基因工程抗体的研究 .docx

基因工程抗体的研究王凯瑜（东北农业大学）摘要：免疫学自诞生以来便一直是生物科学界的研究热点，其在医学临床等领域有着重要的应用，如免疫预防，免疫治疗和免疫诊断等。免疫学的研究对人类社会的发展做出了重要的贡献。近年来，随着基因工程技术的发展，免疫学的研究也取得了新的突破，对基因工程抗体，基因工程疫苗，基因工程细胞治疗等研究的深入，使免疫学研究进入了新的阶段。抗体分子作为免疫学研究的核心之一，在基因工程等技术的改造下，产生了新的价值。通过基因工程等技术，对抗体分子进行改造，优化了许多传统抗体分子应用的弊端，提高了抗体分子应用的水平和效率，具有广阔的发展前景。但有些新技术也存在问题，需要逐步完善优化才可广泛使用，本文对基因工程技术在抗体分子研究领域的应用，存在的问题及发展前景等方面进行了综述。关键词：基因工程抗体，免疫学，人源化技术，抗体药物Study On Genetically Engineered AntibodyWANG Kai-yu（Northeast Agricultural University）Abstract: Immunology has been a research hotspot in bioscience since its birth. It has an important application in the field of clinical medicine, such as immunoprophylaxis, immunotherapy and immunodiagnosis. Immunology research has made an important contribution to the development of human society. In recent years, with the development of genetic engineering technology, immunology research has also made new breakthroughs. With the in-depth study of genetic engineering antibody, genetic engineering vaccine, and genetic engineering cell therapy, immunology research has entered a new stage. As one of the core of immunology research, antibody molecules had new value under the transformation of gene engineering and other technologies. Through genetic engineering and other technologies, the antibody molecules were modified to optimize the disadvantages of many traditional antibody molecules, improve the level and efficiency of the application of antibody molecules, and have broad prospects for development. However, some new technologies also have some problems that need to be gradually improved and optimized before they can be widely used. This article reviews the application of genetic engineering technology in the field of antibody molecule research, existing problems and development prospects.Keywords: Genetically engineered antibodies; Immunology; Humanized technology; Antibody drugs引言抗体(antibody)是免疫系统中重要的免疫分子，可以识别并特异性结合抗原，具有中和毒素，阻止病原体入侵，激活补体系统产生膜攻击复合体破坏靶细胞，调理吞噬细胞以及介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)等重要免疫功能。