原核生物只有一个复制起点。原核生物只有一个复制起点。真核生物有多个复制起点。真核生物有多个复制起点。q起始过程起始过程2040个个DnaA蛋白（蛋白（ATP）结合到结合到9bp重复序列，形成重复序列，形成起始复合物起始复合物；富含富含AT的的13bp重复序列在重复序列在HU类组蛋白类组蛋白结合之后变性结合之后变性，形成，形成开链复合物开链复合物；DnaB解螺旋酶在解螺旋酶在DnaC引导下结合于开链引导下结合于开链区区。在在DNA拓扑异构酶协助下，解开拓扑异构酶协助下，解开DNA双链。双链。SSB结合到被打开的单链上。形成结合到被打开的单链上。形成前前引发复合物引发复合物。引物酶引物酶合成一段合成一段RNA引物引物，并，并开始开始DNA的的复制复制3.2DNA复制的延伸复制的延伸n向引物的向引物的3端逐个添加核苷酸，形成端逐个添加核苷酸，形成DNA片段；片段；n前导链和滞后链的合成同时进行；前导链和滞后链的合成同时进行；n由于由于DNA的两条互补链方向相反，却由的两条互补链方向相反，却由同一个同一个聚合酶的不对称二聚体聚合酶的不对称二聚体所催化。因此，滞后链必所催化。因此，滞后链必须绕成一个突环（须绕成一个突环（loop）。）。冈崎片段的合成需要冈崎片段的合成需要DNApol不断与模板结合与脱开，此过程由不断与模板结合与脱开，此过程由复合物借助水解复合物借助水解ATP的能力协助的能力协助夹子来完成。夹子来完成。primosome后随链的生物合成后随链的生物合成 pppRNAasprimerDNApolymeraseIIIpppDNApolymeraseIDNApolymeraseIDNAligase起始（引物体起始（引物体合成合成RNA引物引物）延长（延长（DNA聚合酶聚合酶III向引物向引物RNA的的3端逐个添加核苷酸，端逐个添加核苷酸，形成短的形成短的DNA片段片段）终止（终止（DNA聚合酶聚合酶I的的53外切外切酶活性酶活性切除切除RNA引物，引物，其其53的聚合酶活性的聚合酶活性填补缺口，之后由填补缺口，之后由连接酶连接冈崎片段）连接酶连接冈崎片段）q后随链的生成包含三个步骤：后随链的生成包含三个步骤：n包括：引物的切除；补上相应的包括：引物的切除；补上相应的DNA链；通过链；通过ligase连接各个片段。连接各个片段。nTer有点像陷井，使复制叉只能进入，不能出来。有点像陷井，使复制叉只能进入，不能出来。nTUS与与ter位点结合形成位点结合形成Tus-ter复合物，阻止复制复合物，阻止复制叉继续前移叉继续前移n拓扑异构酶拓扑异构酶IV分开连锁体分开连锁体3.3复制的终止复制的终止E.coli（单起点双方向）单起点双方向）Ter-TUS复合体复合体终止解螺旋酶的作用终止解螺旋酶的作用防止防止DNA过度复制，过度复制，避免避免出现出现DNA多聚体多聚体E.Coli染色体染色体DNA的复制调控的复制调控n染色体复制与细胞分裂一般同步染色体复制与细胞分裂一般同步n复制起始不依赖细胞分裂，但终止能印复制起始不依赖细胞分裂，但终止能印发细胞分裂发细胞分裂nDNA复制调节主要发生在起始阶段复制调节主要发生在起始阶段nDam甲基化酶使腺嘌呤甲基化酶使腺嘌呤6-N甲基化甲基化n复制起点需被甲基化才能起始复制复制起点需被甲基化才能起始复制第三节第三节真核生物真核生物DNA的复制的复制 1、细胞周期、细胞周期nDNA合成前期（合成前期（G1）：）：合成合成DNA复制所需要的蛋白质复制所需要的蛋白质和和RNA；nDNA合成期（合成期（S）:常染色质早复制，异染色质晚复制，常染色质早复制，异染色质晚复制，着丝粒和端粒的着丝粒和端粒的DNA最后复制。最后复制。