固体脂质纳米粒GelMA水凝胶双重缓释白藜芦醇促进骨再生 (1).docx

引言骨是脊椎动物重要的运动器官，除了为躯体提供结构支持，还具有保护内脏器官的作用1, 2。人体的骨骼每天都在更新，成人每天约有3%5%的骨骼溶解再生，在调节血清钙和磷水平中发挥重要作用1, 3, 4。骨骼具有强大的再生能力，小面积的骨缺损通常可以自愈，并且不会产生瘢痕组织5, 6。然而，由外伤性骨折、骨肿瘤切除、先天性畸形等所导致的大面积骨缺损可能无法自愈，通常需要骨移植修复7-10。骨移植可分为自体骨移植、同种异体骨移植、异种异体骨移植和人工骨移植（图1-1）。然而，这些骨移植方式都具有明显的缺陷4, 7。例如，人工图1-1 不同种骨移植方式11骨造价昂贵，异体骨具有病原体传播和出现免疫排斥反应等风险。即便是被认为是骨移植金标准的自体骨移植，也存在感染、供区疼痛、手术时间长等缺点，并且由于供量有限，远远无法满足临床需求12, 13。因此，在临床实践过程中需要寻找新的天然骨移植替代物。随着1993年组织工程概念的提出，以体外开发骨移植替代物和克服天然骨移植缺陷为目标的骨组织工程被认为是治疗骨缺损的一种有前景的策略（图1-2）14, 15。这些构建的骨移植替代物以细胞种子形式存在，包括良好的支架、大量的种子细胞以及生长因子16, 17。其中支架起着不可或缺的作用，它需要具备良好的生物相容性，不引起宿主的免疫系统应答，还需要具有与邻近宿主骨相似的力学稳定性18-20。不锈钢和钛纤维金属是人们最早使用的金属骨缺损移植替代物21, 22。最初，人们只是使用基于钛纤维等金属和由羟基磷灰石、磷酸三钙或两者共同组成的陶瓷简单替代缺损的骨23-25。随着科技的不断进步，各种有机高分子材料因其较低的免疫源性和生物可降解等优点引起人们的关注并被广泛尝试制作成骨植入材料。这些有机高分子材料大多能够随着骨组织的再生而降解，并且具有支持细胞行为的孔隙率和材料性质，它们可以是天然的，如明胶、胶原、壳聚糖、丝素蛋白等，也可以是人工合成的，如聚己内酯和聚乙烯亚胺聚碳酸酯共聚物等15, 26-30。甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)是一种可以经光引发聚合的改性水凝胶，由甲基丙烯酸酐和明胶制备而成31, 32。其中，明胶是胶原蛋白水解而得到的天然高分子化合物，因其芳香基团数量较少显著降低了其免疫原性33。此外，明胶具有多种生物活性基序，包括促进不同类型细胞粘附和生长的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列，和用于细胞重塑、促进明胶降解的基质金属蛋白酶（MMP）34-36。GelMA水凝胶通常含有少于5%的甲基丙烯酸酐，这意味着明胶的大多数功能性氨基酸基序，包括RGD和MMP，没有受到显著影响37。特别是RGD基序，因为其不包含可与甲基丙烯酸酐反应的官能团，从而保留了凝胶材料中明胶的细胞粘附特性34, 37。与其他形成水凝胶的生物材料相比，GelMA水凝胶的生物功能和机械性能都是可调节的。例如，通过调整GelMA的氨基取代度可以改变其生物性能和机械性能。GelMA的生物相容性随着取代度的增高而降低，而力学性能却随着取代度的增加而上升。例如，Chen 等人研究了不同取代度GelMA 内血管生成的程度，发现低取代度GelMA内的毛细血管数量以及血管网络形成程度明显高于高取代度内的38。Lin 等人将骨髓间充质干细胞（BMSCs）分别包封在不同浓度GelMA（7.5%、10%和15%）内培养，发现低浓度GelMA（7.5%和10%）促进BMSCs的内皮细胞分化，而10%GelMA内BMSCs的成骨分化明显高于其他两组39。尽管GelMA具有如此多的优势，但其缺乏骨诱导性和诱导血管生成性能方面无法忽视。图1-2 骨组织工程支架设计示意图40为了解决植入支架缺乏促进骨再生性能的问题，人们开始尝试将患者或供体各种具有成骨作用的细胞引入支架内，再将其植入（直接或体外培养后）缺损部位41, 42。第一个以细胞为基础的骨组织工程方法是使用未分离的新鲜自体或同系骨髓43-46。尽管移植新鲜骨髓在骨再生取得了一些成效，但全骨髓移植的成功与否完全依赖于植入祖细胞的数量是否足够充足。