GA∕T 1908-2021 法庭科学 生物检材中雷公藤内酯甲等4种雷公藤毒素检验 液相色谱-质谱法(公共安全).pdf

ICS 13.310 CCS A 92 中 华 人 民 共 和 国 公 共 安 全 行 业 标 准 GA GA/T 法庭科学 生物检材中雷公藤内酯甲等 4种雷公藤毒素检验 液相色谱-质谱法 Forensic sciencesExamination methods for 4 tripterygium toxin including wilforlide A in biological samplesLC-MS/MS -发布-实施 中华人民共和国公安部中华人民共和国公安部 发布发布 GA/T I 前 言 本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委员会（SAC/TC 179/SC1）提出并归口。本文件起草单位：公安部物证鉴定中心、杭州市公安司法鉴定中心、广西省公安厅、云南省公安厅。本文件主要起草人：王芳琳、栾玉静、应剑波、黄克建、李虹。GA/T 1 法庭科学 生物检材中雷公藤内酯甲等 4 种雷公藤毒素检验 液相色谱-质谱法 1 范围 本文件规定了法庭科学生物检材（血、尿、肝、肾、胃及胃内容）中雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素的液相色谱-质谱（LC-MS/MS）检验方法。本文件适用于法庭科学生物检材（血、尿、肝、肾、胃及胃内容）中雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素的定性分析和定量分析。其他检材可参照使用。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件。4 原理 以空白样品和添加样品作对照，按平行操作的要求，对生物检材进行提取、净化及浓缩，采用液相色谱-质谱法检测，以保留时间、质谱特征离子对和离子对丰度比作为定性判断依据；以峰面积为依据，采用外标法进行定量分析。5 试剂和材料 5.1 试剂 实验用水应符合GB/T 6682 中规定的一级水。除非另有说明，在分析中使用的试剂均为分析纯，试剂包括：a)甲醇（色谱纯）；b)乙腈（色谱纯）；c)乙酸乙酯；d)1%氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠 1.0g，加入一定量的水溶解并稀释至 100mL；e)磷酸盐缓冲液（pH 值 6.0）：分别称取磷酸二氢钠 8.34g、磷酸氢二钠 0.87g，加入一定量的水溶解并稀释至 1000mL。GA/T 2 f)10mmoL/L 醋酸铵溶液（含 0.1%甲酸）：称取醋酸铵 0.384g，加入一定量的水溶解，并加入0.5mL 甲酸混匀，加水稀释至 500mL；g)标准溶液：1)1.0mg/mL 标准物质储备液：根据雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素标准物质的纯度，分别用甲醇配制 1.0mg/mL 雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素标准物质溶液，密封，04保存，有效期 6 个月。或采用市售标准溶液；2)0.1mg/mL 混合标准物质工作溶液：分别移取 1.0mg/mL 的雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素标准物质溶液各 1.0mL，用甲醇配制成浓度为 0.1mg/mL 的混合标准物质工作溶液，密封，04保存，有效期 3 个月。实验中所用其他浓度的混合标准工作溶液均由 0.1mg/mL 混合标准工作溶液配制得到；3)10.0 g/mL 单一标准物质工作溶液：分别移取 1.0mg/mL 的雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素标准物质储备液，用甲醇配制成浓度为 10.0g/mL 的单一标准工作溶液，密封，04保存，有效期 3 个月。实验中所用其他浓度的单一标准物质工作溶液均由 10.0g/mL 单一标准物质工作溶液配制得到。5.2 材料 材料包括：a)固相萃取柱：Oasis HLB 固相萃取柱或其他等效固相萃取柱；注：Oasis HLB 柱是 Waters 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。b)有机系微孔滤膜：0.22m；c)一次性注射器；d)具盖离心管。6 仪器和设备 仪器和设备包括：a)液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）和三重四极杆质量分析器；b)电子天平：分度值 d0.01mg；c)离心机；d)超声波清洗器；e)振荡器；e)移液器；f)浓缩器。