物料管理与成本控制.ppt

物料管理与成本控制物料管理与成本控制2011年李文阁所谓的所谓的 “物料物料”在这里就是指：在这里就是指：实验材料、化学试剂，低值易耗品实验材料、化学试剂，低值易耗品 物料与成本的关系一般情况一个产品或一项技术服务成本组成：一般情况一个产品或一项技术服务成本组成：原材料占原材料占50%（也就是物料）（也就是物料）人工人工10%管理管理10%生产费用生产费用10%销售等销售等20%可见企业50-60%以上的销售额用于购买生产资料，有的企业甚至高达75%。所以只要在原材料的采购上降低1%，效果将十分可观。根据国际上权威信息调查公司的调查表明，原材料的采购每降低1%，相当于企业提高了10-15%的销售额。同理我们在提供产品和技术服务上降低1%的材料消耗，就可提升百分之十的销售额。从理论上上讲，如果迈迪公司年销售收入1000万元，我们节省了1%的物料消耗就相当于增加了100万元的销售收入。控制成本的要点成本的分类按资产形态上分：固定资产-固定成本 非固定资产-变动成本固定资产固定资产固定资产：固定资产：凡是单价超过凡是单价超过2000元（含元（含2000元），耐用期在元），耐用期在1年以上（含年以上（含1年）的仪器设备均属于固定资产范畴。年）的仪器设备均属于固定资产范畴。例如实验室、超净台、离心机等。例如实验室、超净台、离心机等。依据相应的方法折旧进入成本依据相应的方法折旧进入成本分解成本分解成本:（1）仪器设备折旧）仪器设备折旧;（2）实验用房折旧）实验用房折旧;（3）实验家具折旧。实验家具折旧。非固定资产非固定资产：主要包括单价在2000元以下的物品，比如仪器、仪表、工具、医疗器械、化学及生物试剂、办公用品等等低值易耗品。这是我们加强管理，控制成本的这是我们加强管理，控制成本的要点。要点。固定资产主要注意方面登记建卡，熟悉使用说明书，保存好纸制材料。登记建卡，熟悉使用说明书，保存好纸制材料。定期校对设备，防止误差影响实验结果。定期校对设备，防止误差影响实验结果。与维护人员保持经常性的联系：与维护人员保持经常性的联系：1、公司主管人，、公司主管人，2、售后工程师、售后工程师注意设备关键部位的保养注意设备关键部位的保养 超净工作台：超净工作台：1、进风口在背面或正面的下方，金属网罩内有一普通泡沫塑料片、进风口在背面或正面的下方，金属网罩内有一普通泡沫塑料片或无纺布，用以阻拦大颗粒尘埃，应常检查、拆洗，如发现泡沫或无纺布，用以阻拦大颗粒尘埃，应常检查、拆洗，如发现泡沫塑料老化，要及时更换。塑料老化，要及时更换。2、工作台正面的金属网罩内是超级滤清器，超级滤清器也可更换，、工作台正面的金属网罩内是超级滤清器，超级滤清器也可更换，如因使用年久，尘粒堵塞，风速减小，不能保证无菌操作时，则如因使用年久，尘粒堵塞，风速减小，不能保证无菌操作时，则可可 换上新的。换上新的。培养箱：使用前请详阅说明书，以免误操作。更换高效过滤器，培养箱：使用前请详阅说明书，以免误操作。更换高效过滤器，因为专业经营每个竞因为专业经营每个竞700元、入风过滤网每个也要元、入风过滤网每个也要500元左右。元左右。非固定资产方面非固定资产方面-物和物和料料 一、材料及低值易耗品管理的必要性 在重视仪器设备管理的同时，必须加强对材料及低值易耗品的管理，其理 由有以下几个方面：保证供应，为完成实验任务及时提供物资。物料是实验室进行实验工作的重要物质基础，而实验工作天天在消耗大量的物料，因此采购保管部门必须及时、准确地对消耗了物料给予补偿，以保证实验工作的顺利进行。科学管理，以到1、固定资产，、固定资产，凡是单价超过凡是单价超过2000元（含元（含2000元），元），耐用期在耐用期在1年以上（含年以上（含1年）的仪器年）的仪器设备均属于固定资产范畴。例如设备均属于固定资产范畴。例如超净台、离心机等。超净台、离心机等。分解成本分解成本:（1）仪器设备折旧）仪器设备折旧;（2）实验用房折旧）实验用房折旧;（3）实验家）实验家具折旧。具折旧。1基础篇基础篇-冷冻细胞活化冷冻细胞活化 1.冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。2.细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单例如产生单株抗体或是其它蛋白质株抗体或是其它蛋白质)。3.材料材料 37 恒温水，新鲜培养基，无菌吸管恒温水，新鲜培养基，无菌吸管/离心管离心管/培养瓶，液氮或干冰容器培养瓶，液氮或干冰容器 4.步骤：步骤：4.1 操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。伤害。4.2 自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。4.3 将新鲜培养基置于将新鲜培养基置于37 C 水槽中回温，回温后喷以水槽中回温，回温后喷以70%酒酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。精并擦拭之，移入无菌操作台内。4.4 取出冷冻管，立即放入取出冷冻管，立即放入37 C 水槽中快速解冻，轻摇冷冻水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在管使其在1 分钟内全部融化，以分钟内全部融化，以70%ethanol 擦拭保存管外部，擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。移入无菌操作台内。4.5 取出取出0.9 ml 解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内容器内(稀释比例稀释比例1:101:15)，混合均匀，放入，混合均匀，放入CO2 培养箱培培养箱培养。另取养。另取0.1 ml 解冻细胞悬浮液作存活测试。解冻细胞悬浮液作存活测试。4.6 解冻后是否立即去除冷冻保护剂解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如例如DMSO 或或glycerol)，依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入含有剂。