NY∕T 3235-2018 羊传染性脓疱诊断技术(农业).pdf

ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 3235一2018羊传染性腺癌诊断技术Diagnostic techniques for contagious ecthyma 208-05-07发布2018-09-01实施中华人民共和国农业农村部发布目。昌本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由农业农村部兽医局提出。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会CSAC/TC181)归口。本标准起草单位:吉林省畜牧兽医科学研究院、吉林省动物疫病预防控制中心。NY/T 3235-2018 本标准主要起草人:邵洪泽、付殿国、王楠、程荣华、柴方红、于钦磊、董航、呼延含蓉、郭衍冰、孙强、李星洁、刘沂霖、石春军、陆秀娟。I NY/T 3235-2018 引羊传染性腺癌，又称羊接触传染性腺癌皮炎(俗称羊口疮)，是由症病毒科副症病毒属的传染性服痛病毒引起绵羊、山羊的一种急性接触传染性、嗜上皮性的人兽共患病。以在口、唇、舌、鼻、乳房等部位的皮肤和黠膜形成丘彦、水痛、腺癌、溃殇及结成疵状厚册为特征。羔羊最为易感，常引起群体发病。我国将其列为三类动物疫病。本病最早于1920年发现于欧洲，现已广泛分布于全世界。我国新疆、甘肃、青海、内蒙古以及东北=省等养羊地区均有本病发生和流行的报道。发病率30%50%，羔羊死亡率高，可达20%。该病为人兽共患病，人主要通过皮肤擦伤而感染。OIE(陆生动物诊断试验和疫苗手册(哺乳动物、禽鸟与蜜蜂)中未见羊传染性腺癌相关诊断标准。本病确诊可采用病毒分离培养或对病料进行负染色直接进行电镜观察，还可用血清学方法诊断，如中和试验等。另外，聚合酶链式反应CPCR)和实时荧光定量PCR可快速检测本病的病原。H NY/T 3235-2018 羊传染性腺癌诊断技术范围本标准规定了羊传染性腺癌的临床诊断、样品的采集和处理、病毒分离培养、动物接种试验、电镜形态学观察、聚合酶链式反应(PCR)、实时荧光定量PCR和综合判定方法。本标准适用于羊传染性服殖的诊2 规范性引用文件下列文件对于本文件。凡是不注日期的GB/T 6682 GB 19489 GB/T 27 3 生物4 防污防止污实验室区域应有专5 5.1 流行病学5.1.1 病羊和5.1.2 易感羊经乳而发生乳头擦伤，5.1.3 绵羊和山羊易5.2 临床症状.-.唱用;每一个5.2.1 潜伏期4d7 d。病￥冒-匾上唇或鼻镜上出现边斑点，并迅速变为丘彦，继而发展成水痛或腺癌。水痛或腺癌破裂后因-7;S脐t参见附录A中的A.l)。5.2.2 病羊良性经过时，硬踊增厚、干燥，并于l周2周内脱落而恢复正常。5.2.3 严重病例的患部继续发生丘痊、水痛和腺癌，册皮互相融合，波及整个口唇周围及颜面和眼险。可形成大片具有龟裂并易出血的污秽册垢，呈桑甚状或花椰菜状，班下肉芽增生(参见A.2)。严重影响羊采食，以致日渐消瘦，并可导致死亡。病程可长达2周3周。5.2.4 口腔茹膜也常出现水炮、腺癌和烂斑，恶化时可形成大面积攒癌。5.2.5 母羊乳头病变与口唇相似，但躏皮稍薄。5;2.6 有时在蹄叉、蹄冠部皮肤上出现水痛、腺癌，破裂后形成污秽溃癌。5.3 病理变化1 NY/T 3235-2018 口唇、蹄及外阴等处勃膜形成丘摩、水殖、腺癌、溃殇与疵状册，组织上皮高度增生、变性、角化、坏死及表皮细胞浆中有嗜酸性包涵体形成。6 样品的采集和处理6.1 材料6.1.1 仪器6.1.1.1 电子天平。6.1.1.2 研磨器。6.1.1.3 低温高速离心机。6.1.1.4 冰箱。6.1.1.5 可调微量移液器:200Ll000L、20L200L。