成人骨髓内的骨祖细胞约仅占有核细胞0.001%，并且衰老或疾病等原因也会导致健康骨髓成分的减少，故而这种方法在紧急情况下可能是最不适用的47。因此，能够筛选、扩增和应用祖细胞的技术将具有巨大的临床效益。各类细胞的提取分离和基因修饰技术的发现，使细胞疗法在骨缺损修复方向逐步飞跃13。但是，所有的细胞疗法都无法摆脱时间/成本密集的细胞扩增程序、相对较低的细胞存活率和较高的免疫排斥风险等缺点。基于因子的支架通过提供骨诱导刺激克服了这些限制。目前，与骨组织工程相关的生长因子可分为与炎症相关的肿瘤坏死因子、与成血管相关的血管内皮生长因子和与成骨相关的转化生长因子等48。此外，各种具有促进骨再生的药物也被广泛应用于骨组织工程中，如最具有代表性的地塞米松49。植物一直是许多传统药物体系的基础，并且仍然是新药开发重要来源，从植物资源中寻找新的植物化合物从未停止50。这些植物素主要可分为生物碱类、类胡萝卜素类、有机硫类、酚类和植物甾醇类51。与初级代谢物不同，酚类化合物不是植物生存所必需的。在酚类化合物中，黄酮类化合物含量最高，研究得最多。黄酮类化合物是植物酚类物质中最大的一类，占天然酚类化合物的一半以上，存在于水果、蔬菜、树皮、根、茎、花和谷物中52。白藜芦醇（Res）是一种含有二苯乙烯类结构的黄酮类多酚化合物，因其具有弱雌激素作用又称为植物雌激素53。大量文献报道，Res有益生物学作用，如抗衰老、抗氧化、抗肿瘤和抗炎作用54-57。近年来，研究还发现Res具有促进成骨分化和骨形成的作用58-61。例如，Choi 等人证实Res能够促进临界性颅骨缺损的骨再生62。此外，Zhao 等人发现Res促进成骨细胞形成呈剂量依赖性，浓度20 M达到最强促成骨作用63。此外，当Res浓度升高后便具有明显的抗肿瘤作用。例如，Wang 等人发现高浓度Res（IC50=72.06±7.85 g/mL）可以显著显抑制乳腺癌细胞的增殖64。Res的水溶性极低，仅有极少量的可溶于水（3 mg/100 mL）。因此，直接将Res加入GelMA内制作成骨缺损支架将面临释放速度过快和生物毒性大等缺点。目前，实现药物持续释放的一般方法是建立合适的药物释放体系65。药物释放系统在自然过程中与骨形成协调，从而控制药物因子按照骨再生过程释放。物理共混是因子支架制备最简单的方法，通过将具有成骨作用的生物因子与基础高分子材料混合，从而提高支架的骨诱导性能66。然而，其在动物体内的有效治疗剂量是生理剂量百倍，严重阻碍了其在人类临床的研究与发展。此外，由突释现象导致的异位成骨、水肿、骨愈合畸形等也是限制物理共混支架发展的另一因素67。高分子材料的表面改性是解决这一问题可行方法68, 69。通过嫁接将生长因子与高聚物以化学键连接，然后制备成所需的支架70, 71。例如，He 等人将BMP-2嫁接到水凝胶底物上，然后制备成水凝胶支架，发现BMP-2修饰后的水凝胶具有更明显的促成骨分化作用72。将生物大分子与纳米粒子结合，通过对纳米载体先进行表面共价接枝改性实现缓释作用是另一种可行的策略73。具体来说，就是通过将具有成骨作用的生长因子接枝到纳米载体上，再来用生长因子修饰后的纳米载体增强支架的性能，如优越的力学性能和骨整合和骨诱导性74。例如，Zhou 等人合成并氨基化了介孔二氧化硅（MSNs），然后将具有成骨作用的BMP-2通过氨基与羟基间的酰胺反应共价接枝到MSNs上，制备出BMP-2功能化的MSNs75。Shao 等人通过油酸将纳米羟基磷灰石进行改性，然后将油酸改性后的纳米羟基磷灰石与BMP-2以共价接枝，研究发现，接枝后的BMP-2具有明显的缓释作用，将其包封入水凝胶内并植入大鼠颅骨缺损部位，12 w后实验组大鼠颅骨缺损出现大量新生骨组织76。然而，无论是直接将生长因子接枝到支架上还是先接枝在纳米载体后再与支架结合，都无法回避嫁接率和副产物的产生等问题。此外，繁琐的制备工艺和苛刻的反应条件也限制了表面改性只能在小范围内应用77。将药物因子等物理包封或溶解在纳米载体内，是缓释药物的另一种新思路77, 78。微球是应用最广泛的载体之一，它可以将有机和无机分子以物理溶解、分散或通过共价相互作用的方式制备而成，因其独特的高载药能力和灵活多变的合成方法引起了人们广泛的关注79。