惟若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10 ml 培养基之离心管内，离心培养基之离心管内，离心1,000 rpm,5 分钟，移去上清液，分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2 培养箱培养。培养箱培养。4.7 若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。培养基。基础篇基础篇-收到细胞的处理方式收到细胞的处理方式 (一一)1.收到细胞株包裹时，收到细胞株包裹时，请检查细胞株冷冻管是否有解冻请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形，情形，若有请立即通知。细胞株请尽速开始培养，若有请立即通知。细胞株请尽速开始培养，或或立即冷冻保存立即冷冻保存(置于置于70 C，隔夜后，隔夜后，移到液氮移到液氮)。2.冷冻细胞解冻程序冷冻细胞解冻程序:2.1.依据细胞株数据单指定之基础培养基种类、血清种依据细胞株数据单指定之基础培养基种类、血清种类和其它指定之成份和比例，制备培养基。绝大多数之类和其它指定之成份和比例，制备培养基。绝大多数之细胞均无法立即适应不同之基础培养基或不同之血清种细胞均无法立即适应不同之基础培养基或不同之血清种类，类，若因实验需要，若因实验需要，必须有所不同时，必须有所不同时，务必以缓慢比务必以缓慢比例渐次改变培养基组成，例渐次改变培养基组成，确定细胞适应后，确定细胞适应后，方进行所方进行所需之实验。需之实验。2.2.FBS(fetal bovine serum,胚牛血清胚牛血清),CS(calf serum,小小牛血清牛血清)和和HS(horse serum,马血清马血清)，对细胞而言差异极，对细胞而言差异极大，请务必依据细胞株资料单指定之血清种类培养之。大，请务必依据细胞株资料单指定之血清种类培养之。2.3.将培养基置于将培养基置于37 C 水槽中回温，水槽中回温，回温后喷以回温后喷以70%酒精酒精并擦拭之，并擦拭之，移入无菌操作台内。取出冷冻管，移入无菌操作台内。取出冷冻管，立即放入立即放入37 C 水槽中快速解冻，水槽中快速解冻，水面高度不可接近或高过冷冻管之盖水面高度不可接近或高过冷冻管之盖沿，沿，否则易发生污染。轻摇冷冻管使其在否则易发生污染。轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融分钟内全部融化后，化后，以以70%ethanol 擦拭冷冻管外部，擦拭冷冻管外部，移入无菌操作台移入无菌操作台内。内。2.4.依据细胞种类和浓度，于无菌操作台内取依据细胞种类和浓度，于无菌操作台内取10 ml 培养基培养基加至加至T25 或或T75 flask中。取出已解冻之细胞悬浮液，缓缓加中。取出已解冻之细胞悬浮液，缓缓加入入T25 或或T75 flask 内之培养基，内之培养基，混合均匀，放入混合均匀，放入37 C，5%CO2 培养箱培养。培养箱培养。2.5.对绝大多数细胞而言，对绝大多数细胞而言，1%以下之冷冻保护剂以下之冷冻保护剂DMSO，不会对细胞之贴附或活化有不良影响，不需立刻由解冻细不会对细胞之贴附或活化有不良影响，不需立刻由解冻细胞中去除，胞中去除，待第二天确定细胞生长或贴附良好后再去除即待第二天确定细胞生长或贴附良好后再去除即可。惟对极少数因对可。惟对极少数因对DMSO 敏感或会造成细胞分化之细胞，敏感或会造成细胞分化之细胞，需立即去除需立即去除DMSO 者，者，则可将解冻后之细胞悬浮液放入则可将解冻后之细胞悬浮液放入5-10 ml 培养基中，离心培养基中，离心300 xg(约约1000 rpm)，5 分钟，小心移分钟，小心移去上清液，加入适量新鲜培养基，将细胞均匀混合后，去上清液，加入适量新鲜培养基，将细胞均匀混合后，转转移至培养瓶中，移至培养瓶中，再放入再放入37 C，5%CO2 培养箱培养。培养箱培养。基础篇基础篇-收到细胞的处理方式收到细胞的处理方式 (二二)收到收到T25 flask T25 flask 细胞时，细胞时，处理方式为处理方式为 1.1.于寄送过程中，为避免起泡造成细胞脱落死亡，于寄送过程中，为避免起泡造成细胞脱落死亡，T25 flask T25 flask 均加满培养基。请检查均加满培养基。请检查flask flask 外观，并于外观，并于显微镜下观察细胞生长状况和有无污染现象，若有任显微镜下观察细胞生长状况和有无污染现象，若有任何问题，何问题，不要打开盖子，请立即通知细胞实验室。不要打开盖子，请立即通知细胞实验室。2.2.将原封之将原封之T25 flask T25 flask 静置于静置于37 37 C C，5%CO2 5%CO2 培培养箱中，使细胞回温至养箱中，使细胞回温至37 37 C C，并让运送过程中少数并让运送过程中少数脱落的细胞可再附着生长。隔天后，于无菌操作箱内脱落的细胞可再附着生长。隔天后，于无菌操作箱内取出取出flaskflask内之培养基，内之培养基，(取出之培养基可以再使用取出之培养基可以再使用)，仅留约仅留约5-10ml 5-10ml 培养基于培养基于flask flask 内，依一般培养方式再内，依一般培养方式再将细胞置入培养箱中，或细胞已长满盘，将细胞置入培养箱中，或细胞已长满盘，则将细胞做则将细胞做传代培养。传代培养。附附-细胞计数与存活测试（一）细胞计数与存活测试（一）1.1.原理：原理：1.1.1.1.计算细胞数目可用血球计数盘或是计算细胞数目可用血球计数盘或是Coulter counter Coulter counter 粒子计数粒子计数器自动计数。器自动计数。1.2.1.2.血球计数盘一般有二个血球计数盘一般有二个chamberschambers，每个每个chamber chamber 中细刻中细刻9 9 个个1 1 mm2 mm2 大正方形，其中大正方形，其中4 4 个角落之正方形再细刻个角落之正方形再细刻16 16 个小格，深度均为个小格，深度均为0.1 mm0.1 mm。