SN∕T 5227.5-2019 出口食品中牛源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA法）(出入境检验检疫).pdf

以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 5227.52019出口食品中牛源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA法）Rapid detection of bovine derived ingredient in food for exportRecombinase-aid amplification（RAA）method2019-12-27 发布2020-07-01 实施ICS 67.050C 53中华人民共和国海关总署发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准SN/T 5227.52019I前 言SN/T 52272019出口食品中动物源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA法）分为 11 个部分：第 1 部分：出口食品中鸡源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；第 2 部分：出口食品中猪源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；第 3 部分：出口食品中羊源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；第 4 部分：出口食品中鸭源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；第 5 部分：出口食品中牛源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；第 6 部分：出口食品中水牛源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；第 7 部分：出口食品中马源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；第 8 部分：出口食品中驴源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；第 9 部分：出口食品中狐狸源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；第 10 部分：出口食品中貂源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；第 11 部分：出口食品中大鼠源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）。本部分为 SN/T 52272019 的第 5 部分。本部分按照 GB/T 1.12009 的规则进行编写。本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国郑州海关、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国北京海关、山东省食品药品检验研究院、中华人民共和国杭州海关、中华人民共和国拱北海关、中华人民共和国大连海关、中华人民共和国厦门海关、中华人民共和国成都海关、中华人民共和国福州海关。本部分主要起草人：苗丽、韩建勋、汪琳、霍胜楠、王娉、吴姗、罗宝正、郑秋月、孔繁德、林华、徐淑菲、郑晶。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1SN/T 5227.52019出口食品中牛源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）1 范围本部分规定了出口食品中牛源性成分（黄牛、牦牛）的 RAA 检测方法。本部分适用于出口食品中牛源性成分（黄牛、牦牛）的定性检测。此标准所规定方法的最低检出限（LOD）为 0.1%（W/W）。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 274032008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测3 术语、定义和缩略语3.1术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1.1 牛 Bovine偶蹄目，反刍亚目，牛科，牛亚科，牛属，牛属下有 6 个种，分别为大额牛（印度野牛），牦牛，瓜哇野牛（白臀野牛），柬埔寨野牛（高棉牛），原牛，野牛（白肢野牛）。3.1.2 实时荧光 RAA Real-time RAA一种重组酶介导链替换的恒温核酸快速扩增技术（简称 RAA 技术）。利用从细菌或真菌中获得的重组酶，在恒温下（一般为 3742），该重组酶可与引物紧密结合，形成酶和引物的聚合体，在单链 DNA 结合蛋白的帮助下，打开模板 DNA 的双链结构，当引物在模板 DNA 上搜索到与之完全匹配的互补序列时，在 DNA 聚合酶的作用下，形成新的 DNA 互补链，扩增产物以指数级增长。