7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品前处理 7.1.1.1 液液萃取 移取血液等液体检材样品 1.0mL，或称取铰碎的肝脏等固体检材样品 1.0g 于具盖离心管中，加入GA/T 3 氢氧化钠溶液调 pH 值 9pH 值 10，再加入乙酸乙酯 5mL，振荡 10min，不低于 8000r/min 离心 10min，分离有机相；重复提取一次，合并两次提取的有机相，置于浓缩器上 50下浓缩至干，残留物用初始流动相 0.5mL 溶解，经 0.22m 有机系微孔滤膜过滤，作为检材样品提取液，供仪器检测。注：检材样品取样量、提取溶剂体积可根据实际情况调整。7.1.1.2 固相萃取 移取血液等液体检材样品 1.0mL，或称取铰碎的肝脏等固体检材样品 1.0g 于具盖离心管中，加入磷酸盐缓冲液 4mL，混匀，超声 15min，不低于 8000r/min 离心 20min，取上清液转移至已活化好（依次用甲醇 3mL、水 3mL 活化）的固相萃取柱中，控制上清液过柱流速低于 1.0mL/min，依次用水 3mL、甲醇/水（体积比 5:95）3mL 淋洗，弃去淋洗液，挤干水分或离心或真空抽固相萃取柱 2min，用 4mL甲醇洗脱，收集洗脱液并置于浓缩器上 50下浓缩至干，残留物用初始流动相 0.5mL 溶解，经 0.22m有机系微孔滤膜过滤，作为检材样品提取液，供仪器检测。注：检材样品取样量可根据实际情况调整。7.1.1.3 质控样品制备 取等量相似基质的空白样品（若无相似基质空白样品可用血液替代）两份于具盖离心管中，一份作为空白样品，一份添加标准物质工作溶液，使雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素浓度为20ng/mL（g），作为添加样品，与检材样品平行操作，得到空白样品提取液和添加样品提取液供仪器分析。7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 液相色谱-串联质谱仪条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整：a)色谱柱：Kinetex C18(3.0mm 50mm，2.6m)柱或等效色谱柱；注：Kinetex C18柱为 Phenomenex 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。b)柱温箱：40；c)流动相 A：10mmoL/L 醋酸铵溶液（含 0.1%甲酸）；d)流动相 B：甲醇；e)流速：0.5mL/min；f)进样体积：10L；g)洗脱方式：梯度洗脱，梯度洗脱条件见表 1；表 1 梯度洗脱条件 时间 min 流动相 A 流动相 B 00.2 95%5%3.0 5%95%4.0 5%95%5.1 95%5%7.0 95%5%h)扫描方式：正离子扫描(ESI+)；GA/T 4 i)检测方式：多反应监测(MRM)；j)电喷雾电压：5500V；k)离子源温度：650；l)雾化气压力：55psi；m)气帘气压力：50psi；n)辅助气压力：50psi；o)定性、定量离子对和去簇电压、碰撞能量条件见表 2。表 2 定性、定量离子对和去簇电压、碰撞能量条件 目标物 定量离子 m/z 定性离子 m/z 去簇电压 V 碰撞能量 eV 雷公藤甲素 361.2 145.0 361.2 145.0 147 35 361.2 157.0 137 35 雷公藤内酯酮 359.1 197.2 359.1 197.2 150 35 359.1 241.1 150 36 雷公藤内酯甲 472.4 191.2 472.4 191.2 60 24 472.4 247.2 60 29 雷公藤红素 451.4 201.1 451.4 201.1 50 29 451.4 215.2 58 24 7.1.2.2 进样 分别吸取空白溶剂、添加样品提取液、空白样品提取液、检材样品提取液、标准物质工作溶液，按7.1.2.1仪器条件进行检测。进样顺序和进样次数应确保结果有效。7.2 定量分析 7.2.1 样品前处理 移取血液等液体检材样品1.0mL，或称取铰碎的肝脏等固体检材样品1.0g两份，按7.1.1进行操作，得到空白样品提取液，供仪器检测。取与检材样品等量的相似基质空白样品，与检材样品平行操作，得到空白样品提取液，供仪器检测。取与检材样品等量的相似基质空白样品两份，添加雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素标准物质工作溶液，作为添加样品，与检材样品平行操作，得到添加样品提取液，供仪器检测。