Shen 等人发现，微球包封对生物活性物质的缓释作用更优于物理吸附和共价连接80。因此，将药物与纳米载体物理结合，再将其包封在支架内构建一个合适的药物释放体系，在骨缺损修复方向是一项很有前景的策略81。固体脂质纳米颗粒是一种新型的亚微米胶体载体，其包封药物的性质与微球相似，此外，还具有增强药物溶解度和提高生物利用度等诸多优点82, 83。由于这些特性，SLNs得到了越来越多的关注，并广泛应用于各个领域84-87。例如，Qushawy 等人制备了负载卡马西平的SLNs，发现卡马西平的抗惊厥作用受到增强88。Loureiro 等人报道，将Res和葡萄提取物封装到SLNs中可以增强细胞摄取，可用于阿兹海默病的治疗89。此外，SLNs还具有控制药物释放的作用83。然而，关于Res-SLNs促进成骨分化和骨形成的研究还未见报道。基于以上思路，本研究尝试采用高温乳化-低温固化法制备出Res-SLNs，将适量Res-SLNs包封于GelMA水凝胶内，制备出载有Res的SLNs/GelMA水凝胶支架，通过SLNs和GelMA的双重缓释实现促进骨缺损修复的作用。本研究拟从以下三个方面展开：1、筛选出最适促成骨作用的药物浓度；2、通过体外细胞实验，确定最佳浓度Res-SLNs/GelMA水凝胶支架；3、建立SD大鼠颅骨缺损模型，验证Res-SLNs/GelMA水凝胶支架在动物体内促进骨再生的效果。图1-3 实验总体思路示意图第一部分 水凝胶支架制备所需Res-SLNs的合成、表征以及最适作用浓度的确定一、材料与方法1. 材料1.1 实验动物3 w清洁级雄性SD大鼠，由合肥蜀山实验动物中心提供。所有实验过程完全依据蚌埠医学院动物伦理学标准执行。1.2 主要试剂及材料DMEM/F-12 培养基上海Biosharp公司特级胎牛血清 (Fetal Bovine Serum,FBS)美国Clark公司青霉素-链霉素双抗美国HyClone公司磷酸盐缓冲液 (Phosphate Buffered Saline, PBS)上海Biosharp公司胰酶美国Gibco公司异丙醇国药试剂二甲基亚砜 (Dimethyl Sulfoxide, DMSO)北京Solarbio公司成骨诱导培养基试剂盒广州Cyagen公司碱性磷酸酶染色试剂盒上海Yeasen公司茜素红S染色液 (1%, pH 4.2)北京Solarbio公司4% 多聚甲醛溶液上海Biosharp公司CCK-8试剂 (Cell Counting Kit-8)上海Biosharp公司白藜芦醇 (Resveratrol, Res)上海aladdin公司Polyoxyethylene (40) stearate (Myrj 52)美国Sigma公司硬脂酸上海Macklin公司蛋黄卵磷脂北京Solarbio公司氯仿国药试剂无水乙醇国药试剂Osteocalcin Antibody抗体江苏affinity公司Cy3conjugated Affinipure Goat抗体美国Proteintech公司RNA快速提取试剂盒上海捷瑞生物工程HiScript II Q RT SuperMix for qPCR南京诺唯赞生物公司ChamQTM SYBR Color Qpcr Master Mix南京诺唯赞生物公司1.3 主要仪器生物安全柜苏州净化设备公司细胞培养箱美国Thermo公司移液枪德国Eppendorf公司高速离心机德国Eppendorf公司倒置（荧光）显微镜日本Olympus公司Millipore Milli-Q ® system美国Bedford公司大容量超速离心机美国Beckman公司JEM-1230透射式电子显微镜日本JEOL公司光谱仪英国Malvern公司紫外分光光度计澳大利亚Varian公司X射线衍射仪德国Bruker公司液晶超声波清洗器昆山杰力美公司DF-101S集热式搅拌器江苏科析仪器公司搅拌器上海垒固仪器公司细胞培养瓶美国Corning公司细胞培养板美国Corning公司酶标仪美国BioTek公司冰箱青岛海尔公司水浴锅上海医用恒温设备厂恒温震荡箱上海福玛公司涡旋振荡仪海门其林贝尔仪器台式高速冷冻离心机湖南湘仪公司台式低速离心机湖南凯达实业公司恒温金属浴上海一恒仪器公司微光分光光度计美国 Merinton 公司定量 PCR 仪美国 BIO-RAD 公司低速自动平衡离心机湖南湘仪公司2. 