自1975年，Kohler等1建立了B淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体(Monoclonal antibody,McAb)技术，利用该技术可获得大量特异性很高的抗体，使免疫学得到了很大的发展，该技术可广泛用于疾病的诊断与治疗等研究中。但是单克隆抗体本身的性质限制了它的临床应用，如：由于人-人单克隆抗体杂交瘤技术不成熟2，应用于临床的鼠源性单克隆抗体对人具有抗原性，且会引起人抗鼠抗体反应(human anti-mouse antibody reaction;HAMA reaction)3，此外产生的单克隆抗体分子量过大，难以通过血脑屏障，胎盘等结构。随着分子生物学的发展，基因工程技术取得重要突破，对免疫学的研究产生了重要的影响。80年代，科研人员通过DNA重组技术，对已有的单克隆抗体基因进行改造获得了人源化程度高，分子量小且特异性高的抗体，使抗体技术更好的为人类服务。现已通过基因工程技术构建出人源化抗体及全人抗体，使其抗原性显著降低，更有利于临床应用；在抗体类药物的研究方面也取得了巨大的突破，双特异性抗体，融合蛋白等改造抗体，因具有较高特异性及较强的亲和力而被广泛研究及应用；此外，噬菌体展示技术及核糖体展示技术的开发并应用于蛋白质类药物的筛选，抗体作用的研究，医学诊断和治疗等领域也显示了良好的成效。1 基因工程抗体1.1 嵌合抗体(chimeric-antibody)嵌合抗体的基因是由鼠源性抗体的V 区基因与人抗体的C 区基因拼接而成，将连接后的基因构建相应载体，转染骨髓瘤细胞，获得分泌人-鼠嵌合抗体的骨髓瘤细胞。该类抗体人源化程度达到70，是通过基因工程技术最早制备成功的抗体。1984年，Morrison等4-5在前人研究的基础上，创立了人-鼠嵌合抗体技术,通过该方式获得的人-鼠嵌合抗体保留了原鼠单克隆抗体的高特异性和亲和力，减少了鼠源成分，从而降低了鼠源性抗体引起的不良反应，且其人源Fc片段能有效介导ADCC等生物学效应，还具有操作相对方便，以及可根据不同需要选择性变换多种亚型等优点。目前，该类抗体已在抗肿瘤，治疗类风湿性关节炎，以及器官移植的抗排斥治疗中应用广泛，其中由美国FDA批准的主要应用于治疗非霍奇金淋巴瘤(NHL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、和类风湿性关节炎(RA)等疾病的Rituxan(rituximab)嵌合抗体比较典型，此外还有Erbitux(cetuximab),Simulect等嵌合抗体也较为常见6-7。但该类抗体鼠源性仍然高达30，仍会诱发HAMA反应，临床应用与研究仍然受限。1.2 改型抗体改型抗体又叫CDR移植抗体(complementary determination region antibody), 是利用基因工程技术，将人抗体可变区（V）中互补性决定区（CDR）的氨基酸序列换成鼠源单抗CDR序列，该抗体的3个互补决定区(CDR)为鼠源性成分，而骨架区(FR)等为人源性成分，在嵌合抗体的基础上进一步减少鼠源性成分，使该抗体的人源化程度达到90%以上，该类抗体被应用于癌症等疾病的治疗取得了较显著的成效。我国食品药品监督管理局(SFDA)在2008年批准上市的由我国百泰生物药业二次开发的CDR移植抗体-泰欣生（尼妥珠单抗注射液），人源化程度达到95%，该类抗体联合放疗、化疗等对治疗神经胶质瘤，胰腺癌，食道癌，肝癌等实体瘤具有较高的临床价值8。但由于该类抗体仍未完全解决鼠源性成分的抗原性问题，CDR移植常导致抗体分子亲和力下降，且该操作不具有普遍性等缺点，限制了该类抗体的发展9。