nDNA合成后期（合成后期（G2）：）：有丝分裂的准备期；有丝分裂的准备期；n有丝分裂期（有丝分裂期（M）；）；其中其中G1、S、G2合称为合称为间期间期，为，为M期作准备期作准备E.coli370.5h105bp/min S6-8h M1hG23-4hmammaliancell 22-25h500-5000bp/min G112h2、真核生物、真核生物DNA复制的酶和蛋白复制的酶和蛋白 2.1真核生物真核生物DNApolsDNApolDNApolDNApolDNApolDNApol定位定位细胞核细胞核细胞核细胞核线粒体线粒体细胞核细胞核细胞核细胞核亚基数目亚基数目412443-5外切活性外切活性无无无无有有有有有有引物合成活性引物合成活性有有无无无无无无无无持续合成能力持续合成能力中等中等低低高高有有PCNA时时高高高高功能功能引物合成引物合成修复修复线粒体线粒体DNA合成合成核核DNA合成合成核核DNA复复制制哺乳动物哺乳动物DNADNA聚合酶聚合酶n存在于细胞核，起始新链的合成（前导链、滞后存在于细胞核，起始新链的合成（前导链、滞后链）链）n多亚基酶（一般为多亚基酶（一般为4个），其中一个亚基有引物合个），其中一个亚基有引物合成酶活性（成酶活性（10ntRNA)，一个亚基有聚合酶活性，一个亚基有聚合酶活性(2030ntiDNA），但无），但无35外切酶活性外切酶活性n现在认为现在认为DNApol只能合成引物只能合成引物2.1.1、酶：引物合成酶活性酶：引物合成酶活性n单亚基酶，位于细胞核单亚基酶，位于细胞核n有聚合作用，无有聚合作用，无35外切酶外切酶n功能：功能：与修复有关与修复有关2.1.2、酶酶:修复修复2.1.3、酶：线粒体酶：线粒体DNA合成合成n2个亚基，定位于线粒体个亚基，定位于线粒体n有聚合和有聚合和35外切酶活性外切酶活性n功能：参与线粒体功能：参与线粒体DNA合成合成n4个亚基；个亚基；n具有聚合酶活性和具有聚合酶活性和35外切酶活性外切酶活性n其持续合成其持续合成DNA的能力需要的能力需要PCNA（增殖细增殖细胞核抗原，相当于原核胞核抗原，相当于原核DNApolIII的的亚基，亚基，形成环状夹子夹住形成环状夹子夹住DNA）；2.1.4、酶：酶：DNA复制；复制；n在一个复制叉上，有一个在一个复制叉上，有一个DNA聚合酶聚合酶，2个个DNA聚合酶聚合酶或或1个个DNA聚合酶聚合酶和一个和一个DNA聚合酶聚合酶n在复制叉上，前导链由在复制叉上，前导链由DNA聚合酶聚合酶合成，滞合成，滞后链由后链由DNA聚合酶聚合酶或或DNA聚合酶聚合酶合成。合成。2.1.5、酶：可能合成滞后链酶：可能合成滞后链2.2其它酶和蛋白质因子其它酶和蛋白质因子增殖细胞核抗原（增殖细胞核抗原（PCNA）：进行性因子进行性因子,可形成环状夹子可形成环状夹子夹住夹住DNA。复制因子复制因子C（RF-C）：定位因子，是夹子装置器定位因子，是夹子装置器（clamploader），帮助帮助PCNA因子安装到双链上以及拆下来。因子安装到双链上以及拆下来。RF-A：单链单链DNA结合蛋白。结合蛋白。T抗原抗原：DNA解旋酶。解旋酶。拓扑异构酶拓扑异构酶II:消除拓扑张力。消除拓扑张力。DNA连接酶连接酶I：冈崎片段的连接。冈崎片段的连接。RNaseH1和和MF-1：去除去除RNA引物引物3、真核生物、真核生物DNA复制复制3.1 3.1 复制过程及相关实验系统复制过程及相关实验系统n起始位点起始位点 酵母为实验系统酵母为实验系统n延伸延伸SV40为实验系统为实验系统n端粒端粒起始位点起始位点-酵母为实验系统酵母为实验系统n具有多个复制单元，各自有具有多个复制单元，各自有1个复制起始位点个复制起始位点n酵母里的复制起始位点为酵母里的复制起始位点为ARS（automaticreplicationsequence）nARS含含11bp的保守序列，富含的保守序列，富含AT，可以被复制起始相关，可以被复制起始相关的蛋白质识别的蛋白质识别（ORC(originrecognitioncomplex)isacomplexof6proteinswithamassof400kD）n复制单元没有固定的终止位点。复制单元没有固定的终止位点。延伸延伸-SV40为实验系统为实验系统解螺旋酶在特定复制原点上解开螺旋，具有启动功能解螺旋酶在特定复制原点上解开螺旋，具有启动功能的的DNApol-引物酶在复制叉上合成一小段引物。引物酶在复制叉上合成一小段引物。