方法2.1 Res-SLNs的制备Res-SLNs的制备采用高温乳化-低温固化法64, 83，具体步骤如下：200 mg Myrj 52溶于30 mL超纯水中制备成水相；200 mg硬脂酸、100 mg卵磷脂和150mg Res溶于10 mL氯仿制备成有机相；将水相溶液加入到100 mL三耳烧瓶内，75°C水浴预热5 min，打开搅拌器后，用6号注射器将预热后的有机相溶液缓慢注入到水相溶液内，75°C，1,000 rpm下搅拌40分钟；撤去水浴锅，将上述三耳烧瓶移至冰上，加入10 mL冰水（4°C超纯水），继续搅拌120 min；将烧瓶内溶液转移至离心管内，4°C，20,000 rpm离心10 min；倒去上清，10 mL冰水重悬后，再次离心60 min；重复上述；去除上清，适量冰水重悬后，转移至10 mL EP管内，-80°C过夜后冷冻干燥；冷冻干燥后，4°C保存用于后续试验。2.2 Res-SLNs的表征及体外缓释实验1) 对纳米粒的粒径分布和Zeta电位进行分析，具体步骤如下：称量2mg Res-SLNs超声溶于1 mL超纯水，0.22 um过滤后适度稀释，取2 mL溶液加入比色皿中，先检测粒径分布，然后将比色皿内的溶液加入到Zeta电位样品池，检测Res-SLNs的Zeta电位分布。其检测波长为635 nm，温度为25°C，散射角为90°。2) 对纳米粒的形态进行观察，具体步骤如下：用1%磷钨酸将同体积的纳米粒悬浊液进行染色，5 min后滴置于铜网上，室温晾干，于透射电镜（TEM）下观察形貌并拍照。3) 分析纳米粒的物质结构，具体步骤如下：分别取适量的Res标准品、冻干的SLNs、冻干的Res-SLNs，进行X-射线衍射（XRD）分析。其测试电压为40kV，电流为25mA,扫描角度为5°-80°。4) Res-SLNs载药率的测定。分别配制1.25, 2.5, 5, 10, 20 ug/mL的Res标准品乙醇溶液，紫外分光光度计校准和全波长扫描后，测试出各浓度Res在304 nm下的吸光度并绘制出标准曲线。准确称量适量Res-SLNs，破乳后，将所测吸光度代入标准曲线内计算出SLNs内Res浓度。并计算出Res-SLNs的载药率，公式如下：载药率(%) = CRes in Res-SLNs/CRes-SLNs×100%CRes in Res-SLNs为计算得到的Res的浓度，CRes-SLNs为Res-SLNs的浓度。5) Res-SLNs体外释放实验。准确称量适量Res-SLNs配成1 mg/mL溶液，取2 mL加入Spectra/Por 透析管（透析分子量8-10 kD）中，密封后放入含1 L PBS溶液的烧杯中。再将烧杯放入37的摇床中（震摇速率为100 rpm），开始计时为0。在设定的时间点（即1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 h）取出透析管并精密吸取100 L溶液。向上述100 L溶液中加入无水乙醇并定容至2 mL，充分震摇裂解SLNs，再以1.5×104 rpm高速离心后取上清，测出吸光度值，并带入4)内的标曲中计算出Res浓度。重复3次，并绘制出体外释放曲线。2.3 SD大鼠BMSCs的原代培养SD大鼠BMSCs从3 w SD大鼠的骨髓中分离获得，具体操作步骤如下：脊椎脱臼处死大鼠，75%乙醇浸泡5 min，分离出双侧股骨和胫骨，剃净附着组织；PBS洗涤2次，剪刀剪开暴露骨髓腔，随后用注射器抽吸适量DMEM/F12完全培养基冲洗骨髓腔；移液器吹打冲散细胞，200目滤网过滤后，37°C、5%CO2的培养箱中培养；48 h后全换液，以后每3 d换液，融合度达80%胰酶消化传代。第2-3代BMSCs用于本实验。2.4 SD大鼠BMSCs多向分化潜能2.4.1 成骨诱导分化BMSCs成骨诱导过程中可能会出现漂浮现象，故对成骨分化所使用的6孔板进行明胶包被。简而言之，将适量0.1%明胶加入到6孔板中，摇匀覆盖整个板底后静置30 min，随后弃去明胶并晾干。参照成骨诱导分化培养基试剂盒诱导分化。