SC∕T 7238-2020 对虾偷死野田村病毒(CMNV)检测方法(水产).pdf

ICS 65.020.30 41:才叫中华人民共和国水产行业标准SC/T 7238-2020 对虾偷死野田村病毒(CMNV)检测方法Detection methods for covert mortality nodavirus(CMNV)2020-08-26发布2021-01-01实施气中华人民共和国农业农村部发布本，f，j;IfI 111全同水产标Ifi化技术委以会的AClTC156)们1-1。本衍二月1，.11!单位小同水产利于研究院且向水产研究所。*f;1fI主要起草人张JJ利、112化、JiI出!&、中i小、刘l炎、梁艳、杨冰、邱击。L、李j忌。SC/T 7238-2020 SC;T 7238-2020 对虾偷死野田村病毒(CMNV)检测方法1 范围本标lfI给出了对川、价死野111村病毒(CMNV)j业转21套式PCR检测、逆转;J1、介导iHdl扩增检测、TaqMan荧光);i二千1!:RT-PCR检测所甜的民剂和l材料、器材和设备，规定了操竹步骤和lii!f)IJt际J2IR本标11适川J于CMNVniJ检测和l监测./2 规范性引用文件WJ(I(J版本适用于本文例。儿是不itllWJ的11SC;T 7103 3 缩赂语4 4.1 4.2 4.3 4 4 4.5 异丙醇:分析纯。4.6 75%乙醉 见JIH*A J4.7 1IIIfl对，f1感染了CMNV4.8 阴性对!H不含CMNV的4.9 空白对!悦。百rHlRNasc-rrec水作为空liJN!目。lfication),-80C仇Qf。4.10 dN丁P(各2.5mmol/U，含dATP、dTTP，dC川、P、dCTP各2.5mmol/L(19混合物，一20C保存。4.11 dNTP(各1011111101/L)含dATP、正ITP、dC川、P、dCTP各10mmol/L的混合物.-20Cj1f子。4.12 dNTP(各20mmol/U含dATP、dTTP、dCTP、IG丁P各20mmol/L，见A.2.20C似存。4.l3 M-MLV逆转及附(200U;U商盯l化试剂.-20C保存，或其他等效逆转及隅。4.14 5XM-MLV逆转法肖峰缓冲液，商JJI化试剂，一20C似存，或其他等效缓冲液。4.15 1叫DNA;合同J(5U/I，U，商品化试剂，一20C保存或其他等效。NA*合附。4.16 10 X PCFi绥 J I浓荫l川化试剂，随叫DNA综合同1m供，不 含Mg21，一20C保存，或其匀效级l液。SC/T 7238-2020 4.17 MgCl,(25 mmol/U,-200C1阜存。4.18 JJl(月1吁书Ih:rl!泳级。4.19 6 X统样绥J巾被商lfJl化试剂，或其他匀效纵样缓冲液。4.20 DNA Marker,f，d，化试剂，-200C保存，或其他匀效Markcr。4.21 Il!.泳核阪染料生化tIiJ剂。4.22 JOX Isothermal八mplification8urfer:附lvl化产品，有1释为lX作液II，J内介20mmol/1.Tri日HCl,50 mmol/1.Ij，jI:l，校各刀法1的工作浓度配制.-200C保存。5 器材和设备5.1 百T)liJ移液袱。5.2 冷冻74心机。5.3 涡i是振荡器。5.4 普通冰箱。5.5-800C)也低站11fi0 5.6 于非UTi.心机。5.7 PCR 仪。5.8 电泳仪。5.9 水、1;1包括I梢。5.10 紫外观察仪或凝胶I&.1:虫仪。5.11 兰JI.J荧光定垃PCR仪。6 操作步骤6.1 样品采集6.11 采样对象凡纳i1J虾(UI户enat:lIsV(l川t川川11川t卢俨川川M 川阳川le川j川t户川川M川N)、圳;F.-11口1对虾(Pe川Il川J(.J川叫，叮川川矿P川川，川u.川/H川)川平和和11脊尾|止臼二过l虾(1:.7川卢阳川川川P川JC川Il川ud)气:(f&)!如li二i乏其他易!出生物参见C.20 6.1 2 采样数量采扩(数立f:1j合SC/丁7103的要求。