当。当chamber chamber 上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1 1 mm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 mlmm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以数目，乘以稀释倍数，再乘以104104，即为每，即为每ml ml 中之细胞数目。中之细胞数目。1.3.1.3.存活测试之步骤为存活测试之步骤为dye exclusiondye exclusion，利用染料会渗入死细胞中而利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之蓝色之trypantrypan blue blue 染料，如果细胞不易吸收染料，如果细胞不易吸收trypantrypan blue blue，则用红则用红色之色之ErythrosinErythrosin bluish bluish。附附-细胞计数与存活测试（二）细胞计数与存活测试（二）2.2.材料：材料：0.4%w/v 0.4%w/v trypantrypan blue(blue(GibcoBRLGibcoBRL 15250-061)15250-061)ErythosinErythosin bluish stain bluish stain 取取0.1 gram 0.1 gram ErythrosinErythrosin bluish(Sigma E-9259)bluish(Sigma E-9259)及及0.05 gram 0.05 gram preservative methyl preservative methyl parabenparaben(Sigma H-3647)(Sigma H-3647)溶于溶于100 ml Ca+/Mg+free saline 100 ml Ca+/Mg+free saline 血球计数盘及盖玻片血球计数盘及盖玻片(HemocytometerHemocytometer and and coverslipcoverslip)，计数器计数器(counter)(counter)，低倍倒立显微镜低倍倒立显微镜 粒子计数器粒子计数器(Coulter counter,Coulter Electronics)(Coulter counter,Coulter Electronics)3.3.步骤：步骤：3.1.3.1.取取50ml 50ml 细胞悬浮液与细胞悬浮液与50ml 50ml trypantrypan blue(or blue(or ErythrosinErythrosin bluish)bluish)等等体积混合均匀于体积混合均匀于1.5ml 1.5ml 小离心管中。小离心管中。3.2.3.2.取少许混合液取少许混合液(约约15ml)15ml)自血球计数盘自血球计数盘chamber chamber 上方凹槽加入，盖上盖上方凹槽加入，盖上盖玻片，于玻片，于100 100 倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色或红色-ErythrosinbluishErythrosinbluish)。3.3.3.3.计数四个大方格之细胞总数，再除计数四个大方格之细胞总数，再除4 4，乘以稀释倍数，乘以稀释倍数(至少乘以至少乘以2 2，因与，因与trypantrypan blue blue等体积混合等体积混合)，最后乘以，最后乘以104104，即为每，即为每ml ml 中细胞悬浮液之细胞数。中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞或计下线与左线之细胞)。4 4 大格大格*细胞总数细胞总数x 2 x 104/4=x 2 x 104/4=细胞数细胞数/ml/ml*每一大格的体积每一大格的体积=0.1cm x 0.1cm x 0.01cm=10-4 ml=0.1cm x 0.1cm x 0.01cm=10-4 ml 3.4.3.4.若不用血球计数盘，可用若不用血球计数盘，可用Coulter counter Coulter counter 作自作自动计数，惟无法辨别死细胞或活细胞。动计数，惟无法辨别死细胞或活细胞。3.5.3.5.范例：范例：T75 monolayer culture T75 monolayer culture 制成制成10ml 10ml 细胞悬浮液，取细胞悬浮液，取0.1 ml 0.1 ml 溶液与溶液与0.1ml 0.1ml trypantrypan blue blue 混合均匀于试管混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目。之细胞数目。活细胞数活细胞数/方格：方格：55,62,49,59 55,62,49,59 死细胞数死细胞数/方格：方格：5,3,4,6 5,3,4,6 细胞总数细胞总数=243=243 平均细胞数平均细胞数/方格方格=60.75=60.75 稀释倍数稀释倍数=2=2 细胞数细胞数/ml/ml：60.75 x 104 x 2=1.22 x 106 60.75 x 104 x 2=1.22 x 106 细胞数细胞数/flask/flask：1.22 x 106 x 10ml=12.2 x 106 1.22 x 106 x 10ml=12.2 x 106 存活率：存活率：225/24392.6%225/24392.6%升级篇升级篇-细胞培养细胞培养1 11 冷冻管应如何解冻？冷冻管应如何解冻？取出冷冻管后，取出冷冻管后，须立即放入须立即放入37 C 水槽中快速解冻，水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化，分钟内全部融化，并注意水并注意水面不可超过冷冻管盖沿，面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。