在诱导21 d时，行茜素红S (ARS)染色,具体步骤如下：固定、洗涤样本，每孔加入800 uL茜素红染液，室温孵育5 min，随后PBS洗涤后，在显微镜下观察拍照。2.4.2 成脂诱导分化参照成脂诱导分化培养基试剂盒诱导分化20 d后，用4%多聚甲醛溶液固定，油红O染料工作液染色30min。PBS小心冲洗2-3次，显微镜下观察拍照。2.4.3 成软骨诱导参照成软骨诱导分化培养基试剂盒诱导分化28 d后，将软骨球用4%多聚甲醛固定，20%蔗糖脱水24 h，30%蔗糖脱水至沉底，OCT包埋冷冻，然后用冰冻切片机切成8 m的切片。切片脱水，阿利辛蓝染液染色30 min，自来水冲洗2 min，蒸馏水冲洗，显微镜下观察并拍照。2.5 细胞活性实验为了评估Res和Res-SLNs对于BMSCs的细胞毒性作用，我们分别采用了活/死细胞染色和CCK-8实验。活/死细胞染色：将BMSCs按1×105 个/孔种植于6孔板中，24 h后更换成2 mL含不同浓度Res和Res-SLNs的培养基。在培养3 d时，参照Calcein-AM/PI 活细胞/死细胞双染试剂盒进行染色，荧光显微镜下观察细胞并拍照。CCK-8实验：将BMSCs按5×103 个/孔种植于96孔板中，24 h后更换成200 uL含浓度分别为0, 0.1, 1, 5, 10, 20 M Res和Res-SLNs的培养基（9 ug/mL的SLNs作为空白对照）。在培养3 d时，参照CCK-8试剂盒测出吸光度值，并计算出细胞活性，公式如下：细胞活性(%) = (OD实验OD空白)/(OD对照OD空白)×100%2.6 不同浓度Res-SLNs促进BMSCs成骨分化实验成骨诱导分化过程中所用6孔板均为上2.4.1成骨诱导所述经明胶包被处理后的孔板。2.6.1 ALP染色按2.4.1 成骨诱导分化所示种植BMSCs，待细胞汇合度达80-90%后，将DMEM/F12完全培养基更换成2 mL含不同浓度的Res和Res-SLNs的成骨诱导培养基，此后，每3 d换液。继续诱导7 d后，参照ALP染色试剂盒染色后，在显微镜下观察染色结果并拍照。2.6.2 ARS染色BMSCs的种植和诱导过程同2.6.1。在诱导21 d时，行ARS染色，步骤同2.4.1。2.7 Res-SLNs上调成骨相关基因表达2.7.1 OCN免疫荧光染色BMSCs的种植和诱导过程同2.6.1。在诱导21 d时，行OCN免疫荧光染色。简而言之，样本经固定、透膜和1%BSA封闭后，加入OCN一抗，4°C过夜，随后加入Cy3二抗室温孵育2 h，最后加入DAPI避光孵育15 min，荧光倒置显微镜下观察并拍照。2.7.2 RT-qPCRBMSCs的种植和诱导过程同2.6.1。在诱导21 d时，行RT-qPCR检测。简而言之，先用RNA提取试剂盒提取RNA，随后测定所提RNA纯度并定量：以相应溶剂为对照(Blank)，取2 L RNA溶液于Merinton SMA4000检测，观察A260/A280、A260/A230比值及连续波长吸收峰，并计算RNA溶液浓度，判断RNA提取质量：A260/A280>2.0且<2.3，则可以满足后续RT-qPCR所需。然后在冰上配置RT反应液：5 × HiScript® II qRT SuperMix, 4 l+ Total RNA, 1000 ng+ RNase Free dH2O, up to 20 l。随后进行反转录，步骤如下：混匀，短暂离心，50干浴15 min；85，2 min终止反应；-20保存cDNA。之后进行定量PCR扩增，qPCR 实验参数具体如下：95.0 for 30s；95.0 for 10s；60.0 for 30s Plate Read；GOTO 2, 40 reps；Melt Curve 70 to 95 : Increment 0.5 for 5s Plate Read。最后，采用2-CT法计算各组基因的相对表达量。