6.1.3 采样部位对手，1向!本症状(参见C.3)的虾取IrFlml胀、胞、附!拔和11肌肉组织。x.t二ICI附床症状(1(11fF llk IFI帧胀、剑、和l怀tllJio6.2 样品处理JII刀J:切收30mg.yl!组织，12于1.5时，尤RNA仰的I二P笆中。2 SC/T 7238-2020 6.3 RNA提取6.3.1 取30mg50 mg样，-，1111人O.5 mL 1 mL RNAiso Plus hl:剂，研磨，军陆立于t:5 mino!loC下，12000 r/min 离心5min。以上Yi!f液至新的无J，NA阴离心1:1.1:1。担il取过程同时设，1，:1;11性刘!自、阴性M!ff 6.3.2 1J11人1/5体以的仙Ilt介至i1iii立乳化革乳白室lllut放血5mino 6.3.3 IC 12000 r/min Ii.心15mino级也收以上层水利l移至新的无RNA阴离心信1。6.3.4)111入匀体积的异口飞ilic(使J+I前预冷至一20C).1下!回你111;匀，室讯放i立10m川11门川n6.3.5 6.3.6 再r4C 7 000 r/min 7f.心5 mi I飞，小心弃上消液。五li.lu 6.3.7力11人20f.r1，JOO 释为100ng/f，L2 6.3.8可以史mjITJ6.4 Nestcd RT 浓度刷110:茧，将RNAfl;1.兀RN A附ng(I 1与i川1，稍7f.本书1的TN八。、，Jl c 比vr占舵ll A f l 6.4.2.2 如果PCR仪不具备;l!_X()JJtm，再向各科内加入50t-tI 液体主i9IN 6.4.2.3 1每1述川有逆转及cDNA的PCR竹;|1人PCI，后区，以:以下程!于迸行扩增91CTJJI变性4min;94C 20日、50C20 s、72C40 s，35个循环;72C5 min，lij-lloC仙iM月1备进行产物的Lll泳。6.4.2 4 可以使用具有同等逆转示或一步法逆转S jPCI，效果的商品化试剂余进行f!f1:6.4.3 第二轮PCR扩增技!表2的要求，在冰众上配制l除丁aDNA;合f以外的大体非mIi昆物，分:投保存于一20C。在11市月1前，1J11入相应体积的Ta DNA 合隅，混匀.跤2411./反凶分装到0.2mL PCR 11-，试剂汉反应1113 SC/T 7238-2020 卡?物在操作11才务必处于低温状态。分别)111入jvL 第一步反应产物为模板，)111人ljnf先根据第一步PCJ产物浓度，做10俯I000俏稀释。扩附和lr:为，95ocr虫变它|二4111in;9S0C变U20 s，520C退火30s,720C延fql 30 s,35个循环;720C延伸5mn;最后oC jl，t 0 li 备进行产物的11:泳。也可以使用同等边转*或一步法川、PCJ效果的商品千七试开1tr.ill行操作，使用一步法JI工PCRj商品化试)IJ企.1l:行RT-PCJ前，须将RNA悦板950C1WCj)j变怕3min 7j迅边冰浴。表2Ncstl()RT-PCR的第二轮PCR反应预混物所需试剂1式剂1111样iif.L试j市l终浓度IOXPCR缓冲液2.5 lXPCR级11YI仪MgCI(25 mn旧1/1.)2.0 2.0 mmol/L dNTP(2.5 mmol/U 2.0 200 mol/l，号|物CMNV-n-F2(10mol/I.)1.0 O.,10 ftmol/L 寻1物CMNV-n-R2(1011101/1.)1.0 O.10mol/L kl边双双15.3 l叫IlN1在介阳J(5U/L)0.2 0.01 U/L 6.4.4 琼脂糖电泳6.4.4.1 配HilJ1.5%的琼脂粉凝!除，销凝Jj企冷却l至低于600CIJ,J，按比如IJ!JII人11:泳核股染料，括:匀，fbllf:TDK脂粉I凝JJli:。6.4.4.2 1夺5VL PCJ反应产物与1Vl.6 X载样缓lll!iili6.J后)JII入JilJJJII样孔中。同时设1.DNA分子士11标I(ixJ!照。