前导链和滞后链由前导链和滞后链由DNApol参与复制，滞后链上参与复制，滞后链上RNA引物由引物由RNaseH1和和MF-1去除，然后由去除，然后由DNApol和和DNA连接酶连接酶I修复滞后链。修复滞后链。需各种辅助蛋白需各种辅助蛋白PCNA、RF-A、RF-C、T抗原、拓扑抗原、拓扑异构酶异构酶II、DNA连接酶连接酶I和和RNaseH1和和MF-1的参与。的参与。终止终止n复制单元没有固定的终止位点复制单元没有固定的终止位点n端粒端粒组蛋白的复制组蛋白的复制-全保留复制全保留复制n真核真核DNA冈崎片段冈崎片段200bp=核小体核小体DNA的长度的长度真真核核DNA复制以核小体为单位进行复制以核小体为单位进行；n放射性同位素标记放射性同位素标记核小体的组蛋白或是全部带有核小体的组蛋白或是全部带有标记，或是全部不带同位素标记标记，或是全部不带同位素标记亲代核小体的组亲代核小体的组蛋白八聚体是以整体传递给子代蛋白八聚体是以整体传递给子代DNA；n药物抑制蛋白质合成药物抑制蛋白质合成前导链产生核小体结构，滞前导链产生核小体结构，滞后链没有核小体结构后链没有核小体结构前导链的组蛋白完全来自亲前导链的组蛋白完全来自亲本，而滞后链则完全是新合成的本，而滞后链则完全是新合成的。2原核生物与真核生物的复制异同原核生物与真核生物的复制异同n相同点相同点n不同点不同点DNA复制的共同特点复制的共同特点n半保留：最基本特征，对生物遗传意义重大半保留：最基本特征，对生物遗传意义重大n半不连续：前导链、滞后链、冈崎片段半不连续：前导链、滞后链、冈崎片段n都存在：引发、延长、终止都存在：引发、延长、终止n方向：方向：53n都需要相应的功能蛋白、酶及都需要相应的功能蛋白、酶及RNA引物的参与引物的参与DNA复制的不同特点复制的不同特点真核生物：真核生物：n大、核小体、染色质大、核小体、染色质n速度比原核生物慢速度比原核生物慢n多复制起点多复制起点n染色体复制完成前，复制起点不重新复制染色体复制完成前，复制起点不重新复制n端粒端粒3-OHLaggingstrandofcircleDNAreplication LaggingstrandoflinearDNAreplication But 35533-OH?3-OH?The ends of linear DNA are a problem for replication染色体末端与特定端粒蛋白质因子染色体末端与特定端粒蛋白质因子n氢键、范德华力氢键、范德华力复合物复合物n保护端粒保护端粒DNA末端不受外切核酸酶及单链特末端不受外切核酸酶及单链特异性内切核酸酶破坏异性内切核酸酶破坏n避免避免DNA黏性末端裸露而发生染色体融合黏性末端裸露而发生染色体融合n可能与真核生物染色体线形末端的复制有关可能与真核生物染色体线形末端的复制有关3.2 端粒（端粒（tolemere）n端粒：真核生物染色体末端具有的特殊结构端粒：真核生物染色体末端具有的特殊结构n结构简单、相似结构简单、相似n序列具有一定取向特征：序列具有一定取向特征：-5末端富含末端富含C，3末端富含末端富含G-富含富含G的的3-OH端有一条核苷酸单链突出端有一条核苷酸单链突出末端末端端粒（端粒（telomere）的复制）的复制n特点特点：存在于染色体两端，由数百个简单重复序：存在于染色体两端，由数百个简单重复序列构成的，富含列构成的，富含GC，但不含有遗传信息，且但不含有遗传信息，且3端端长于长于5端端n作用作用：保护染色体末端不被酶降解：保护染色体末端不被酶降解解决染色体复制时末端丢失的问题解决染色体复制时末端丢失的问题可能与细胞衰老有关可能与细胞衰老有关端粒酶端粒酶（telomerase）n含有含有RNA（含端粒重复单位的模板含端粒重复单位的模板）的的蛋白酶蛋白酶n由由RNA与蛋白质组成的一种核糖体蛋白与蛋白质组成的一种核糖体蛋白复合体复合体n具逆转录酶活性具逆转录酶活性n可外加重复单位到可外加重复单位到5末端，维持端粒长度末端，维持端粒长度n分子机制还未清楚分子机制还未清楚TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG55TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGCCAACCCCCCAACCCC35oH355CCAACCCCCCAACCCC35TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGCCAACCCCCCAACCCC2.2.