SN∕T 5189-2020 鮰类肠败血症检疫技术规范(出入境检验检疫).pdf

以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 51892020鮰类肠败血症检疫技术规范Quarantine protocol for Enteric septicemia of channel catfish2020-12-30 发布2021-07-01 实施ICS 65.150CCS B 41中华人民共和国海关总署发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准SN/T 15892020I前 言本文件是根据 GB/T 1.12020 给出的规则起草。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国福州海关、中华人民共和国厦门海关、福州市疾病预防控制中心。本文件主要起草人：郑腾、张志灯、张体银、唐寰宇、王武军、李宋钰、白泉阳、郭书林、李文最。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1SN/T 15892020鮰类肠败血症检疫技术规范1 范围本文件规定了鮰类肠败血症的临床诊断、细菌分离、生化鉴定及聚合酶链式反应鉴定技术。该文件适用于鮰类肠败血症的临床诊断和实验室检疫。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法SC/T 7014 水生动物检疫实验技术规范SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范SC/T 7214 鱼类爱德华氏菌检测方法3 术语、定义本文件没有需要界定的术语和定义。4临床诊断4.1群体检查发病鱼池往往水质较差，病鱼沿池边离群独游，反应迟钝，摄食量下降或不摄食。患病初期，病鱼胸鳍侧常有直径为 3 mm5 mm 的损伤，外部如针状的创伤，并深入到肌肉。有的病鱼头朝上、尾朝下呈垂直状游动，部分病鱼有时呈痉挛式的螺旋状游动，继而死亡。4.2个体检查因鮰鱼规格和个体免疫力等差异，鮰类肠败血症的临床症状不尽相同，主要表现出急性型和慢性型两种形式。急性型又称为肠道败血型，最为常见，死亡率高，主要表现为败血症和肠炎。病鱼体表出现褪色斑，腹部肿胀，有的头部和躯体皮肤溃疡，一侧或两侧眼球突出，肌肉有点状出血或出血斑。鳃丝苍白并有出血点，鳃盖、腹部、颌部和鳍条基部皮肤出现瘀斑和出血，有的则出现白色斑点，肛门红肿，后期病鱼出现全身性水肿。慢性型又称为头盖穿孔型，病菌最初感染部位是鼻根的嗅觉囊，再经嗅觉器官移行到脑，形成肉芽肿性炎症。后期头背颅侧部溃烂形成一个深孔，直到裸露出整个脑组织，形成似“马鞍”状的病灶；随着病情的发展，病灶中心形成溃疡，表现为“头盖穿孔型”病症。以正式出版文本为准2SN/T 158920204.3解剖检查剖开病鱼腹腔，内有大量含血或清亮的液体，流出的腹水不易凝固。肝水肿、质脆，有出血点和灰白色的坏死灶；脾和肾肿大、出血；胃膨大；肠道扩张，肠粘膜水肿、充血、发炎，肠腔内充满气体或淡黄色的水样液体；有时还伴随有套肠出现。脑组织形成肉芽肿，肌肉具弥散性肉芽肿性炎症。4.4临床检查判定群体检查和个体检查中出现以上病症，结合剖检结果，可以初步判断为疑似鮰类肠败血症，需要进一步进行实验室诊断。5实验室诊断5.1设备5.1.1光学显微镜。5.1.2培养箱（28 1 和 37 1）。5.1.3水浴锅。5.1.4高速离心机。5.1.5微量可调移液器。5.1.6PCR 仪。5.1.7电泳仪。5.1.8紫外凝胶成像系统。5.1.9酒精灯。5.2材料和试剂5.2.1水，应符合 GB/T 6682 所规定一级水的要求。5.2.2血液琼脂平板，配制方法见附录 A.1。5.2.3吕氏碱性美蓝染液，配制方法见附录 A.2。5.2.4结晶紫染色液，配制方法见附录 A.3。5.2.5革兰氏碘液，配制方法见附录 A.4。5.2.6沙黄复染液，配制方法见附录 A.5。5.2.7半固体琼脂管，配制方法见附录 A.6。5.2.8四甲基对苯二胺 1%水溶液，配制方法见附录 A.7。5.2.9Hugh-Leifson 培养基，配制方法见附录 A.8。5.2.10磷酸盐缓冲液（PBS），配制方法见附录 A.9。5.2.11TE 缓冲液（pH 8.0）配制方法见附录 A.10。5.2.12十二烷基硫酸钠（SDS）。5.2.13蛋白酶 K。5.2.14氯化钠（NaCl）。5.2.15十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）。5.2.16氯仿。5.2.17异戊醇。5.2.18水饱和酚。5.2.1970%乙醇。5.2.20Taq DNA 聚合酶。以正式出版文本为准3SN/T 158920205.2.21脱氧核苷酸三磷酸 dNTPs（含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP）。