1.3 小分子抗体1.3.1 Fab及F(ab)2 片段 Fab 片段( fragment with antigen binding，Fab) 由完整轻链和重链的VH 与CH1构成，其大小仅为完整抗体的1/3，通过基因工程技术将轻链和重链可变区分别与人抗体的 链和重链CH1重组，获得重组Fab,该类抗体分子量小、亲和力高、抗原性低, 在生物治疗领域可用于导向药物显影和靶向生物治疗剂等。目前已有多个片段药物获得FDA批准上市。如作为冠状动脉导管插术时预防心肌缺血的辅助用药的阿昔单抗( abciximab，ReoPro)；治疗黄斑变性的兰尼单抗( lucentis)以及治疗克罗恩病和风湿性关节炎的阿昔单抗（abciximab，ReoPro）等。F(ab)2是由两个Fab片段通过铰链区相连形成的小分子抗体在临床常用于放射免疫治疗，Cheng等10利用基因工程技术,将抗肿瘤的糖蛋白F(ab)2片段与放射性元素125I/131I连接构建了耦联蛋白CC49,该抗体具有较高亲和力，具有较强的定位肿瘤的能力。1.3.2 单链抗体单链抗体（single chain antibody fragment，scFv），是利用基因工程技术，将抗体重链可变区和轻链可变区通过1520个氨基酸的短肽连接而成的抗体，是具有抗体活性的最小功能单位11。该类抗体的分子量仅为完整抗体的1/6，具有分子量小、穿透力强、抗原性弱等明显优势，scFv能较好地保留其对抗原的亲和活性，可分别在胞内，胞外表达也可以融合蛋白形式表达，且其在体内循环的半衰期短，易清除。单链抗体在生物医学中较广泛用于靶向治疗，利用重组技术将单链抗体(scFv)与白细胞介素-2(IL-2),蓖麻毒素，肿瘤坏死因子(TNF)和干扰素(IFN)等毒性蛋白或细胞因子融合,形成免疫毒素等特异性杀伤靶细胞。此外，该类抗体在生物检测、诊断方面也具有显著优势，它具有分子量小，穿透力强，在组织中分布指数高的特点，且其携带的放射性核素在体内排出快，常用于肿瘤的显像定位诊断12。1.3.3 纳米抗体和分子识别单位1.3.3.1 纳米抗体纳米抗体又称为单域抗体（VHH），由一个重链可变区组成,其抗原结合区为与铰链区相连的Fc区单结构域,其分子量约为完整抗体的1/10。VHH具有良好的亲和力，且具有高度水溶性和稳定性，使其在胃液和内脏等器官中仍保持抗原结合活性，通过基因工程技术，对人源抗体VH结构域FR2中的一些氨基酸进行VHH特征性改造,可得到单域VH抗体。VHH抗体可结合一些常规抗体无法结合的抗原表位。并可进入酶的活性部位及细菌或病毒表面受体裂缝中，可以利用该特点设计酶的抑制剂、受体的激动剂或拮抗剂等，由于该类抗体分子量很小可穿过血脑屏障等结构，在治疗神经性疾病和脑肿瘤等疾病方面具有广阔发展前景。纳米抗体也可制成抗体芯片用于临床疾病标志物的检验13。1.3.3.2 分子识别单位分子识别单位( molecularrecognition unit，MRU)是由单个互补决定区组成的小分子抗体片段，分子量约为完整抗体的1/80-1/70，可结合抗原，且具有分子量小、穿透力强、半衰期短、显像时本底低等优点，在临床诊断中具有潜在的应用前景。可通过基因工程手段获得。1.4 全人抗体 分子生物学的发展是全人抗体的获得成为可能。目前，转人抗体基因小鼠和噬菌体展示技术为获得该类抗体的方式。近年来，基因编辑等技术取得了重大突破，转基因动物方面的研究也逐渐深入，通过转基因动物获得全人抗体有几种不同的方式。其中一种方式是，将已产生免疫反应的供体患者的淋巴细胞，导入严重联合免疫缺陷小鼠，使其作为人的免疫系统，暂时发挥功能14。此后，通过杂交瘤技术获得产人抗体的细胞。但此方法存在无法选择具有针对性的抗原，以及该系统作用必须依赖已产生免疫效应的供体细胞等自身缺陷，而使其应用及发展受限。另一种较为常见的获得全人抗体的方式为利用基因编辑技术，将小鼠的抗体基因敲除，并转入人的抗体基因片段，从而创造出具有人抗体基因簇而自身抗体基因失活的转基因小鼠。该类小鼠被称为（Human antibody mouse,HuMab）,该类抗体特异性高，亲和力好，且可有效进行同种型转换，使抗体免疫治疗的安全性得到很大的提高广泛用于癌症及一些慢性病的治疗15。在此基础上，又发展出了转人染色体小鼠16，这种小鼠基因组携带了从人染色体上分离的含有全部人抗体重链和轻链胚系基因簇的染色体片段，这种抗体在更加与人体内基因环境相近的条件下产生，更加有应用价值和安全性。1.5 其他抗体 在小分子抗体的基础上进一步对其进行改造和修饰，改善其亲和力、免疫原性及效应。