聚合聚合1.1.结合结合3.3.移位移位爬爬行行模模式式TTGGTTGGGGGGTTGGGGTTGGGGCCAACCCCCCAACCCC4真核生物复制调控真核生物复制调控三个调控水平三个调控水平nA细胞生活周期水平调控细胞生活周期水平调控细胞生长期细胞生长期nB染色体水平调控染色体水平调控决定不同染色体或同一染色体不同部位的复制子决定不同染色体或同一染色体不同部位的复制子按一定顺序在按一定顺序在S期起始复制期起始复制nC复制子水平调控复制子水平调控复制子，决定复制起始与否复制子，决定复制起始与否1、DNA复制的特点复制的特点1)半保留：最基本特征，对生物遗传有重要意义；半保留：最基本特征，对生物遗传有重要意义；2)半不连续：前导链、滞后链、冈崎片段；半不连续：前导链、滞后链、冈崎片段；3)方向：方向：53；4)复制方式具有多样性：单向复制方式具有多样性：单向/双向（更常见）；双向（更常见）；5)需要需要RNA引物。引物。总总结结2、DNA聚合酶催化反应的特点：聚合酶催化反应的特点：以四种脱氧核糖核酸（以四种脱氧核糖核酸（NTP)为底物；为底物；反应需要接受模板指导；反应需要接受模板指导；反应需要有引物反应需要有引物OH存在；存在；DNA链的生长方向为链的生长方向为；产物产物DNA的性质与模板相同。的性质与模板相同。3、DNA合成高保真性的因素合成高保真性的因素1)1)DNADNA聚合酶对底物的选择作用；聚合酶对底物的选择作用；2)2)DNADNA聚合酶聚合酶3 3 5 5核酸外切酶的校对作用；核酸外切酶的校对作用；3)3)修复系统对错配碱基的检查和修复系统对错配碱基的检查和DNADNA各种损伤的各种损伤的修复修复4)4)复制叉的复杂结构进一步提高了复制的精确性；复制叉的复杂结构进一步提高了复制的精确性；4、细菌和真核生物复制体的组成、细菌和真核生物复制体的组成组成组成细菌细菌真核生物真核生物复制酶复制酶DNA聚合酶聚合酶III全酶全酶DNA聚合酶聚合酶/DNA聚合酶聚合酶进行性因子进行性因子夹子夹子PCNA增殖细胞核抗原增殖细胞核抗原定位因子定位因子复合物复合物RF-C引物合成酶引物合成酶DnaGDNA聚合酶聚合酶(引物合成酶）引物合成酶）去除引物去除引物RNaseH和和DNA聚合酶聚合酶IMF-1(5-3外切核酸酶）外切核酸酶）滞后链修复滞后链修复DNA聚合酶聚合酶I和和DNA连接酶连接酶DNA聚合酶聚合酶和和DNA连接酶连接酶解螺旋酶解螺旋酶DnaB(定位需定位需DnaC)T抗原抗原消除拓扑张力消除拓扑张力旋转酶旋转酶拓扑异构酶拓扑异构酶I单链结合单链结合SSBRP-A5、原核生物与真核生物、原核生物与真核生物DNA复制的区别复制的区别真核生物真核生物原核生物原核生物多复制子多复制子单复制子单复制子全部染色体复制完成之前，各复全部染色体复制完成之前，各复制子不能重新开始新一轮复制制子不能重新开始新一轮复制第一轮复制尚未结束，已在起第一轮复制尚未结束，已在起始点开始第二轮复制始点开始第二轮复制冈崎片段长度为冈崎片段长度为100-200nt冈崎片段长度为冈崎片段长度为1000-2000nt复制叉移动速度为复制叉移动速度为2-3kb复制叉移动速度为复制叉移动速度为50kb由引发进入延伸阶段必需有由引发进入延伸阶段必需有DNA聚合酶聚合酶的活性转换的活性转换有独立的引发酶有独立的引发酶冈崎片段冈崎片段5RNA引物由核酸酶引物由核酸酶RNase1和和MF-1切除切除由由DNA聚合酶聚合酶I的外切酶活性完的外切酶活性完成冈崎片段成冈崎片段5RNA引物的切除引物的切除端粒酶复制染色体末端端粒酶复制染色体末端不存在此现象不存在此现象DNA复制的同时，需组装新的核复制的同时，需组装新的核小体小体无核小体组装无核小体组装学习要求学