利用荧光探针的标记，随着 RAA 反应的进行，RAA 产物与荧光信号的增长呈现对应关系。3.1.3 Ct 值 cycle threshold每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。3.1.4 T 值 Time threshold每个反应管内荧光信号达到设定阈值时所需要的时间。以正式出版文本为准2SN/T 5227.520193.2缩略语下例缩略语适用于本文件。3.2.1RAA：recombinase-aid amplification，重组酶介导扩增。3.2.2DNA：deoxyribonuleic acid，脱氧核糖核酸。3.2.3CTAB：cetyltrithylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵。3.2.4Tris：tris（Hydroxymethyl）aminomethane，三羟甲基氨基甲烷。3.2.5EDTA：ethylene diaminetetraacetic acid，乙二胺四乙酸。3.2.6dNTPs：deoxyribonuleoside triphosphate，脱氧核苷三磷酸。3.2.7SSB：single stranded DNA binding protein，单链 DNA 结合蛋白。3.2.8SC-recA：Streptomyces coelicolor recombinase，天蓝色链霉菌重组酶。3.2.9BS-recA：Bacillus subtilis recombinase，枯草芽孢杆菌重组酶。3.2.10Bsu：Bacillus subtilis，枯草芽孢杆菌。3.2.11Tricine：N-tris Hydroxymethyl methylglycine，N-三羟甲基甲基氨基酸。4 方法提要以提取的 DNA 为模板，采用牛的特异性检测引物和探针进行实时荧光 RAA 扩增，根据实时荧光RAA 的增幅情况，实现对食品和饲料中牛成分的检测鉴定。5 试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合 GB/T 6682 的要求。所有试剂均用无 DNA 酶污染的容器分装。表 1 检测用引物和探针物种名称引物/探针序列（5 3）扩增片段长度靶基因牛F：ATTTCGGTTCCCTCCTGGGAATCTGCCTAATC173bp线粒体细胞色素b 基因（Cytb）R：CATTGAAGCTCCGTTTGCGTGTATGTATCGGP：CACTACACATCCGACACAACAACAGCATTCFAM-dTCTHFBHQ-dTCTGTTACCCATATCTG-C3spacer 注：目的基因序列见附录 A。F 为上游引物，R 为下游引物，P 为探针，FAM-dT，THF，BQH-dT 和 C3spacer均为探针修饰基团。5.1 CTAB 提取缓冲液（pH8.0）：10 g/L CTAB，0.7 mol/L NaCl，0.05 mol/L Tris-HCl，0.01 mol/L Na2EDTA。5.2 酚：氯仿：异戊醇=25：24：1。5.3 异丙醇。5.4 70%乙醇（V/V）。以正式出版文本为准3SN/T 5227.520195.5 TE 缓冲液（pH8.0）：10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.0）。5.6 A Buffer（缓冲液 A）：20%聚乙二醇。5.7 实时荧光 RAA 扩增体系：2.5 mmol/L dNTPs，225 ng/L SSB，300 ng/L recA 重组酶蛋白（SC-recA/BS-recA），75 ng/L Bsu DNA 聚合酶，75 ng/L Exo 核酸外切酶，250 mmol/L Tricine，12.5 mmol/L 二硫苏糖醇，250 ng/L 肌酸激酶。也可以使用等效的商品化的试剂盒代替。5.8 B Buffer（缓冲液 B）：280 mM 醋酸镁。6 仪器设备6.1 实时荧光 PCR 仪。6.2 恒温荧光检测仪。6.3 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.4 恒温水浴锅。6.5 离心机：转速 12 000 r/min。6.6 微量移液器：量程 0.5 L10 L，10 L100 L，20 L200 L，200 L1 000 L。6.7 研钵及粉碎装置。6.8 涡旋震荡器。6.9 离心管：2 mL、1.5 mL。7 检测步骤7.1 DNA 提取取 0.2 g 粉碎或磨碎的样品至一洁净的 1.5 mL 离心管中（若样品含杂质和调味品，可加入 1 mLdd H2O 洗涤两次），加入 600 L CTAB 提取缓冲液，涡旋震荡混匀后于 70 温育 15 min，期间颠倒离心管 2 次 3 次；12 000 r/min 离心 5 min，取上清于一新的干净 1.5 mL 离心管中；加入 500 L 酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），上下颠倒离心管 2 次 3 次后涡旋震荡混匀，12 000 r/min 离心 5 min；转移上层水相至一新的 1.5 mL 离心管中，加入 0.7 倍体积异丙醇，上下颠倒离心管 2 次 3 次，4 静置 30 min，4 下 12 000 r/min 离心 3 min，小心弃去上清液；加入 700 L 70%乙醇，重悬沉淀，12 000 r/min 离心 1 min，小心弃去上清液；打开管盖，室温挥发干液体，加入 50 L 100 L TE（pH8.0）缓冲液溶解 DNA，-20 保存备用。