NY∕T 3862-2021 茶云纹叶枯病监测技术规程(农业).pdf

JCS 65.020.01 CCS B 04 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 3862-2021 茶云纹叶枯病监测技术规程Technical code of practice for monitoring tea brown blight disease 202-05-07发布2021-11-01实施h缸中华人民共和国农业农村部发布NY/T 3862-2021 l 茶云纹叶枯病监测技术规程范围本文件规定了条云纹叫枯病的监测H才期、监测点和11It，则方法。本文件适用于全同各茶区茶云纹111枯病的111测。2 规范性引用文件下列文件中的内容仅该日Wlj(;j-应的版本适文件。NY/T 5018 3.1 3.2 3.4 五点式取样法先确定对角线的中点作为取样方法。3.5 发病率disease incidencc 发病的普遍程度，用病II-/，(柴、株)数占调查总IIh柴、株)数的百分率表示。3.6 病情指蚊disc出cindcx(Dl)根据一定数目的植株或植株糕自各病级数量计算平均发病程度的数值。4 鉴定方法4.1 样品采集NY/T 3862-2021 其中，注日期的引用文斗，有的修改单)适用于本，主要危害II-/，的分布与危对随机选取叶片先进行自测，对出现黄绿色至深浅褐色、灰白色相间不规则形病斑H十片进行现场鉴NY/T 3862-2021 定.并采集11十片进行室内鉴定。危害症状见附录A。4.2 实验室鉴定4.2 1 形态特征鉴定将可疑的病变组织，剪成O.1 cmXO.4 cm小片，在.O%(V/V)次级股俐溶液中消毒5mIn，灭菌水冲洗3次，灭菌滤纸吸干水分后.置于马铃骋葡萄糖)j(脂培养基平板上，每IIIl放fl3片4片.25C培养，3 d后开始观察.自丰甜l镜下发现有茵丝l呈阳，立自挑取菌落边缘菌丝，转入马铃革葡萄糖琼脂培养基上纯化培养。7d J而有显微镜观察，记录其形态特衍，参!I;t录At/li述的病原iiif;态特i:进行鉴定。4.2 2 实时荧光定量PCR法鉴定从现场采间的样品采用实1I才荧光定ilJ:PCR法进行分子鉴定，实验步骤按附录B的规定执行.4 3 结果判断4.3.1 病原形态特征鉴定当从采集的样1日叶片中分离获得的病原菌瑞养性状或形态特征应符合附录At品述特征，目11可，rJ定为样本中含茶云纹rq枯病菌。4.3.2 实时荧光定量PCR法鉴定样品采用实时荧光定量PCR法进行分子鉴定，如果空白对!i目和l阴性对!西没有扩增，同时阳性对照有有效扩增，表示测定结果可靠，并根据阳性对m和l阴性对照的ct值判断茶11十是忏有茶云纹IIt柑:病菌.5 监测方法5 1 监视l植物对茶云纹rq-枯病感病和l抗性较差的茶树品种和l品系。5 2 监视l时期每年的5月1O月。5 3 监视l内容5 3.1 病情调查法每个县(地区)选取代表性的3个5个条同作为观抽!IJ点，锦个点要求2.0商以上茶同而积。采用5点式取样法每点随在fl选取50个叫片，每隔lOd调查一次。将机l查结果1人表C(见附录。5 3.2 分级标准茶云纹rq枯病的分级标准如下.0级元病;1级病就EU町帜占整片nH町积的10%以下，2级病斑面积占整片叶而积的10%25%;3级，病斑面积占整片叶l面积的25%50%;4级，病斑面职占整片叶面积的50%以上.5 3.3 发病率和病情指数按照分级标Iftx材、区的发病情况进行调查和l记录，计算发病率和l病情指数(0/)。发病率计n方法为.发病率=发病111-数/调盒总H十数XI00%病情指数计:l-l方法为.01=2:，(各级级i直该级病11卡数)/(iJf，Jfi:总数最高级俏)X 100 6 调查记录记录鉴定和调查的方法、过程和l结果，并存档(见附录D、附录E)。2 A1 分布与危害附录A(规范性)茶云纹叶桔病NY/T 3862-2021 茶云纹叶枯病又称111-枯病，是条同中最常见的一种II-r部病害。在各产茶省(区)均有发生，尤以浙汩、湖北、湖南、云南、广东等省发生较重。除危害茶树外，还危害油茶和l山茶。在生l衰弱、台)(11茶同以及抨桶苗剧中发病较重。11十片Hli病后，光合作用强度明显减弱，呼吸作用增强，病株叶片提早脱落，枝捎回扣11导致树势衰弱，产盘下降，严重H才，茶同呈现一片中占褐色。t，I)龄茶树可致全株枯死。A2 症状主要危害成I汁和I老111-，也有l危害新有i、枝条和l果实。