构建更高级更复杂的抗体分子，使抗体具有更高的利用价值。上文中在有些抗体的应用方面已提到以下某些抗体类型。1.5.1 双特异性抗体双特异性抗体抗体（bispecific antibody,BSAB）为具有两个特异性抗原结合位点的人工抗体，通常一个与靶细胞抗原表位结合，另一个与免疫细胞（如淋巴细胞，中性粒细胞，单核巨噬细胞等）结合，产生导向性的效应功能。可通过化学交联，细胞工程，基因工程等方式获得17。该类抗体靶向性好，主要用于肿瘤的免疫治疗。Michaelson 等18将抗LTR 的ScFv 片段融合于抗TRAIL-R2 单抗的重链端，设计了同时以TNF家族膜受体TRAIL-R2 和LTR 为靶点的IgG 样BsAb。此类抗体半衰期长，体外实验证明，该双特异性抗体两端均具有抗肿瘤细胞的能力，且有较强的的药效，可显著地缩小肿瘤体积。Rossi等19构建了基因工程人源化6 价抗CD20 /22 的BsAb20-22和22-20。它们无需第二抗体交联即可诱导肿瘤细胞凋亡和抑制其增殖，它们具有更强的杀伤淋巴瘤细胞的功效，且对同体正常B细胞的作用较弱。1.5.2 抗体融合物抗体融合物是利用基因工程技术将小分子抗体与生物活性蛋白，如：毒素，细胞因子，酶类，放射性标记抗体片段甚至化疗药物以及核酸（反义寡核苷酸，小RNA）等融合或耦联，而形成的抗体融合物，提高靶向治疗的效果。其中，将抗体片段与细菌或植物毒素连接,可使其具有特异性的识别肿瘤细胞的功能, 并利用毒素来杀伤肿瘤细胞；Di Paolo等20，将人源化的抗Ep-CAM的单链抗体4D5MOCB与绿脓假单胞外毒素A融合,形成Ep-CAM特异性重组免疫毒素，其可定位在Ep-CAM阳性的肿瘤细胞, 并能抑制肿瘤细胞在裸鼠体内的生长,具有良好的应用前景。可将抗体片段与白细胞介素（IL-2,IL-12）或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）等细胞因子结合形成成融合蛋白,细胞因子可激活某些免疫细胞，从而增强免疫效应，靶向杀伤肿瘤细胞，DeBruyn等构建了两种融合蛋白 anti-CD3：trai和 K12：TRAIL，它们均可提高T细胞抗肿瘤活性，并延长移植瘤小鼠的寿命。此外“生物导弹”治疗将抗体 片段与“弹头”药物（放射免疫耦联物，化学免疫耦联物，免疫毒素等）相连接，具有特异性高、性质均一等特点，可特异性杀伤肿瘤细胞，对正常组织损伤小，且作用持久。CA125耦联放射性核素，在治疗卵巢癌研究以及临床方面已取得较大进展21。许多抗体耦联药物也在广泛被开发，有些已进入临床III期试验阶段，具有广阔的发展前景22。1.6 抗体库1.6.1 噬菌体抗体库技术 抗体库技术是基于分子生物学方法建立的，噬菌体抗体库技术和核糖体展示技术是抗体库筛选技术的主要手段。20世纪80年代Smith23，发现了可以体外表达并显示目的基因的噬菌体展示技术。噬菌体抗体库（phage antibody library）是由B淋巴细胞全套抗体可变区基因克隆并组装成的噬菌体群体24。该技术依赖于PCR技术，DNA重组技术，及噬菌体表面呈现技术的发展。该技术的基本原理为通过PCR等技术克隆全套抗体可变区基因，利用基因工程等技术将克隆的基因片段插入到噬菌体编码衣壳蛋白的基因中，抗体Fab片段或单链抗体等可以与噬菌体衣壳蛋白形成融合蛋白，从而在噬菌体表面展示，建立噬菌体抗体文库。通过该技术可获得大量人源化抗体，且该技术具有操作简单，周期短等优点，广泛用于药物筛选25，以及抗体，酶类，激素等蛋白的制备，并且通过该技术可获得普通方法无法获得的抗体，在动物疾病的预防，诊断，治疗等领域具较大发展空间26-27。但该技术也具有库容不足，蛋白质无法正确修饰等缺点。1.6.2 核糖体展示技术核糖体展示技术28-29（ribosome display,RD）是一种完全在体外合成蛋白质分子，并进行选择与进化的技术。其主要原理为利用PCR技术扩增目的基因，在该过程同时引入启动子，核糖体结合位点，茎环等结构，随后转入耦联转录/翻译的无细胞翻译系统中进行孵育，形成“mRNA-蛋白质-核糖体”三元复合体，从而目的基因的翻译产物展示在核糖体标面30。该系统库容大，可以更容易的筛选到目标分子，且具有表达分子范围广泛，及效率高，周期短等优点。