NY∕T 3258-2018 油菜品种菌核病抗性离体鉴定技术规程(农业).pdf

ICS 65.020.01 B 15 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 3258-2018 油菜品种菌核病抗性离体鉴定技术规程Technical code of practice for in vitro identification of resistance to Sclerotinia Sclerotiorum in oilseed rape 2018-07-27发布2018-12-01实施中华人民共和国农业农村部发布目U吕本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由农业农村部农产品质量安全监管司提出。本标准由农业农村部种植业管理司归口。本标准起草单位:中国农业科学院油料作物研究所。本标准主要起草人:伍晓明、李利霞、陈碧云、闰贵欣、高桂珍。NY/T 3258-2018 I NYjT 3258-2018 油菜品种菌核病抗性离体鉴定技术规程1 范围本标准规定了油菜菌核病抗性离体鉴定方法。本标准适用于油菜菌核病室内抗病鉴定。本标准不适用于油菜季节性和形.2 规范性引用文件下列文件对于本件。凡是不注日期的GBj T 6682 3.1 3.2 油菜菌由病原离体人将器官据接种植3.4 反式中:5 一一各 一一对应各病情级别N一一调查总株数，单位为株;51一一-最高病情级别的数值。相对抗性指数relative resistance index 反映群体较对照群体抗性减轻程度的综合指标，按式(2)计算。日期的版本适用于本文条件，根(l00-DIcK飞(lOO-DIRRI=ln(VV r.T.u)-ln(一一一一).飞DIcKJ.DI 式中:RRI一-一相对抗性指数;1 NY/T 3258-2018 DlcK-二抗病对照的病情指数;DI一一待评价品种(系)的病情指数。4 试剂或材料除非另有规定，仅使用分析纯试剂。4.1水GB/T 6682，三级。4.2 1 mol/L氢氧化制(NaOH)溶液称取40.0g氢氧化纳，榕于800mL水中，冷却至室温。4.3 1 mol/L盐酸(HCl)溶液量取50mL浓盐酸(36%38%)加入到体积为450mL的水中，混匀。4.4 70%Z醇溶液量取700mL 95%乙醇，加水定容至950mL，混匀。4.5 1%次氯酸纳溶液量取10mL有效氯含量10%的次氯酸制原液加入到体积为90mL的水中，混匀。5 仪器设备5.1 电子天平感量0.01g。5.2 恒温培养箱精度:l:lOC。5.3 人工接种鉴定温室温度可调节至(22土1)OC，相对湿度可调节至(95:l:5)%。6 核盘菌接种体制备6.1 核盘菌接种体培养基制备核盘菌生长培养基用市售马铃薯培养基(PDA，Potato Dextrose Agar)剂，按说明书标准用量的一半，并按每升培养基补加7.5g琼脂粉，加水溶解，定容至1000mL，用1mol/L NaOH或1mol/L HCl榕液调节pH至5.8。之后，将溶液分装到三角瓶中，包扎好后1210C灭菌20min取出，按20mL/皿倒平板(直径90mm培养皿)，冷却后储存备用。6.2 核盘茵茵核的采集和消毒从田间直立的油菜菌核病发病植株体内剥离核盘菌菌核，选择颗粒饱满、无裂痕、无霉变的菌核放人洁净的容器中，带回实验室置于一200C冰箱备用。在超净工作台上，将菌核置于70%乙醇中浸泡1 min，再转入1%次氯酸铀溶液中浸泡3min，之后用无菌水漂洗3次。