6.4.4.3 有1V/cm5 V/cm的电Fl下也泳，使DNArll负极向I似移动。当载样缓ll液中澳盼蓝指7J、剂的(川日迁移至琼JJil础凝JJ变的1/22月 处II，J作JI:也泳，将凝胶毡于紫外观察仪或凝胶成你仪下观察或拍!刊。6.4.4.4 如1*观察到顶用l大小扣，.t:IN段，对PCJ扩增产物进行训IJ序。6.4.5 结果判定6.4.5.1 阳性对J!f!第一步PCJ后在69 bp和1/或第二步PCJ后在J:lbp处有科生条iHt、阴性对!lf在619 hp刷14J:lbp处均无条;j1:f=I空II对照不I.ll现任何条fii，买!J守主击*有效。6.4.5.2 检测样IfJI第一步PCJ后在619bp处有条带和1/或第二步PCJ后在413bp处有条;fl;，J二LPCJ 产物测(纺织符合IIH*II参二号序列，可归J 11 l!11样品为ncstcdJT-PCR阳性。6.4.5.3 检测样1171第一步PCR后在619bp处无条怕日第二步PCJ)R tE J3 bp处无条带可!JII:FJneSl ed R丁PCR11t上。6.5 RT-LAMP检测6.5.1 反应体系自己制在扣。J:II前区，按表3fl(I!t，j在冰众L配HilJRT-LAMP检测反应体系，混匀后，分装为21L/笆，试剂及反应池合物在操作II，J务必处于低YLI状态;百J 1I.Ji立直以RNasc-frec水为校饭的空Wt!白。如l样乱，按阴性对!(、1j检样1171、阳性对!阳的次!于分且IJ)111人IL、总ti为J0 ng-100 ng Ti变怕的JNA校板。筒检样品RNA tlilJ备参见6.:3。反应体系配i!iIJl1:!，百采JlJ同等效果的商业化JT-LAMP试Jj1J余代替。表3RT-LiMP反应预混物所需试剂试剂111样fL剂终浓HtIOX sothcrmal Amplific:llion lufrcr 2.;:;MgS04(100 mmol!1.)1.0 4.0 mmol/l.IktaincC5 mol/U G.O 1.2 mol/L dNTP(得20mmol/U 1.2 mmol/l.CMNV-FIP(20 Itlllol/U 2.0 1.G Itmoi/l.4 SC/T 7238-2020 表3(纹)试剂)111抖l it，1.i剂终浓l且CMNV-I日P(20/.tmol/IJ 2.0 1.6 fJ.mol/L CMNV-F3(10-I.mol/!.)0.5 0.2rno1/L CMNV-):1(10/lrl10l/U 0.5 0.2mol/I.CMNV,F20 11TnOl/U 1.0 Q.g f-l_llloI/L CMNV-LlI(20mol/U 1.0 O.H Jlmo1!L M-MLV j且特，Hlj(200U/,I.)0.2 40.0 U IJ.DNA 聚合附(SU/d.)0.8 6.4 U Eva Grccn(25/ttlloJ/L)0.8 0.8 pmol/L RNasc-frcc*4.2 6.5.2 反应条件各样1117111!可实IJ，j荧光定盐PCR仪tj-I,llli择SYBR函迫.65.SOC反应60mino 6.5.3 结果判定6.5.3.1 阳性对!反应产生典型IJS形扩增1111线且空IIj(，j照.f1Jjj性刘!自反应产牛二IHSJ!;扩J(IIIII主(11、l结果有效，i1jT.J进行检J!lj结果llj定G异常结果分析和问题排除方法参见|时采D。6.5.3.2 若某1i检*1:/ftl反应产生典型S7扩增1111线，91j判定i衷样品为RT-LAMP阳性。6.5.3.3 若某彷检样品反应产生类似平革的二/1s形扩地1111线，则可判定该样品为RT-LAMP阴性。6.6 qRT-PCR检测6.6.1 反应体系配制在扩增前区.校去4的要求在冰贪七配HljqRT-PCR扩增体系，淄匀后，分装为24FL/侣，试剂及反应混合物在操作H、i务必处于低温状态;同lI.jt耸立以RNase-free水为校板的空白对!任。JJII样fJEI按空l主l对!阳、阴性对照、l检样fvl、阳性对!目的次!