引物序列如下：GeneForward primer sequence (5-3)Reverse primer sequence (5-3)ACTINCCCATCTATGAGGGTTACGCTTTAATGTCACGCACGATTTCALPGGACCCTGCCTTACCAACTCGTGGAGACGCCCATACCATCOCNCTCAACAATGGACTTGGAGCCGGCAACACATGCCCTAAACGPCR 扩增反应体系：试剂名称用量2×ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix10 LForward primer, 10 µM0.6 LReverse primer, 10 µM0.6 LTemplate cDNA8.8 LddH2OTo 20 L2.8 统计分析所有数据均采用SPSS 20.0软件进行分析，以均值±标准差（M±SD）表示。多组间的比较使用单因素方差分析，然后使用图基（tukey）事后检验法。p<0.05有显著性差异。二、实验结果1. Res-SLNs的表征1.1 TEM利用TEM观察到Res-SLNs的弥散球形轮廓，呈单个分散且没有聚集现象（图2-1 A）。1.2 XRD图谱利用XRD技术确定了Res、SLNs和Res-SLNs的XRD图谱。如图2-2 B所示，Res的XRD图谱显示了分别为16.39°、19.22°、22.44°和25.34°的不同2值峰，表明Res具有高度的晶体结构。在Res-SLNs谱图中也观察到类似的峰，说明Res被成功封装到SLNs中（图2-1 B）。1.3包封率和体外药物释放曲线利用紫外分光光度计对Res-SLNs的载药率及药物释放进行测定，结果显示，Res-SLNs的载药率为33.5± 1.2%。Res-SLNs的累积释放百分比如图所示，在12 h时观察到一个约17%的爆发性释放，随后释放逐渐放缓，在7 d时，释放总量达到60%，表明SLNs包封Res后具有缓慢释放作用（图2-1 C）。1.4 光子相关光谱分析激光粒度分析仪显示，SLNs的平均粒径为140± 38.9 nm (PDI= 0.31± 0.01)，Res-SLNs为150± 54.5 nm(PDI= 0.23± 0.01)。SLNs和Res-SLNs的zeta电位分别为-37.3± 0.89和-25.7± 0.98 mV（图2-1 D、E）。图2-1 Res-SLNs的表征A: Res-SLNs的透射电镜图；B: Res、SLNs和Res-SLNs的X-射线衍射图谱；C: Res-SLNs体外药物释放曲线；D: SLNs（上）和Res-SLNs（下）的粒径分布图；E: SLNs（上）和Res-SLNs（下）的Zeta电位图。2. BMSCs的培养及干性鉴定结果对提取的BMSCs进行消化、离心、重悬、传代培养至P2代，倒置显微镜下观察细胞形态，可见BMSCs细胞膜清晰，细胞呈长梭形，整体呈鱼群样、旋涡状排列（图2-2 A）。体外成骨诱导21 d后，ARS染色后可以看到有大量红染的矿化钙结节（图2-2 B）。体外成软骨诱导21 d后，阿利辛蓝染色后可以看到BMSCs细胞及周围外基质呈不同程度的蓝色（图2-2 C）。体外成脂诱导21 d后，油红O染色后可以看到BMSCs细胞内有大小不等的红染圆形脂滴（图2-2 D）。BMSCs三系分化结果表明本实验所提取细胞为BMSCs。3. 细胞活性实验为了评估Res和Res-SLNs对于BMSCs的细胞毒性，我们将BMSCs培养在含在不同浓度Res和Res-SLNs的完全培养基内，3天后进行活/死细胞染色。结果如图2-3 A显示，各组内的死细胞（红染）数量无明显差异，表明本实验所用浓度的Res和Res-SLNs并没有增加BMSCs的凋亡。此外，我们为了评估细胞毒性进行了CCK-8实验，结果显示，低浓度（< 10 M）的Res组与0 M Res组间BMSCs的细胞活性无明显差异，而当Res的浓度达到20 M时，BMSCs活性显著降低。然而，在各Res-SLNs组间，20 M浓度对BMSCs的细胞活性无影响（图2-3 B）。图2-3 Res和Res-SLNs对BMSCs活性的影响A: 活/死细胞染色; B: CCK-8实验。*表示P0.05。4. 成骨分化4.1 ALP染色在成骨诱导培养基中加入不同浓度的Res和Res- SLNs培养7 d后，使用ALP染色检测了早期成骨标志物ALP活性(图2-4 A)。结果表明，Res的加入增加了ALP染色强度，并呈浓度依赖性，浓度在10 M时达到最大值，然后逐渐减小。