此后又发展出了mRNA展示技术（mRNA display），也称RNA多肽融合技术或体外病毒技术，该系统将mRNA分子与其所编码的多肽利用嘌呤霉素分子联结，形成mRNA-DNA-嘌呤霉素分子文库，类似于核糖体展示技术，可在体外翻译。2 基因工程抗体的应用基因工程抗体是在单克隆抗体基础上逐渐发展而来的，其在生物，医学等领域的基础研究及临床应用更为广泛更具针对性，在疾病的检测，预防以及治疗等方面已取得显著成效，其中抗体类药物开发的研究较为广泛，包括治疗癌症，自身免疫病，神经性疾病，感染性疾病，以及抗移植排斥及抗凝血等，其中部分药物已批准使用，部分药物已进入临床试验阶段。2.1 抗肿瘤 基因工程抗体类药物广泛用于癌症治疗。因其具有特异性，靶向性，较长的半衰期及独特的生物学效应等优点，使其治疗肿瘤具有显著效果。如双特异性抗体，融合蛋白等基因工程抗体分子广泛用于淋巴瘤，肝癌，卵巢癌，及消化道癌的治疗。2.2 抗自身免疫病 在深入了解各种免疫反应的基础上，设计针对引起自身免疫病的免疫反应的基因工程抗体，如构建针对炎性因子，细胞因子等的释放及降解的抗体分子，抑制过度免疫应答，从而缓解自身免疫病,已应用于类风湿性关节炎及系统性红斑蓝疮等疾病的治疗31。此外具抗凝血及抗移植后免疫排斥的抗体也在研究发展中。2.3 抗病毒感染抗体分子经基因工程改造后具有特异性强，亲和力高，分子片段小通透性强，且半衰期长等特点，耦联毒素，酶类等蛋白的基因工程抗体，在病毒性疾病如呼吸系统病毒感染，肝炎，艾滋病，狂犬病等疾病的预防和治疗中显示了极大优势32。3 基因工程抗体存在的问题3.1 抗体的免疫原性随着基因工程技术的发展从嵌合抗体，改型抗体到小分子抗体等，改造的抗体分子人源化程度不断提高。但因其产生在老鼠等异种生物体内，产生的抗体分子仍会引起不同程度的人抗鼠抗体反应(human anti-mouse antibody reaction，HAMA）及抗体嵌合反应（Human anti-chimeric antibody,HACA）等，仍会有免疫原性，从而导致安全问题，限制了临床应用。3.2 抗体的亲和力基因工程抗体分子的亲和力仅为原鼠源抗体的33%-50%。这很大程度的限制了它们的应用及实用效率。需进一步研究其结构及表面修饰等因素，使该问题得到优化，3.3 抗体的结构及修饰由于抗体分子为四条链（两条重链，两条轻链）组成的三维立体结构，其空间结构复杂，且分子修饰繁琐，在异种生物体内，表达由于环境不同于人体内环境，会造成在肽链一级结构的基础上盘曲，折叠，组装的方式有所改变，以及蛋白质糖基化等修饰有所不同，导致抗体分子活性受影响。3.4 抗体的穿透性抗体分子的分子量，是决定其能否通过血管壁，组织屏障等结构的重要因素，治疗性基因工程抗体分子，需在保持自身完整性并携带药物蛋白的基础上，可通过各结构到达作用位点，所以兼顾两方面因素的技术手段，需进一步研究发展。4 结语近年来基因工程技术迅速发展，利用该技术改造的抗体也被广泛研究，许多基因工程抗体已进入大规模生产阶段，在免疫预防，免疫治疗等领域取得了显著成效，推动着生物医学的进步。但改造的抗体分子存在免疫原性，以及亲和力，特异性差等问题，此类问题也是未来基因工程抗体研究的发展优化方向。本文综述了近年来基因工程抗体的研究进展，各类抗体的特点及应用领域，以及存在待改善的问题等，并强调了其在生物医学领域的重要作用及发展趋势。相信不久的将来，基因工程抗体将得到进一步的发展，在其质量，效率等方面都有显著的改善，从而更加广泛地应用于各领域，更好地为人类服务。参考文献1 Kohler GMi istein CContinuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity JNature，1975，256(5517)：495497 2 Winter G，Milstein CMan-made antibodiesJNature,1991，349(6307)：293299 3 Vaughan T J，Williams A J，Pritchard K，et a1Human antibodies with sub-nanomolar affinities 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