于分且Ij加入lL、总址J110 ng 00 n目的根饭。j检样厅，RNA 1/i1!备参.hl6.30反山体系自己thj也有I采川同匀效;祀的商业化qRT-PCR试开Ij盒代替。表4qRT-PCR的反应预i!E物所需试剂试剂加1样1让/.1试剂终浓正10XqJT-PH级11液2.5 1 XPCR缓11!lj;由Mgll2(25 mmol/U 2.0 2.0 mmol/L dNTP(轩0mmol/l.)0.5 200/1.0101/1 号|物正MNV-TAQ-F(10mol/I.)0.5 0.20/tmol/L 寻l物CMNV-TAQ-R(10rnol/U 0.5 O.20 1111101/1 探钊CMNV-TAQ-P(10J1!1lo1/I.)0.5 O.20 11molfl.M-MLV逆转录前(200U/1,1.)0.5 4 U/1.I坏，)j11元典型S形打Jo;llIII线，阳性对照的ofijfi.35.)j:J:)咒典型S形扩增1111线，实验结果有效。6.6.32 样品扩仰后，0l:l5的样本Jj7.lJUfr1金测。重新检测钻井J:)5CI值40U忖:.l111);J nf品f阳怕，SC/T 7238-2020 CI机关10样ALI为IJtl:o7 结果综合判定7.1 R二nPCR纺织!爪1111性，或R丁-LAMP纣，果也7JllJln.!I坦qRTPCR生，:!MJ/J 1 11 iI:.符合;tJ;.I可!J!IJrIJ:U:I CMNV IIIII。7.2 叫RTnPCR或wrLAMP或【JIH-PCR中的一种检测iI.丘吉JI果乒11:二百l疑川，边摊贝利ill行检测lifn认。6 A.1 75%乙醇Jl:水乙配z川RN川e-frec水定容至ili匀.空illl储存。A.2 dNTP(各20,ol/L)附录A(规范性附录)试剂配制750 mL 1 000 mL SC/T 7238-2020 1部仙化试开IJ1 dATP，dTTI气dCTP和Id(;丁P轩l竹，何;400L，浓皮1J.100 mmol/L化!J，)斤，将Lif dATP、dTI、P，dCTP和1dGTP ili合，jl!)川人OOL的无RNAnf!f7J(，充分混匀，分放到多个1.5时，的Er1rlr，-20C保存，illi:fu反j，说:1础。A.3 甜菜碱(511101/1.)称J&2.9:l g 百Jt菜I贼粉末，放入J5 n计，121心位中，力11入元RNAAi7/C使浴1k:终体积为5mL.混匀;1分法至多个1.5mL t:r 1J9,-20C保存衍JI J。7 SC/T 7238-2020 附录H(资料性附录)CMNV检测方法引物设计及其在靶基因中的位置.1 CMNV Nestcd RT-PCR引物设计及其在靶基因中的位置8 见表l主1平11陡1B.10.S:;.1-.&.-.5-3町，5-3-CCA 5-AATGCCGCCGATAAAGATGCTATGTTCAACGTCCTTTGTGCCCGCACTCAAATTCATCCCGAGACGGTAAATA 3-TTACGGCGGCTATTTCTACGATACAAGTTGCAGGAAACACGGGCGTGAGTfAAGTAGGGCTCTGCCATTTAT 5-GCCTTATCGAACGCCTGGCCAACATAACTACACCTTTTGACCCTATAATTACTGAGTTTAATGATGCCGCAAG 3-CGGAATAGCTTGCGGACCGGTTGTAlfGATGTGGAAAACTGGGAl机TTAATGACTCAAATTACTACGGCGTTCC阳V-n-R25-TAACAGTAATACCATCGGCGTT队TGGTCCAGTAGGGTCTGTGGGCACTTCGTTTGAAAGACAAGCGATAGA3-A TTGTCATT ATGGTAGCCGCAACTACCAGGT队TC(l;AACACCCGTGAAGCA!AACTTTCTGTTCGCTATCTCMNV-n-Rl 图11.1 Ncstcd RT-PCR引物在CMNV靶基因中的位置SC/T 7238-2020.2 CMNV的RT-LAMP冒|物设计及其在靶基因中的位置见表.2和图，2。