预防冷冻管之爆裂。2 细胞冷冻管解冻培养时，细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除是否应马上去除DMSO？除少数特别注明对除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外，敏感之细胞外，绝大部绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，在解冻之后，应应直接放入含有直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中，新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，即可，如如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。题。3 可否使用与原先培养条件不同之培养基？可否使用与原先培养条件不同之培养基？不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。造成细胞无法存活。4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？可否使用与原先培养条件不同之血清种类？不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。血清使用错误常会造成细胞无法存活。升级篇升级篇-细胞培养细胞培养2 25 何谓何谓FBS,FCS,CS,HS?FBS(fetal bovine serum)和和FCS(fetal calf serum)是相是相同的意思，同的意思，两者都是指胎牛血清，两者都是指胎牛血清，FCS 乃错误的乃错误的使用字眼，使用字眼，请不要再使用。请不要再使用。CS(calf serum)则是指则是指小牛血清。小牛血清。HS(horseserum)则是指马血清。则是指马血清。6 培养细胞时应使用培养细胞时应使用5%或或10%CO2？或根本没有或根本没有影响？影响？一般培养基中大都使用一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作为作为pH 的的缓冲系统，缓冲系统，而培养基中而培养基中NaHCO3 的含量将决定细的含量将决定细胞培养时应使用的胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用时，细胞培养时应使用10%CO2；当培养基中当培养基中NaHCO3 为每公升为每公升1.5 g 时，时，则应则应使用使用5%CO2 培养细胞。培养细胞。7 何时须更换培养基？何时须更换培养基？视细胞生长密度而定，视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。时更换培养基即可。8 培养基中是否须添加抗生素？培养基中是否须添加抗生素？除于特殊筛选系统中外，除于特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，一般正常培养状态下，培养基中不应添培养基中不应添加任何抗生素。加任何抗生素。9 附着性细胞继代时所使用之附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA 浓度？应如何处理？浓度？应如何处理？一般使用之一般使用之trypsin-EDTA 浓度为浓度为0.05%trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于保存于20 C，避免，避免反复冷冻解冻造成反复冷冻解冻造成trypsin 之活性降低，之活性降低，并可减少污染之机会。并可减少污染之机会。10 悬浮性细胞应如何继代处理？悬浮性细胞应如何继代处理？一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中，一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中，稀释细胞浓度即稀释细胞浓度即可，可，若培养液太多时，若培养液太多时，可将培养角瓶口端稍微抬高，可将培养角瓶口端稍微抬高，直到无法直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶，瓶，加入新鲜培养基稀释至适当浓度，加入新鲜培养基稀释至适当浓度，重复前述步骤即可。重复前述步骤即可。升级升级篇篇-细胞培养细胞培养3 311 欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？欲回收动物细胞，欲回收动物细胞，其离心速率一般为其离心速率一般为300 xg(约约1,000rpm)，5-10 分钟，分钟，过高之转速，过高之转速，将造成细胞死亡。将造成细胞死亡。12 细胞之接种密度为何？细胞之接种密度为何？依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。一重要原因。13 细胞冷冻培养基之成份为何？细胞冷冻培养基之成份为何？动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5-10%DMSO(dimethyl sulfoxide)和和90-95%原来细胞生长用之新原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于鲜培养基均匀混合之。注意：由于DMSO 稀释时会放出大稀释时会放出大量热能，量热能，故不可将故不可将DMSO 直接加入细胞液中，直接加入细胞液中，必须使用前必须使用前先行配制完成。先行配制完成。14 DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何？之等级和无菌过滤之方式为何？