Res-SLNs组的趋势与Res组相同，而最佳浓度为极低剂量(1 M)。通过对ALP染色面积的定量分析，进一步验证了这些结果(图2-4 C、D)。结果表明，Res具有促进BMSCs内ALP表达的作用，呈剂量依赖性，其最佳浓度为10 M，而Res-SLNs对BMSCs内ALP表达的促进作用更强，其最佳浓度仅为1 M。4.2 钙沉积成骨诱导分化21 d后，采用ARS染色观察钙沉积。结果显示，与0 M Res处理的细胞相比，1、5、10 M Res处理的BMSCs组内矿化结节增多(图2-4 B)。定量分析表明，当Res浓度达到10 M时，矿化结节的面积最大(图2-4 E)。与0 M SLNs组相比，Res-SLNs各组内矿化结节明显增多。此外，ARS染色定量分析显示，矿化结节面积呈Res-SLNs浓度依赖性增加，浓度在1 M时其增强作用达到最大，随后缓慢减弱(图2-4 F)。细胞活力实验、ALP染色和ARS染色结果表明，Res-SLNs最有效浓度为1 M。因此，该浓度被用于后续的基因表达定量检测。图2-4 不同浓度Res和Res-SLNs对BMSCs成骨分化的影响A: ALP染色；B: ARS染色；C、D: ALP染色相对阳性面积定量分析；E、F: ARS染色相对阳性面积定量分析。*表示P<0.05。5. 基因表达采用免疫荧光染色法检测成骨分化晚期标志物之一的OCN的表达。结果显示，Control组OCN表达极低，Control组与SLNs组无明显差异(图2-5 A)。而Res组和Res-SLNs组的免疫荧光水平均高于Control组和SLNs组。此外，Res-SLNs组OCN的表达明显高于其他各组(图2-5 B)。表明，在培养14天后，将Res加载入SLNs中可以显著增加Res上调的OCN表达。采用RT-qPCR方法进一步研究Res-SLNs对BMSCs成骨分化相关mRNA表达的影响。SLNs组OCN基因的表达与Control组相似，说明SLNs的加入并不影响OCN基因的表达(图2-5 C)。Res组和Res-SLNs组内OCN基因表达量分别比Control组高2倍和2.6倍。ALP基因的表达也有相同的趋势。值得注意的是，Res组和Res-SLNs组的表达量分别比对照组高1.9倍和5.9倍(图2-5 D)。表明， Res-SLNs可显著增强Res上调的ALP和OCN基因mRNA表达。图2-5 Res-SLNs促进成骨基因的表达A: OCN免疫荧光染色；B: OCN免疫荧光强度定量分析；C: OCN基因的RT-qPCR；D: ALP基因的RT-qPCR。*表示P<0.05。三、本章小结材料表征结果表明，我们通过高温乳化-低温固化的方法成功地将Res加载入SLNs内，合成出了Res-SLNs，并且，SLNs的包裹具有缓释作用。随后，通过细胞活性试验确定了合适的实验药物浓度。并用含有不同浓度Res和Res-SLNs的成骨诱导培养基培养BMSCs，之后，采用ALP染色、ARS染色、OCN免疫荧光染色和RT-qPCR方法评价其对成骨分化的影响。我们发现10 M 是Res促BMSCs成骨分化的最佳浓度，而Res-SLNs具有增强Res药物效率的作用，仅需1 M的浓度，Res-SLNs就能达到最佳促成骨分化效果。第二部分 不同浓度的Res-SLNs/GelMA水凝胶支架的制备、表征以及体外促进BMSCs成骨分化的作用一、材料与方法1. 材料1.1 实验动物3 w清洁级雄性SD大鼠，由合肥蜀山实验动物中心提供。所有实验过程完全依据蚌埠医学院动物伦理学标准执行。1.2 主要试剂及材料甲基丙烯酰化明胶（GelMA-90）江苏EFL公司1.3 主要仪器蓝光紫外灯江苏EFL公司Gemini 300高分辨扫描电镜德国ZEISS公司JY-82接触角测定仪承德鼎盛公司5982万能材料试验机美国INSTRON公司单反相机日本CANON公司2. 方法2.1不同浓度的Res-SLNs/GelMA水凝胶支架的制备本部分实验分为6组，分别为GelMA组、SLNs/GelMA组、0.01Res-SLNs/GelMA组、0.02Res-SLNs/GelMA组、0.04Res-SLNs/GelMA组和0.08Res-SLNs/GelMA组。