表B.2 Rr-LAMP寻|物序列寻|物h夕。lvINV-F3 I(;CCAAGCAAATACG AGC了I巳MNV-113巳ATCAGCC ATCICACCCCCMNV-F1P(!、lc+T1Tr-1F2)CTCC;TI 1;ACGI;TAGI;Tl(巳;C(旷lTncc叼AAGI;A巳nccC八AACMNV-l生lP(1 1 c I-TTn+1l2)(CTCCAAAAGGACITCCGCA lTITfGGAI;ACnCGTCACI;C CMNV-LF CITCACCG巳lTr(;(;ATACICMNV-I日GATIGCAI，;CG1CAAlrCA 注:11物CMNV-FIP和CMNV-B1P;1物巾。，J(JrIT1T为援止HYJ.JlJ干1lJ1.，j扩j怦效草。CMNY-陀、CMNY-F25-GACAAGCGATAGfGCCAAGCAAATACGAGCl1AA1tCAAGCACTTCCCGACAN GGTATCCAAAGCCGTGA 3-CTGTTCGCTATCTTTT ACGGTTCGTTTATGCTCGA TTAGGTTCGTGAAGGGlGTT仁CATAGGTTTCGGCA叫CMNV-lc飞CMNY-LF5-GCGCGGTTCGCAACCTAACCGTCGACGAC:GCCCCGGAGGC仁GTCCAAAAGGACCTCCGCTCljGATTGCA叫3-_0:GCCA&凹GGATTGGCA呗吧?可GGGGCCTCCGGCAGGTT1TCC阴阳rrAGAC画面而已CMNY-LBCMNY-Flc 5-GTCAACCTC GCGTGACCAAGGTCTCCAAGGCCGTGACATCGCTGATGGACAAGCCGACAGTGGTAGCGTAC 3-GCAGTTGGAGT仁GCACTGGTTCCAGAG$TC机GCACTGTAGCGACTACTGTTCGGCTGTCACCATCGCATGCMNY-2 CMl可Y-3图B.2 RT-LAMP引物在CMNV靶基因中的位置,3 CMNV TaqMan逆转录qR1三PCR寻|物设计及其在靶基因中的位置寻|物CMNV-TAQ一l、CMNV-八Q-ICMNV-TAQ P 表B.3 CMNV TaqMan逆转录qRT-PCI号召|物序列可|物作)lIJ(5-3)t(;AGCTAATClAAI;CACTC 八CCTCTril川;TACC;CTAClA FAM CC;CTCACGCC1Tln;ATACCIT-1、!MRAC INY-TAQ-F、号|物价ivt886-905 1 063 1 Ogl 日门9325-AGCAAATA仁GAGCTAATCCAAGCACTTCCGACAAGGTATCCAAAGCCGTGAGCGCGGTTCGCAACCTAACC3-TCGTTTATGCTCGATTAGGTTCGTGAAGGGCTqTTCCATAGGTTTCGGC肌TCGCCAAGCGTTGGATTGGCMNY一TAQ-P5-GTCGACGACGCCCCGGAGGCCGTCCAAAAGGACCTCCGCAATCTGATTGCATGCGTCAACCTCAGCGTGACC 3-CAGCTGCTGCGGGGCCTCCGGCAGGTTTTCCTGGAGGCGTTAGACTAACGTACGCAGTTGGAGTCGCACTGG 5-AAGGTCTCCAAGGCCGTGACATCGCTGATGGACAAGCCGApTGGTMCGTACCTAACAGGTCTGCCCCC 击，TTCCAGAGG川CCGGCACTGTAGCGACTACCl、GTTCGGCTWCACCATCGCATGGATTGTCCAk;ACGGGGGCMNV-TAQ-R 图B.3逆转录qRT-PCRI物及探针在CMNV革巴基因中的位置9 SC/T 7238-2020 附录C(资料性附录)对虾偷死野田村病毒(CMNV)C 1 生物学特性)(.)川、偷死盟111村病市(covcrtmortalit:y nodavirus，CMNV)在分类上隶属于1牙III村病71i科野111村病毒剧(jJoc/aviridae，AL卢!tal川dav川us)，其基|到ll为阴节段的单庄正义RN八，病25粒子1二1l(ij体形，无1M!