6.1.2 耗材6.1.2.1 吸头:1000L、200L。6.1.2.2 Eppendorf管:1.5 mL、0.5mL、0.2mL。6.1.2.3 棉签。6.1.3 试剂6.1.3.1 除有特殊说明外，所用试剂均为分析纯;试验用水符合GB/T6682中一级水的要求。6.1.3.2 O.01 mol/L PBS液:含青霉素2000IU/mL、链霉素2000mg/mL,pH 7.07.2。6.2 方法6.2.1 捕皮采集病羊的口、唇、乳房等部位的航皮1g，置于放有干燥剂(硅胶或其他干燥剂)的灭菌烧杯中，置冰盒内送检。将前皮剪碎、研磨，置于4mL的0.01mol/L PBS缓冲液(含青霉素2000IU/mL、链霉素2000 mg/mL,pH 7.07.2)，重悬。40C浸渍16h20 h，以3000 r/min离心10min，取上清液。一200C保存备用。6.2.2 水癌液采集未破裂的丘痊水液，置于2倍体积的O.01 mol/L PBS缓冲液(含青霉素2000IU/mL、链霉素2000mg/mL,pH 7.07.2)的灭菌试管中，置冰盒内送检。样品3000r/min离心10min，取上清液。200C保存备用。7 病毒分离培养7.1 材料7.1.1 仪器7.1.1.1 低温高速离心机。7.1.1.2 生物安全柜。7.1.1.3 CO2培养箱。7.1.1.4 倒置显微镜。7.1.1.5 冰箱。7.1.1.6 可调微量移液器:200Ll000L、20L200L、2L20L、O.5L10L 7.1.2 耗材7.1.2.1 吸头:1000L、200L、20L、10L。NY/T 3235-2018 7.1.2.2 Eppendorf管:1.5 mL、0.5mL、0.2mL。7.1.2.3 75 cm2细胞培养瓶。7.1.3 试剂7.1.3.1 除有特殊说明外，所用试剂均为分析纯;试验用水符合GB/T6682中一级水的要求。7.1.3.2 MEM细胞培养液。7.1.3.3 胎牛血清:560C灭活30mino 7.1.3.4 细胞营养液:90%MEM，10%胎牛血清(含青霉素100IU/mL和链霉素100mg/mL,0.03 g/mL谷氨眈肢，用75g/L NaHC03熔液调pH至7.07.2)。7.1.3.5 细胞维持液:98%MEM，2%胎牛血清(含青霉素100IU/mL和链霉素100mg/mL,0.03 g/mL谷氨酌肢，用75g/L NaHC03溶液调pH至7.07.2)。7.1.4 细胞棋牛辜丸原代细胞、赞牛肾原代细胞胎或羊皮肤细胞任一种，制备方法见附录B中的B.1、B.2和B.3。7.2 方法7.2.1 按附录B制备任一一种单层细胞，待细胞长成良好的单层后(参见A.3)。7.2.2 倒掉细胞营养液，接种6.2制备病毒液样品1.0 mL，3rC吸附1h。7.2.3 将病毒液倒出，加入细胞维持液10mL，置370C、5%CO2培养箱培养。7.2.4 每天观察细胞变化，连续观察5d。如接毒后1d5 d内细胞出现变圆、肿胀，细胞间质增宽，折光性增强，细胞团聚、脱落等细胞病变效应(CPE)，且病变达70%80%时收获病毒液(参见A.4);将病变细胞培养液反复冻融3次，-20oC保存备用。如果盲传3代元细胞病变效应(CPE)，则判为病毒分离阴性。8 动物接种试验8.1 试验程序取7.2制备样品0.2mL，划痕接种|临床健康3月龄5月龄羔羊唇黠膜。8.2 结果判定若接种后3d4 d出现划线红肿，5d7 d出现水痛或腺癌等典型的临床症状，接种试验为阳性。若无临床症状，则判为阴性。9 电镜形态学观察9.1 材料9.1.1 仪器9.1.1.1 低温高速离心机。9.1.1.2 生物安全柜。9.1.1.3 电镜。9.1.1.4 可调微量移液器:20L200L。9.1.2 耗材9.1.2.1 普通平皿。9.1.2.2 滤纸。9.1.2.3 吸头:200L。