6.3 核盘茵茵丝的扩繁在超净工作台上，将已消毒的菌核切成2mmX2 mm(长宽)的小块。用慑子取一个菌核切块置于培养皿中心，并使其切面紧贴培养基表面，封皿后(22:l:1)oC暗培养。萌发菌丝后，40C保存，并将此培养基用作菌源。离体接种前5d，用直径5mm的打孔器沿菌源培养基菌丝边缘打孔。将打孔得到的菌丝块取出置于新的培养基中心，并使菌丝块有菌丝一面紧贴于新的培养基表面，封皿后(22士1)OC暗培养3d。待菌丝正好长至培养基边缘时，取出按上述步骤扩繁，(22:l:1)OC暗培养约2d后备用。7 菌核病抗性离体鉴定方法7.1 苗期离体叶片鉴定NY/T 3258-2018 7.1.1 取样按各地正常播种时间播种待鉴定油菜材料，播种材料应包含抗病对照和感病对照。出苗后8周10周，取健康油菜幼苗从心叶向外数的第2片完全展开叶，正面朝上置于底部铺好湿纱布(纱支:21s X 21 s，经纬度:120X100根/100mm)的塑料盒中或接种床上。7.1.2 人工接种用直径5mm打孔器沿菌丝边缘打孔取菌丝块，用慑子将菌丝块接种于所取叶片中上部并偏离主叶脉的位置，使菌丝块有菌丝一面紧贴叶片。接种后用水喷雾并用塑料薄膜覆盖保湿，放置于(22:Il)OC、相对湿度(95:I5)%的人工接种鉴定温室中培养。每份材料选择30片均匀一致的叶片接种。7.1.3 调查方法以接种处的水渍边缘作为病斑边缘，接种2d后测量椭圆形病斑长径和短径。大批量鉴定时，调查病斑顺序，尽量和接种顺序保持一致。调查时，对发病材料的病斑进行图片采集。图片采集时，应放置参照标尺。整个试验发病情况的调查应在1d之内完成，如有特殊情况应在记录表备注栏中标出，调查数据及时录入记载中(参见附录B中的B.l)。7.1.4 病斑面积计算病斑面积按式(3)计算。S,=X b)4(3)式中:S2一一一待测材料的病斑面积，单位为平方厘米(cm2);G 待测材料的病斑长径，单位为厘米(cm);b 待测材料的病斑短径，单位为厘米(cm)。7.2 终花期离体茎轩鉴定7.2.1 取样按各地正常播种时间播种待鉴定材料，播种材料应包含抗病对照和感病对照。在大田材料处于终花期时，选择正常且长势一致(株高、株型、叶片大小等相似)的植株，截取离地20cm50 cm之间长为30 cm的茎秤，两端用保鲜膜包住保湿，置于底部铺好湿纱布的塑料盒中或接种床上。7.2.2 人工接种用直径5mm打孔器沿菌丝边缘打孔取菌丝块，用慑子将菌丝块接种于所取茎轩的两茎节中间位置，并使菌丝块有菌丝一面紧贴茎秤表面。接种后喷雾并用塑料薄膜覆盖保湿，放置于(22:Il)OC、相对湿度(95:I5)%的人工接种鉴定温室中培养，每份材料接种30株。7.2.3 调查方法以接种处的水渍边缘作为病斑边缘，接种后5d调查病斑长度。在进行大批量鉴定时，调查病斑顺序尽量和接种顺序保持一致。调查时对发病材料进行图片采集，图片采集时应放置参照标尺。整个试验发病情况的调查应在1d之内完成，如有特殊情况应在记录表备注栏中标出，调查数据及时录入记载表中(参见B.2)。8 试验数据处理如果单株测量值满足式(的，可认为该单株值为异常值，在后续的分析中可予以剔除。I S;-:5 I 3(4)式中:S;单株测量值，单位为平方厘米或厘米(cm2或cm);5 样本平均值，单位为平方厘米或厘米(cm2或cm);3 NY/T 3258-2018 一一样本标准差，单位为平方厘米(cm2)或厘米(cm)。9 油菜单株抗性分级9.1 苗期离体叶片单株抗性分级根据四分位分类法则，将病害等级分为5级:O级:无病斑;1级:0以马叶分位点值);2级:SokkS05(分位点值);3 级:5 0.5 5 2 50.7乃叶54级:5乌0.7比55乌2。