准确称量1.6 mg Res-SLNs，紫外照射5 min，超声溶于100 uL PBS内，稀释配成不同浓度为1、2、4、8 mg/mL的Res-SLNs溶液。分别取上述Res-SLNs溶液100 uL加入至10%含光交联剂的GelMA内，超声混匀形成不同浓度为0.01、0.02、0.04、0.08 wt%Res-SLNs/GelMA混合溶液。Control组和SLNs/GelMA组分别为100 uL PBS+10%GelMA和100uL 5mg/mL SLNs+10%GelMA。紫外（83 mW/cm2, 405 nm）照射30 S上述溶液即可引发光交联，得到所需水凝胶支架。所有水凝胶支架制备完成后，都在细胞培养箱内PBS浸泡12 h后使用。2.2 水凝胶支架的表征2.2.1 扫描电镜2.2.2 杨氏模量将不同水凝胶制备成15×15×2 mm的薄片，冷冻干燥后置于接触角测量仪检测区，将去离子水滴滴于水凝胶表面，15 S后读取图像。2.2.3 药物释放曲线2.3 水凝胶支架的细胞毒性实验2.3.1活/死细胞染色分别将1 mL水凝胶预交联溶液加入到6孔板内UV照射交联，PBS浸泡12 h后，将2 mL完全培养基（含1×105个BMSCs）加入至各孔内。培养72 h后，行活/死细胞双染染色，方法同第一部分2.5。2.3.2 CCK-8实验首先，分别将100 uL水凝胶预交联溶液加入到96孔板内，UV照射交联后，PBS浸泡12 h。随后，将BMSCs 以5×103/孔种植到各孔水凝胶支架上，并每孔添加100 uL完全培养基。24 h和72 h后，行CCK-8检测。具体步骤同第一部分2.5。2.4 水凝胶支架促进BMSCs成骨分化实验我们分别检测了BMSCs成骨早期的标志物ALP和成骨晚期标志物钙结节的表达量以评估水凝胶对BMSCs成骨分化的影响。按上述2.3方法制备两块含不同水凝胶支架的的6孔板，每孔种植2×105个BMSCs，在37°C、5%CO2培养箱内培养24 h。然后，将DMEM/F12完全培养基置换成成骨诱导分化完全培养基，继续诱导分化培养，并且每3 d置换一次诱导培养基。2.4.1 ALP染色成骨诱导分化7 d时，行ALP染色，步骤同第一部分2.6.1。2.4.1 ARS染色成骨诱导分化14 d时，行ARS染色，步骤同第一部分2.6.2。2.5 水凝胶支架促进BMSCs成骨分化基因表达研究制备水凝胶孔板及细胞种植诱导同第二部分2.4。2.5.1 OCN免疫荧光染色成骨诱导分化14 d时，行OCN免疫荧光染色，步骤同第一部分2.7.1。2.5.2 RT-qPCR成骨诱导分化14 d后，消化、离心细胞，并进行RT-qPCR检测水凝胶支架对BMSCs成骨分化相关基因ALP、OCN、Runx2及OPN的mRNA表达的影响。RT-qPCR方法同第一部分2.7.2。引物序列如下：GeneForward primer sequence (5-3)Reverse primer sequence (5-3)ACTINCCCATCTATGAGGGTTACGCTTTAATGTCACGCACGATTTCALPGGACCCTGCCTTACCAACTCGTGGAGACGCCCATACCATCOCNCTCAACAATGGACTTGGAGCCGGCAACACATGCCCTAAACGRunx2CCGAGACCAACCGAGTCATTTAAAGAGGCTGTTTGACGCCATOPNCCAGCCAAGGACCAACTACAAGTGTTTGCTGTAATGCGCC2.6 统计学分析同第一部分2.8。二、 结果1. 材料表征1.1 SEM1.2 杨氏模量1.3 药物释放曲线2. 水凝胶支架对BMSCs细胞活性的影响如图3-2 A所示，SLNs/GelMA组和GelMA组两组间红染的死细胞和绿染的红细胞数量上无明显差异，表明SLNs的加入对BMSCs活性无影响。与GelMA组相比，Res-SLNs/GelMA各组死细胞数量无明显差异，而0.08Res-SLNs/GelMA组内活细胞数量明显减少（图3-2 B）。表明低浓度Res-SLNs加入水凝胶支架对BMSCs无明显毒性，当浓度达到0.08 wt%时，BMSCs的增殖受到抑制，但对BMSCs的凋亡无影响。CCK-8