H十部病斑多从叶缘或IIj尖发生，初步j黄树色水浸状，半圆形或不规则形，后变制色，一周后病斑r11中央向外渐变灰白色，边缘黄绿色，形成深浅梢色、灰白色相间的不规则形病斑，并生有波状、云纹状轮纹。后期病斑处生针头状大小的黑点，沿轮纹相;ylj，此为病在J分生袍子却。枝条病斑短条状或梭状，稍下|白，绕茎扩展，幼芽染病变黑枯死，果实上形成JW褐色至灰白色圆形病斑(见阁A.)。图A.1 茶云绞叶枯病发病叶片典型症状A.3 病原形态病原菌为山茶刺:fiH包fjj(CuLLelul川h.l川ca川eLLiaeMassee)，周元性型其lii1Iif包纲(Coelomyceles)黑盘泡目(Melanconialcs)刑I:fiHil照(Ctlelol门cI/.l川，)。分生于包子和浅如:状，宽187m-290Vm，加上!可生黑褐色束rj状刚毛，刚毛具1个-3个隔!慌，基部粗，顶端尖钝而色较泼，大小(1O-70)mX(3-5)m。分生袍子梗无色，柱状，大小(6-42)I-，mX(1.5-4.5)m(见r月A.2)。分生于包子l主椭圆形，!(=!胞，无色，直或稍弯，内含1个-2个近透明前I1球，大小(14-2 1)VmX(3-6)m(见阁A.2)。附着胞形状不规则，7;1具浅裂，棕色到深棕色(见罔A.21。有性态为山茶球!在MCGuignardiacamelliae uter，属于子袋菌门(Ascomycota)腔菌纲(Ioculoascomycctcs)座袋li目(Dothideaceae1座必菌科(Dolhideales1黑腐幽腐(Guig I/ardi川，不常见。子袋座J;IO或扁五、JJ，直径60m-150m，黑褐色。子第1棍棒形，顶揣囚，基音jl狭细，大小为(44-62)m X(8-121m，内含8个子缆于包子，排成二列。子裳袍子纺锤形、梢iJQJ J或卵J，无色，单胞，常具1个-3个泊球，大小为(10-18)m X(3-61m。A.4 病原生物学特性病原菌的分生于包子萌发的最适imdJr范例为23C-29 C，菌丝生长的最适lild主范围为27C-29 C;NY/T 3862-2021 标号11于号说明l 分生袍子梗;2、3-一分是仁抱子.1、5一一附在f胞.注:标尺J甘示l王度为10m.图A.2山茶刺盘于包菌病原形态致死拍IlU且为60C;茵丝生长的最适pH范因为5.2-5.8.于包子萌发的最适pH范旧是5.0-6.0;光!对病fii生长应JJt及分生于包子萌发影响不大，但对;Jt产袍的影响很大，特别是有光!与元光!处理!之间差异.!著，光!m有利于分生袍子的形成。A.5 病害循环病原以菌丝体、分生泡子fiIi.或子级先在茶树病11十古11或土表格叶中越冬。翌春条件适直H仁越冬分生袍子m:ig二分生袍子或经子装壳产生子盖亚袍子，经7)(浸泡后成熟释放，随风雨传桶01书茶tlUI)嫩11.1-表皮或伤口仪人，经5d-18 d潜育形成新病斑，在新的病斑部位产生新的分生泡子经风雨传桥.ill行再侵染。A 6 发病规律云纹11十书ii病是一种在高温高湿性条件下适1军发生的病害。适1且范围内，温度到高，可以促进病隘的发育，刘缩短i品育期，多雨高湿有利于袍子的形成、传桶和萌发侵入，致使病害发展.当平均气I/，j高于20C、相刘湿JJ80%时菌丝开始伸展蔓延;气lliI，达到25c以u时，袍子大量产生.27 C-29 C是病fJi发育的最远:ilU鼠肢，也是病害传播的盛期。平均气洲24c-30 C时潜育期为5d-9d;平均气1M，20 C-24 c 时消育期为10d-13 d;平均气温低于16C时潜育期为13d以上。附录B(规范性)NY/T 3862-2021 茶云纹叶枯病菌实时荧光定量PCR法鉴定8.1 主要试lfJJ马铃料葡萄柑:lJ，(JJ旨附养基盼、级仿、J于.戊醉、异丙醉、ddH,()o B.2 主要设备(12 000 仿:异等体积的经过预过灭!M19萄心宫中B.4 山茶刺盘子包菌特IrrJ ilr.i引物HZDP3-F5-CA 互补引物。HZDP3-R5-GGTGATGCTTTGGCGTATGA-3;PVP40，-章ii基乙IW，RNAase-A、TllqMan探钊、Tq聚合酶、管。反/Jlili合试剂(氯.力11人与上消液的絮状沉淀置于经A，取2J.LL DNA样1.80视为合格，剩余探钊，HZDP3-P 5-rCG TCAGA TCCAGTCA TCTCCT AGCC头了。其中报告基团为6-FAM，猝灭基因为TAMRA，分别标在探钊的5揣和3时的.8.5 实时荧光定量PCR扩增反应检测过程中分别设阳性对!自(山茶刺f.U包EZl挺取的D:-.!A)、阴性对!