跤，直径约)2nm，是引超虾类1-l)JJ性偷死病(viralconverl rnon ality clisease,VCMD)的病原。忠VCMD的)(.)虾在养殖水瓶较高(28C以J:JII-)死亡卒较而，祟讨死亡半为60%80%。C2 易感宿主CMNV的7;甘二范111很J，自然在i主包括养殖凡纳在毛对虾、1罔l川对虾、日本必)(.1虾、版J1XJ虾以及脊尾1rF气忖二要养殖虾类。该病712还可以感染梳足类、校角类、血出版蛮、多毛类、寄居蟹、拟l王l阳虫)JG平.11工扰梭子11;:书见的甲壳类动物，以及卿、虾虎鱼平:113寻衅气?淡水利向水鱼类。C3 1临床症状CMNV感染的发病叉.)虾常出现JFFJ.民服颜色变浅、吁l壳软、空J防空白、生l王级f业气?症状，很多11-)候i王可见病虾j胆节肌肉不透明或局部发II;原位杂交检测fdyk，虾关怀.jJ技丰11川、丝1病萄载iit、病丑l!1111伤严重。感染CMNV的鱼类多表现出IIF!球突出或游泳异常等症状。10 SC/T 7238-2020 附录D(资料性附录)RT-LAMP结果分析和问题排除RT-LAMP结果步l川ii:是原|对分析和l问题111徐建议见表D.1 表D.lRT-LAMP结果分析实验i!i*t占#1:岁1凶足以l叫分析问题扫|除阳性对!(1反iU;I.:S形扩I竹I liJ线且空白对mt有119ItlM!(反it:J:l:平宜的非打用IliJRT-I.AMP反)1:11古:I，M报仇士是lS恰样Alll反)，i.(生s形jJJ竹IliJ线或广生放平:tJ:fij lI扩Jflllll线11斗AMP反向失败检手UI1换RI一IMP反州试剂.检奇阳怕对，叫反hiif生平的I扩J削iJ线RI二I.AMP f.,J of:Ji:l1f 1 1而l阳tiM!Ii失放更央町l性;H!I(1反附体系配制，t;K句:将低ill!确保自己制反州体系全品1在冰上进行做M移液:m污染,iJUI 设立专川做!t移H，阴性对!(扣/或.2臼对!(!反!的巾I，SJB扩b如l污染!1i快试剂JfllliJ线H、应污染泊Wr)，、验可(及19i川仪陈设千叶报刊污染)JII西if立!J盘空Ilj及以作阳i，INAJ足以失败Itx降lil(.检在缸JlkRNA J9i rn试剂I!;Oc.,ill:fJr j、验确认样川树鲜品H立|阳性MIi!tll四IttM!，1叫.(IU知4|;15样JTJ 01)皿/01，均比(，来确定团其，1由lthl二t条，iiyRN八不tl成RNA浓l豆过7-:)(Ju，;j为1.8-2.O.:-f低于1.6 j!J农示蛋白股过多RT-I.AMP 抑制物介入li:1ii JJ(样，促JlkINA.illlH R川MP反州JtIl制物确认制备RT-I.AMP自1悦物和|扣的r(lIIIWI对!(U豆INj生非SJB11非E线JB扩RT-LAMP反山剂抖常价制、试剂质itt或lf!J负1疑b占1/企;ili11J 用IlIltl(nllu丑控制异检夜荧光;lLIPCR仪反1、u体系配制时;K保持低rlulfiff!c1!J反附体系全机在冰上进行111利;H!l!失放1J.!j奥问l性对!凹Irl性对!削、空白对!H、旧l性对川Mll柯川反向1豆)ii.剂失效更J且也反)但i节l且.;/.生平!IJ1I书呐IliJ线打Jf1f￥Jf设lt.检有帧l认扩JW片仪揣设f奇故仰检f或更换尖光JllfP巳R仪11 ONON-RNh H川，网农业山版丰1:H版(北京市，J/qllx:6i子J.lr街18号楼)l呵JJ1:)Jt京印刷一厂印刷!新华I-JJl1r JJ发行Jfr发行轩j也新华二|川市f1f.ij牛*01111政编的100125,.f!1j 1 可数20千，.2020年12JJ 北京第1(大印刷l4民71本880mmX1230mm1/16 2020年12片刻I版书号J6109.8361 定价24.00元毛版权专有侵权必究举报电话(010)59194261 SC/T