3 NY/T 3235-2018 9.1.2.4 Eppendorf管:1.5 mL。9.1.2.5 支持网。9.1.3 试剂2%磷鸽酸溶液:pH6.8。9.2 方法取病变细胞培养液反复冻融3次后，3000r/min离心10min，弃大部分上清液，留少量上清液重悬。吸少量沉淀悬液或者6.2制备样品，直接滴在支持网上，悬液在网上呈半球形。2min3 min后，用一片干净滤纸从网边吸去液体。再滴磷鸽酸染液在网上，染色1mino用滤纸吸去染液，立即进行电镜观察或置干燥器内短期保存。9.3 结果判定透射电镜观察，病毒大小约为280nmX 140 nm，表面呈规则的网状结构。网状结构有规则地斜向平行地沿着病毒颗粒长轴呈8字缠绕的毛线团样。若发现毛线团样特殊表面结构的病毒粒子(参见人5)可判为电镜形态学观察为阳性，未观察到则判为阴性。10 聚合酶链式反应(PCR)10.1 材料10.1.1 仪器10.1.1.1 PCR仪。1O.l.1.2 低温高速离心机。10.1.l.3 电泳槽。10.1.1.4 电泳仪。10.1.1.5 紫外线灯或紫外凝胶成像仪。10.1.1.6 冰箱。10.1.1.7 可调微量移液器:200Ll000L、20L200L、2L20L、O.5L10L。10.1.2 耗材10.1.2.1 吸头:1000L、200L、20L、10L。10.1.2.2 Eppendorf管:1.5 mL、0.5mL、0.2mL。10.1.3 试剂10.1.3.1 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯;实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。10.1.3.2 标准阳性样品为羊传染性腺癌病毒核酸。10.1.3.3 阴性对照样品为灭菌双蒸水。10.1.3.4 PCR试剂盒(或10X PCR缓冲液、5U/L Taq DNA聚合酶、25mmol/L MgClz、10 mmol/L dNTP、灭菌双蒸水)。10.1.3.5 1%澳化乙链(EB)、溶液或代替物。10.l.3.6 TAE电泳缓冲液。10.l.3.7 琼脂糖。10.1.3.8 上样缓冲液。10.1.3.9 DNAMarker。10.1.3.10 病毒DNA提取试剂盒。10.1.4 引物序列NY/T 3235-2018 上游引物:5-GACCCCGAGCTCATGGT-3;下游引物:5仁GCCGCGTCTTCACCTGTA-3。使用时配制成10mol/L工作液，置-200C保存。10.2 模板的制备取6.2或7.2制备样品，采用病毒DNA提取试剂盒提取核酸作为待检样品模板。10.3 方法10.3.1 反应体系PCR扩增反应采用2 5L反应体系，依次加入下列试剂:10XPCR缓冲液2.5L;dNTPOO mmol/L)MgC12(25 mmol/L)Taq DNA聚合酶(5U/L)上游引物00mol/L)下游引物00mOl/L)样品模板补充灭菌双蒸水(ddH20)至10.3.2 反应程序O.5L;2.0 L;O.5L;1.0 L;1.0 L;2.0 L;25.0 L。950C预变性5min;940C变性30s，6 2 0C退火30s，720C延伸30s，35个循环;720C延伸10min。10.4 电泳10.4.1 用100mL TAE榕液加热溶解1.5g琼脂糖，500C时加1%澳化乙链(EB)溶液或代替物lL，制备琼脂糖凝胶板。10.4.2 取阳性样品、阴性样品及待检样品PCR产物各8L，分别与上样缓冲液2L混合，加人琼脂糖凝胶板的加样孔中。另有1孔直接加入DNAMarker。10.4.3 以5V/cm电压电泳30min。10.4.4 在紫外线灯下观察或者用紫外凝胶成像仪拍照。10.5 结果10.5.1 成立条件F日性样品出现大小约235bp扩增带(参见A.6、A.7)，阴性样品未出现，判为试验成立。