(其他真I边提取的DNA)和l空白对!(!(元13i7)0。反应体系为25J.LL包析10X缓冲液2.5L，INTP(2.5 mmol/U 2L，同源和l互补可|物(Omol/mL)备。.5 I儿，丁叫Man探钊(l0mol/mL)0.5/，L，DNA模版2.0L和1Taq聚合nl(5U/UO.2L，J1j dclH，O补充至总体积25Lo5 NY/1 3862-2021 实时荧光定量PCR反应参数设置-50 C 2 min;95 C 10 min;95 C 15 s,60 C 1 min，40个循环。8.6 结果判断空l句对!悦和l阴性对!自没有扩i白，同时I!F.!性对!有有效扩增，表示测定结果可靠，并似据I!H性和11!fI上对!峨的 Ct且对检测结果进行判断。典型的茶云纹1-材剧扩地1111线和标准1111线见.7和1.8,B.7 典型的茶云纹肘枯病菌实时荧光定量ICR扩增曲线其中，横坐标是循环数，纵坐标是荧光报告集团的荧光发射强度。23.0 22.0 21.0 20.0 19.0 18.0 17.0 主16.0 x 15.0 14.0 斟13.0 12.0 王军11.0 4时10.0溟9.0 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0 电:-.0.:牛肉草、棋手edevl一一一一-一一一2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 循环数B8 茶云纹叶枯病菌标准曲线其中，横坐标是DNA盘(ng/L)，纵坐标是荧光阀值(Ctl。6 NY/T 3862-2021 35.0 34.5 34.0 33.5 33.0 32.5 32.0 31.5 31.0 30.5 30.0 29.5(G)埋理棋棋29.0 28.5 28.0 27.5 27.0 26.5 26.0 25.5 25.0 24.5 24.0 23.5 23.0 卢,100 注:!M J!i.(11?Ii云纹川枯的酶DNA，按1m原谊、10汗、100俯、l000 g耐释后进行实时荧光定量PCR扩增.我份各浓皮条11下的f.将r仰liiiJt IIR xt敬的后与对应(100 fIj1 J ll!标准1111线，其1相Jjf;l!i r.t(ng/11,)(10 x.t数的与ofll之间的钱!吕关系为y=-l.101 8.l+38.313.R2=O.99 4.30 20 10 3 4 5 2 DNA盘(nwL)0.2 0.1 0.02 0.01 NY/T 3862-2021 附录C(资料性)茶云纹叶枯病病情调查记录茶云纹111-枯病病情调查记录表见表C.10 表i也点8 NY/T 3862-2021 表C.1(续)No.l No.2 No.:1 No.-1 No.5 叶数附级叶数击可级叶数州级l叫数的级叫放?山级40 40 40 40 40 41 41 41 41 41 42 42 42 42 42 43 43 43 43 13 44 14 44 44;11 45 15 45 45 45 46 16 46 46 46 47 47 47 47 47 48 48 48 48 48 49 49 49 49 49 50 50 50 50 50 注此表fII干川在记录每个茶111-)七然百纹叫枯病的病级.9 NY/T 3862-2021 附录Dl资料性)茶云绞叶枯病病菌鉴定结果记录茶云纹11.柏到1j病凶鉴定结:!.I记录表见表0.1。表0.1茶云纹叶枯病病菌鉴定结果记录表编号采样地点品种名称样品敏挝iJ荷I囱fif菌1Ti检测日JVJ险测人注此表川l斗二ic)让茶z纹叶枯病l班的坦、fI J荧光定扯PCR鉴定纺*.其巾，带菌放Jl;!J!i:栋1111111线平l1lr样irt讨rr.10 附录E(资料性)茶云绞时枯病病情调查汇总去号云纹11-1咐i病病情调查汇总表见表E.10 表，.NY/T 3862-2021 病书11指数11 FNON-B的HFZNY/T 3862-2021*中同农业出版(北京市电IJ阳区麦于店(111/1政编码100125网址www.ccap.COIl1.c.:n)北京科印技术咨i向服务有限公司印刷新华-15月时北京发行所发行各j也新华书m经销争舍势*印张l字数20千字2021年10月北京知l次印刷l提开本880mmX1230mm 1/16 2021句，10月第l版I号16109.8719 定价34.00元x 版权专有侵权必究举报电话(010)59194261 NY/T