检材样品中目标物含量应在添加样品中目标物含量的（100 50）%范围内。7.2.2 仪器检测 7.2.2.1 仪器条件 同 7.1.2.1。7.2.2.2 进样 分别吸取检材样品提取液、空白样品提取液、添加样品提取液，按 7.1.2.1 仪器条件进样分析。每份检材样品提取液和添加样品提取液各进样分析 23 次。7.2.2.3 计算 7.2.2.3.1 计算含量 GA/T 5 记录检材样品提取液和添加样品提取液中目标物的保留时间和峰面积值，按公式（1）计算检材样品中目标物的含量。.（1）式中：检材样品中目标物的含量；A检材样品提取液中目标物的峰面积的平均值；A添加样品提取液中目标物的峰面积的平均值；添加样品中目标物的含量。7.2.2.3.2 计算相对相差 记录 7.2.3.1 中计算得到的检材样品中目标物的含量，按公式（2）计算相对相差：12100%-RD=.（2）式中：RD相对相差，用百分比（%）表示；1、2两份检材样品中目标物的含量；两份检材样品中目标物含量的平均值。8 分析结果评价 8.1 定性结果评价 8.1.1 阳性结果评价 在相同条件下进行样品测定时，检材样品中目标物的色谱峰保留时间与标准物质工作溶液一致（相对误差在 2.5%之内）、目标物的两对定性离子与标准物质工作溶液一致，且离子对丰度比与浓度接近的标准物质工作溶液相比，相对偏差不超过表 3 规定的范围，空白样品无干扰，则可判断检材样品中检出目标物。雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素相关谱图参见附录 A。表 3 离子对丰度比的最大允许相对偏差范围 离子对丰度比 50%20%50%10%20%10%最大允许相对偏差 20%25%30%50%8.1.2 阴性结果评价 检材样品未出现与目标物标准物质工作溶液一致的色谱峰，且添加样品中出现与目标物标准物质工作溶液一致的色谱峰，空白样品无干扰，则可判断检材样品中未检出目标物。8.2 定量结果评价 检材样品中目标物含量的RD20%，定量数据可靠，其含量按两份检材的平均值计算。如果检材样品中目标物含量的RD20%，定量数据不可靠，应按7.2重新提取检验。雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素相关参考资料参见附录 B。A B GA/T 6 附 录 A（资料性）雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素的相关谱图 A.1 雷公藤甲素的 LC-MS/MS 谱图见图 A.1。图 A.1 雷公藤甲素 LC-MS/MS 谱图 A.2 雷公藤内酯酮的 LC-MS/MS 谱图见图 A.2。图 A.2 雷公藤内酯酮 LC-MS/MS 谱图 GA/T 7 A.3 雷公藤内酯甲的 LC-MS/MS 谱图见图 A.3。图 A.3 雷公藤内酯甲 LC-MS/MS 谱图 A.4 雷公藤红素的 LC-MS/MS 谱图见图 A.4。图 A.4 雷公藤红素 LC-MS/MS 谱图 GA/T 8 附 录 B（资料性）雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素的相关资料 雷公藤(Triptergium wilfordii Hook.f)是卫矛科一年生藤本植物，是我国传统医学中的一种常用中草药。雷公藤为卫矛科植物雷公藤的根。分布于长江流域以南及西南，主产于长江中、下游地区。有报道称，目前从雷公藤属植物中分离得 100 余种成分，主要是二萜类、三萜类、倍半萜类及生物碱类等，研究表明，生物碱、二萜类等许多成分既是有效成分又是有毒成分，以二萜类化合物毒性最强，主要对心、肝、胃肠道及骨髓等器官损伤严重。雷公藤甲素和雷公藤内酯醇(tripchlorolide)是雷公藤中活性最高的环氧二萜内酯化合物，同时也是雷公藤引起毒副作用的主要成分，对心、肝、骨髓、胸、脾、肾及生殖系统等都有一定的毒性。雷公藤红素是雷公藤三萜类成分，是雷公藤中分离到的第 1 个单体，虽具有多种药理活性，但却是主要的毒性成分，且在雷公藤药物尤其是根皮、茎皮重含量很高。雷公藤内酯甲（Wilforlide A），分子式为 C30H46O3，CAS 号为 84104-71-2，结构式见图 B.1。雷公藤内酯酮（Triptonide），分子式为 C20H22O6，CAS 号为 38647-11-9，结构式见图 B.2。雷公藤甲素（Triptolide），分子式为 C20H24O6，CAS 号为 38748-32-2，结构式见图 B.3。雷公藤红素（Celastrol），分子式为 C29H38O4，CAS 号为 34157-83-0。结构式见图 B.4。图 B.1 雷公藤内酯甲结构式 图 B.2 雷公藤内酯酮结构式 GA/T 9 图 B.3 雷公藤甲素结构式 图 B.4 雷公藤红素结构式 _