10.5.2 结果判定如出现与阳性样品相同的大小约235bp扩增条带，判为样品为阳性，如未出现则判为阴性。11 实时荧光定量PCR门.1材料11.1.1 仪器11.1.1.1 荧光PCR仪。11.1.1.2 低温高速离心机。11.1.1.3 冰箱。11.1.1.4 可调微量移液器:200Ll000L、20L200L、2L20L、O.5L10L。11.1.2 耗材11.1.2.1 吸头:1000L、200L、20L、10L。11.1.2.2 8联管。5 NY/T 3235-2018 11.1.2.3 Eppendorf管:1.5 mL、0.5mL、0.2mL。11.1.3 试剂11.1.3.1 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯;实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。11.1.3.2 标准阳性样品为羊传染性腺癌病毒核酸。11.1.3.3 阴性对照样品为灭菌双蒸水。11.1.3.4 SYBR Premix Ex TaqTM 1I CTli RNaseH Plus)。11.1.3.5 ROX Reference DyeC50 X)。11.1.3.6 灭菌双蒸水。11.1.3.7 病毒DNA提取试剂盒。11.1.4 引物上游引物P1:5-CAGTATGCTACTCACACAGTCG-3;下游引物P2:5-GCA TCACCTCTTCCAAGT AAAAC-3。使用时配制成10mol/L工作液，置一200C保存。11.2 模板的制备同10.2。11.3 方法11.3.1 反应体系采用25L反应体系，依次加入下列试剂:SYBR Premix Ex Taq P1C10 mol/U P2C10mol/U ROX Reference DyeC 50 X)DNA模板用灭菌蒸锚水补至11.3.2 反应程序12.5L;O.5L;O.5L;O.5L;2.0 L;25.0 L。950C预变性60s;950C变性5s，600C退火30s,720C延伸30s，40个循环。观察在600C退火温度下扩增曲线。11.4 结果11.4.1 成立条件进行实时荧光定量PCR检测，阳性对照能够扩增出S形曲线(参见A.8、A.9)，Ct值在预期的范围之内C3日，阴性对照无荧光增幅现象，则表明反应体系运行正常，可以进行结果判定。11.4.2 结果判定阴性反应结果判定:检测结果无Ct值的反应判为阴性反应，即检验样品中羊传染性腺癌病毒核酸阴性。阳性反应结果判定:检测结果。值35，且扩增曲线有明显的对数增长期，判为阳性反应，即检验样品中羊传染性腺癌病毒核酸阳性。对于35Ct值40的样品，应进行重复试验。如果重复试验的ct值40，且曲线有明显的对数增民期，判为阳性反应。12 综合判定12.1 可疑NY/T 3235-2018 符合流行病学、临床症状和病理变化特点，为羊传染性腺癌可疑病例。12.2 确诊符合流行病学和临床症状、病理变化的病例，电镜形态学观察、PCR、实时荧光定量PCR结果中有一项检测结果为阳性，可判定为羊传染性腺癌确诊病例。样品病毒分离培养、动物接种试验检测结果为阳性且电镜形态学观察、PCR、实时荧光定量PCR检测中有一项为检测结果阳性，可判定为羊传染性腺癌病毒分离阳性。