9.2 终花期离体茎轩单株抗性分级根据四分位分类法则，将病害等级分为5级:O级:元病斑;l 级:叫5乌50.25川川2刽叶52级:SokLG05(t分位点值);3 级:5乌0.5L50队0川川7乃叶54级:5乌0.7刊5L。10 病情指数和相对抗性指数的计算根据记录结果和式(1)、式(2)分别计算病情指数和相对抗性指数。11 抗性评价对油菜材料的抗性评价根据NY/T3068的规定按照表1的标准进行。表1油菜菌核病室内离体鉴定抗性评价标准抗性评价相对抗性指数(RRD高抗CHR)RRI-1.2 中抗(MR)一1.2RRI一O.7 低抗(R)O.7RRIO 低感(S)ORRIO.9 中感(MS)O.9RRI2.0 4 A.1 病原菌A.1.1 学名中文学名:核盘菌。附录A(资料性附录)油菜菌核病拉丁学名:Sclerotinisclerotiorum(Lib.)de Bary.分类地位:子囊菌门、盘菌纲、柔膜菌目、核盘菌科、核盘菌属。A.1.2 形态描述NY/T 3258-2018 菌核黑色，不规则形，由暗色的皮层和无色的髓部构成;子囊盘生于菌核上，盘状，中央凹陷，具柄;子实层米色、肉挂色或淡褐色，子层托颜色稍淡于子实层，柄基部暗色;外囊盘被为角胞组织，外层细胞近球形、椭圆形或长形，细胞纵轴与囊盘被表面垂直;盘下层为交错丝组织，菌丝无色;子实下层发育不健全，厚15m30m;子实层厚127m150m;子囊近圆柱形，具8个子囊抱子;子囊抱子椭圆形至近梭形，无色，单细胞，在子囊中单列排列。A.2 病害症状油菜叶片感病后初生暗青色水渍状斑块，后扩展成圆形或不规则形大斑。病斑灰褐色或黄褐色，有同心轮纹，外围暗青色。油菜茎秤染病初期为灰白的水渍状病斑，随后发展为具轮纹状的长条斑，边缘褐色。发病组织在空气干燥时萎缩、干枯，潮湿时则长出白色棉絮状菌丝。发病后期病茎表皮开裂，露出麻丝状的维管束，病茎内髓部烂成空腔，内部形成形状、大小不一的黑色鼠类状菌核。田间茎秤发病实例见图A.1，人工接种离体叶片、茎秤发病实例分别见图A.2和图A.3。图A.l田间茎轩发病实例图A.2人工接种离体叶片图A.3人工接种离体茎轩发病实例发病实例5 NY/T 3258-2018 附录B(资料性附录)油菜菌核病离体鉴定原始数据记载表B.1 油菜苗期离体叶片病斑调查记录表见表B.l。表B.l油菜苗期离体叶片病斑调查记录表调查地点:调查时间:调查人:l 2 田间材料编号名称长径短径长径短径()(b)(a)(b)B.2 油菜终花期离体茎轩病斑长度调查记录表见表B.20记录人:单位:cm29.长径短径(a)(b)表B.2油菜终花期离体茎轩病斑长度调查记录表调查地点:调查时间:调查人:记录人:单位:cm田间编号材料名称1 2 29 6【第页，共页】30 长径短径备注()(b)【第页，共页】30 备注SN|的N们FHFZ中华人民共和国农业行业标准油菜品种菌核病抗性离体鉴定技术规程NY/T 3258-2018 中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子店街18号楼)争夺争等关(邮政编码:100125 网址:VV)中国农业出版社印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销争夺印张O.75 字数15千字2018年11月北京第1次印刷争等开本880rnrnX1230rnrn 1/16 2018年11月第1版书号16109 4613 定价20.00元争等版权专有侵权必究举报电话(010)59194261 NY/T 3258-2018