冷冻保存使用之冷冻保存使用之DMSO 等级，等级，必须为必须为Tissue culture grade之之DMSO(如如Sigma D2650)，其本身即为无菌状况，其本身即为无菌状况，第一次开瓶后应立即少第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，量分装于无菌试管中，保存于保存于4C，避免反复冷冻解冻造成避免反复冷冻解冻造成DMSO 之裂解而释出有害物质，之裂解而释出有害物质，并可减少污染之机会。若要过滤并可减少污染之机会。若要过滤DMSO，则须使用耐则须使用耐DMSO 之之Nylon 材质滤膜。材质滤膜。15 冷冻保存细胞之方法？冷冻保存细胞之方法？冷冻保存方法一冷冻保存方法一:冷冻管置于冷冻管置于4 C 3060 分钟分钟(-20 C30 分钟分钟*)-80 C 1618 小时小时(或隔夜或隔夜)液氮槽液氮槽vaporphase 长期储存。长期储存。冷冻保存方法二冷冻保存方法二:冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降钟降1-3 C 至至80 C 以下，以下，再放入液氮槽再放入液氮槽vapor phase长期储存。长期储存。*-20 C 不可超过不可超过1 小时，小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入亦可跳过此步骤直接放入-80C 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。冰箱中，惟存活率稍微降低一些。升级篇升级篇-细胞培养细胞培养4 416 细胞欲冷冻保存时，细胞欲冷冻保存时，细胞冷冻管内应有多少细胞浓度细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？冷冻管内细胞数目一般为冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial，融合瘤细胞融合瘤细胞则以则以5x106 cells/ml vial 为宜。为宜。17 应如何避免细胞污染？应如何避免细胞污染？细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。污染之最好方法。18 如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？加入相应抗生素。直接灭菌后丢弃之。加入相应抗生素。直接灭菌后丢弃之。19 支原体支原体(mycoplasma)污染的细胞，污染的细胞，是否能以肉眼观察是否能以肉眼观察出异状？出异状？不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。的细胞株，无法以其外观分辨之。20 支原体污染会对细胞培养有何影响？支原体污染会对细胞培养有何影响？支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。，实验结果之数据方有意义。21 侦测出细胞株有支原体污染时，侦测出细胞株有支原体污染时，该如何处理？该如何处理？直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。22 CO2 培养箱之水盘如何保持清洁？培养箱之水盘如何保持清洁？定期定期(至少每两周一次至少每两周一次)以无菌蒸馏水或无菌去离子水以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。更换之。升级篇升级篇-细胞培养细胞培养5 523 为何培养基保存于为何培养基保存于4 C 冰箱中，冰箱中，颜色会偏暗红颜色会偏暗红色，色，且且pH值会越来越偏碱性？值会越来越偏碱性？培养基保存于培养基保存于4 C 冰箱中，冰箱中，培养基内之培养基内之CO2 会逐会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂之酸碱指示剂(通常为通常为phenol red)的颜色也会随碱的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果，性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果，将造成将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时，细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时，可以通可以通入无菌过滤之入无菌过滤之CO2，以调整以调整pH 值。值。24 各种细胞培养用的各种细胞培养用的dish，flask是否均相同？是否均相同？不同厂牌的不同厂牌的dish 或或flask，其所其所coating 的的polymer 不不同，同，制造程序亦不同，制造程序亦不同，虽对大部分细胞没有太大虽对大部分细胞没有太大之影响，之影响，惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish 或或flask 而有显著之生长差异。而有显著之生长差异。25 购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情形购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情形？研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少，研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少，大都是因为离大都是因为离心过程操作上的失误，心过程操作上的失误，造成细胞的物理性损伤，造成细胞的物理性损伤，以及细胞流失。以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心，建议细胞解冻后不要立刻离心，应待细胞生长隔夜后再更换培养应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。