7 NY/T 3235-2018 附录A(资料性附录)相关图片及基因序列资料A.1 口唇处出现大小不等的疵状增生A.2 羊下唇内侧蒙古膜桑喜状肉芽增生A.3 正常棋牛肾细胞图(x100)8 NY/T 3235-2018 A.4 病变棋牛肾细胞图(x 100)A.5 羊传染性腺癌病毒电镜负染图A.6 聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因序列羊传染性腺癌病毒FlL基因部分序列CGenBank:FJ808075.1)550 g accccgagct catggtctac cccggcgggt acgacgtctc gctagacgcc tacatcatca acgtcggcgg catgaagaag ctctacgacg cgatcatcaa ggagggaggg ctgcgcagcg gcctgctcac cgaggtgttc acgctggaga agcggctctc tctggcgcgc gtggtgctct ccggcgccga gcaggtggtc taccccgagt actacataca ggtgaagacg cggc 784 A.7 聚合酶链式反应(PCR)产物电泳图9 NY/T 3235-2018 说明:M一-DL 2000 Marker:|归性样品.2000 bp一-一1000 bp一一750 bp 500 bp一一-250bp-100 bp-一一M A.8 实时荧光定量PCR扩增目的基因序列2 2一一阴性样品。羊传染性腺癌病毒IL-10-like protein(ORFV127)gene基因部分序列(GenBank:KP339943.1)213 cagtatgc tactcacaca gtcgctcctc gacgacttca aaggctacct cgggtgtcag gcactctctg agatgataca gttttact-tg g 301 A.9 实时荧光定量PCR结果图100 iE2坦岳t、75 只lE5。句式25 O 5 10 说明:l 阳性对!lf!:2一二阳性样品;10 15 20 循环25 30 3一一-阴性对照。-一一l唱一一-2唱一-335 40 B.1 穰牛辜丸细胞制备与培养(含青霉素2000IU/mL、B.1.2 取出辜丸放入mol/L PBS缓冲液(B.1.3倒出PBS2000 IU/mL B.2.3 PBS缓冲液(后放入370C恒温水B.2.5 用吸管吸出B.2.6 用灭菌4层生l于细胞培养瓶(细胞量4X10 B.3 胎羊皮肤细胞的制备与培养附录B(规范性附录)原代细胞制备与培养NY/T 3235-2018 中，加人灭菌0.01次。o IU/mL、链霉素2次，第三次加肾脏置于(含青霉素浮。细胞营养液悬浮细胞，分装B.3.1 无菌取出健康胎羊腹部或后肢内上侧皮肤小块，放入灭菌平皿中，用眼科剪刀剪成o.5 mm3 1 mm3的小块。B.3.2 用灭菌0.01mol/L PBS缓冲液(含青霉素2000IU/mL、链霉素2000mg/mL,pH 7.07.2)的冲洗数次，直至无血液;用MEM冲洗3次，倒掉MEM后移入灭菌三角烧瓶内。B.3.3 加入皮肤组织4倩体积的O.2岛5%膜蛋白酶溶液冲洗2次，第三次加入膜蛋白酶榕液后放入3盯70C恒亘温水浴箱中消化3omin B.3.4 用吸管吸出膜蛋白酶溶液，加人MEM细胞培养液反复吹打，使细胞分散悬浮。11 NY/T 3235-2018 B.3.5 用4层纱布过滤，滤液2000r/min离心10min，取细胞沉淀用细胞营养液悬浮，分装于细胞瓶(细胞量4X105个/mL6X105个/mU，于3rc、5%CO2培养箱中培养。12 ON-mmvN的回FZ中华人民共和国农业行业标准羊传染性腺癌诊断技术J NY/T 3235-2018 中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子店街18号楼)(邮政编码100125网址)中国农业出版社印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销*争夺争等非印张1.25 字数25千字2018年8月北京第1次印刷*开本880mmX1230mm 1/16 2018年8月第1版书号16109.4517定价34.00元长版权专有僵权必究举报电话(010)65005894 NY/T 3235-2018