DNA 提取也可采用等效 DNA 提取试剂盒进行。7.2 DNA 浓度和纯度的测定使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测 260 nm 和 280 nm 处的吸光值 A260和 A280。DNA的浓度按照公式（1）计算：c=AN50/1000 （1）公式中：c=DNA 浓度，单位为微克每微升（g/L）；A=260 nm 处的吸光值；N=核酸稀释倍数。当 A260/A280比值在 1.71.9 之间时，适宜于 RAA 扩增。以正式出版文本为准4SN/T 5227.520197.3 实时荧光 RAA 扩增7.3.1 实时荧光 RAA 反应总体系表 2 实时荧光 RAA 反应总体系试剂体积/L实时荧光 RAA 扩增体系20 LA Buffer12.5 L正向引物(10 M)2.0 L反向引物(10 M)2.0 L探针(10 M)0.6 LDNA 模板(5 ng/L)2.0 LB Buffer2.5 L加 ddH2O 至50 L7.3.2 实时荧光 RAA 反应程序可选用以下两种扩增仪器之一进行检测，反应程序对应如下。7.3.2.1 实时荧光 PCR 仪39，60 s，1 个循环；39，30 s，40 个循环，在每次循环时收集荧光。7.3.2.2 恒温荧光检测仪39，1 min；39，20 min，第二阶段开始收集荧光。7.3.3 实验对照检测过程中分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。采用含有牛源成分的样品作为阳性对照样品，不含牛源成分的样品作为阴性对照，以与模板等体积的双蒸水作为空白对照。8 质量控制8.1 实时荧光 PCR 仪8.1.1 空白对照：无荧光对数增长，相应的无报告 Ct 值。8.1.2 阴性对照：无荧光对数增长，相应的无报告 Ct 值。8.1.3 阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的 Ct 值 30.0。8.2 恒温荧光检测仪8.2.1 空白对照：无荧光对数增长，相应的无报告 T 值（时间）。8.2.2 阴性对照：无荧光对数增长，相应的无报告 T 值（时间）。8.2.3 阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的 T 值（时间）15min。以正式出版文本为准5SN/T 5227.520199 结果判断与表述9.1结果判定9.1.1 实时荧光 PCR 仪9.1.1.1 在符合条款 8.1 的情况下，结果才能判为有效。9.1.1.2 如 Ct 值 35.0，则判定被检样品阳性。9.1.1.3 如 35.0 Ct 值 40.0，则重复一次。如再次检测结果仍然是 35.0 Ct 值 40.0，则判定为被检样品阳性。9.1.1.4 如无报告 Ct 值或无荧光对数增长则判定被检样品阴性。9.1.2 恒温荧光检测仪9.1.2.1 在符合条款 8.2 的情况下，结果才能判为有效。9.1.2.2 如 T 值（时间）15 min，则判定被检样品阳性。9.1.2.3 如 15min T 值（时间）20 min，则重复一次。如再次检测结果仍然是 15 min T 值（时间）20min，则判定为被检样品阳性。9.1.2.4 如无报告 T 值（时间）或无荧光对数增长则判定被检样品阴性。9.2 结果表述9.2.1 样品阳性，表述为“检出牛成分”。9.2.2 样品阴性，表述为“未检出牛成分”。10 检测过程中防止交叉污染的措施检测过程中防止交叉污染的措施按照 GB/T 274032008 中附录 D 的规定执行。以正式出版文本为准6SN/T 5227.52019附 录 A（资料性附录）牛源性成分的基因扩增靶标参考序列ATTTCGGTTCCCTCCTGGGAATCTGCCTAATC CTACAAATCCTCACAGGCCTATTCCTAGCAATA CACTACACATCCGACACAACAACAGCATTCTCCTCTGTTACCCATATCTG CCGAGACGTGAACTACGGCTGAATCAT CCGATACATACACGCAAACGGAGCTTCAATG注：加方框部分为引物结合区域，阴影部分为探针结合区域。以正式出版文本为准以正式出版文本为准SN/T 5227.52019SN/T 5227.52019中华人民共和国出入境检验检疫开本 8801230 1/16 印张 0.75 字数 24 千字2020 年 月第一版 2020 年 月第一次印刷印数 1500书号：1551752 定价 16.00 元出口食品中牛源性成分快速检测重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA法）行 业 标 准SN/T 5227.52019*北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023）编辑部：（010）65194242-7509中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷中国海关出版社有限公司出版发行网址