基即可。26 购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？研究人员在细胞培养时出现存活率不佳，研究人员在细胞培养时出现存活率不佳，常见原因可归纳为：培常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后，佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心。悬加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于80 C 太久。太久。27 收到之冷冻管瓶身破裂，瓶盖有裂纹，或瓶盖脱落之原因？收到之冷冻管瓶身破裂，瓶盖有裂纹，或瓶盖脱落之原因？冷冻管瓶盖裂纹，或瓶身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时冷冻管瓶盖裂纹，或瓶身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当，造成冷冻管裂损，建议使用止血钳小心夹取。另冷冻用力不当，造成冷冻管裂损，建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱，乃因热胀冷缩之物理现象，冷冻管有可能因管瓶盖松动或松脱，乃因热胀冷缩之物理现象，冷冻管有可能因此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出液氮桶时，均应立刻此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出液氮桶时，均应立刻将冷冻管再一次扭紧将冷冻管再一次扭紧 升级篇升级篇-细胞培养细胞培养6 628 如何选用特殊细胞系培养基？如何选用特殊细胞系培养基？培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在中培养的细胞，很可能在DMEM或或M199中同样很容中同样很容易生长。总之，首选易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始，各种目的做悬浮细胞培养是一个好的开始，各种目的无血清培养最好首选无血清培养最好首选AIM V（12005）培养基培养基（SFM）。）。29 L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？不稳定吗？L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终定论。有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。而氨对于一些细胞具有毒性。30 GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？这个二肽有多稳定？GlutaMAX-I 二肽是一个二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的的alpha-氨基用氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放肽，释放L-谷氨酰胺供利用。谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常稳定，二肽非常稳定，即使在即使在121磅灭菌磅灭菌20分钟，分钟，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。谷氨酰胺几乎完全降解。31 什么培养基中可以省去加酚红？什么培养基中可以省去加酚红？酚红在培养基中被用来作为酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。升级篇升级篇-细胞培养细胞培养7 732 培养基中丙酮酸钠的作用是什么？培养基中丙酮酸钠的作用是什么？丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。胞也可以代谢丙酮酸钠。34二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么？的目的是什么？二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。所有的二价离子。33 33 目录上说，目录上说，HankHanks s 平衡盐溶液平衡盐溶液(HBS)(HBS)要在空气中要在空气中使用，不需要使用，不需要CO2CO2培养箱。原因是什么？培养箱。原因是什么？HankHanks s 平衡平衡盐溶液盐溶液(HBS)(HBS)和和EarleEarles s平衡盐溶液平衡盐溶液(EBS)(EBS)有什么本质有什么本质的功能差别？的功能差别？HBS和和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在在Eagles(2.2g/L)中比在中比在Hanks(0.35g/L)中高。碳酸氢钠需用高水中高。碳酸氢钠需用高水平的平的CO2平衡，以维持溶液的平衡，以维持溶液的PH值。值。Eagles液在空气水液在空气水平的平的CO2 中，溶液会变碱，中，溶液会变碱，Hanks液在液在CO2培养箱中会培养箱中会变酸。如果希望在变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用培养箱中保存组织，需要用Eagles液，。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存液，。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用的组织，用Hanks液就可以了。液就可以了。升级篇升级篇-细胞培养细胞培养8 8 35