5.2.22引物（Primer）：10 moL/L。根据鮰鱼爱德华氏菌酶表达蛋白基因（Eip）序列设计，扩增长度为 276 bp。上游引物 ESC-CM3：5-TCA TCA CAT CAT CTA GCG ATT-3下游引物 ESC-CM4：5-CTT TAC ACA GAT AGG CGA TAC-35.2.23琼脂糖（电泳纯）。5.2.24TAE 电泳缓冲液，配制方法见附录 A.11。5.2.25上样缓冲液，配制方法见附录 A.12。5.2.26DNA 相对分子质量标准物 Marker，推荐使用 100 bp DNA ladder。5.2.27DNA 纯化回收试剂盒。5.2.28鮰爱德华氏菌，菌种保藏编号为 ATCC 33202。5.3样品的采集样品的采集和运输按 SC/T 7103 的规定执行。5.4细菌的分离和鉴定5.4.1样品的处理无临床症状鱼可以无菌采集其肠、肾、肝和脑等内脏器官作为样品，也可直接采集病灶组织作为样品，样品采用无菌生理盐水冲洗并捣碎后进行分离培养。对于体表有临床症状的鱼，可以采用无菌棉拭子或经灭菌后的接种环插入病灶深处的组织取样。5.4.2细菌的分离将样品按常规方法划线接种于血液琼脂平板（配制方法见附录A.1），28 1 下培养24 h48 h。挑取圆形、灰白色、边缘整齐、湿润、呈半透明状的单个优势菌落在血液琼脂平板上再次划线分离纯化。5.4.3染色及形态学观察5.4.3.1病料涂片的美兰染色取病鱼的肾、肝和脑等组织进行涂片，在酒精灯火焰上固定，冷却后用吕氏碱性美蓝染液（配制方法见附录 A.2）染色 1 min3 min，水洗，待干后镜检。5.4.3.2培养物涂片的革兰氏染色培养物涂片后在酒精灯火焰上固定，滴加结晶紫染色液（配制方法见附录A.3），染色1 min后水洗。再滴加革兰氏碘液（配制方法见附录 A.4），作用 1 min 后水洗。滴加 95%乙醇脱色约 30 s；或将 95%乙醇滴满整个涂片后立即倾去，再用 95%乙醇滴满整个涂片，脱色 10 s。水洗，滴加沙黄复染液（配制方法见附录 A.5）复染 1 min。水洗，待干后镜检。5.4.3.3菌体形态鮰爱德华氏菌革兰氏染色阴性，呈杆状，多为单个存在，无芽胞，无鞭毛。5.4.4生理生化试验5.4.4.1运动性试验将分离菌穿刺接种于半固体琼脂（配制方法见附录 A.6）两管，分别置 28 1 和 37 1 以正式出版文本为准4SN/T 15892020下培养 24 h。如分离菌由穿刺线向四周扩散，其边缘呈云雾状，为运动性阳性；如分离菌只生长在穿刺线上，边缘十分清晰，为运动性阴性。5.4.4.2氧化酶试验吸取四甲基对苯二胺 1%水溶液（配制方法见附录 A.7）滴在细菌的菌落上。菌落呈玫瑰红色或深紫色的为阳性，不变色的为阴性。5.4.4.3葡萄糖氧化与发酵（O/F）试验挑取分离菌穿刺并划线于 Hugh-Leifson 培养基（配制方法见附录 A.8）上，于 28 1 下培养18 h24 h，如果开口管和封口管内的培养基都产酸（变黄）则分离菌为发酵型（F），如果开口管变黄色而封口管不变色则为氧化型（O）。5.4.4.4其他生化试验镜检观察符合 5.4.3.3 的分离菌，当满足以下条件时：运动性检查表现为 28 下为阳性且 37 下为阴性；氧化酶试验为阴性；O/F 试验为发酵型，分离菌可以鉴定为肠杆菌科。肠杆菌科的分离菌可以按 SC/T 7014 和 SC/T 7214 的规定开展鮰爱德华氏菌的生化特性检测（参见附录 B）。5.4.4.5判定分离菌既符合肠杆菌科特性，又符合附录 B 结果，则分离菌鉴定为鮰爱德华氏菌。如果是部分指标符合应进一步采用 PCR 进行鉴定。5.4.5聚合酶链式反应（PCR）5.4.5.1DNA 提取可以取鱼的脑髓、肝脏、脾脏或肾脏，按 1：10（W/V）加入 PBS 缓冲液（配制方法见附录 A.9），匀浆后作为样品，12 000 r/min 离心 1 min，倒去上清液；也可以从普通营养琼脂平板上挑取经纯培养的可疑单菌落作为样品，悬浮在 1 mL 的 PBS 缓冲液中，12 000 r/min 离心 1 min，倒去上清液。在沉淀中加入 567 L 的 TE 缓冲液（pH 8.0）（配制方法见附录 A.10），混匀后，加入 30 L 的 10%SDS 和 3 L蛋白酶 K（20 mg/L），混匀。56 下温浴 1 h 后，加入 100 L 的 NaCl（5 mol/L），混匀。加入 80 L CTAB/NaCl 溶液（10%CTAB 和 0.7 mol/L NaCl），混匀。65 下温浴 10 min 后，加等体积氯仿/异戊醇（体积比为 24：1），混匀，12 000 r/min 离心 10 min，取上清液，加等体积的酚/氯仿/异戊醇（体积比为25：24：1），混匀，12 000 r/min离心10 min，取上清加0.6倍体积异丙醇，轻轻混匀，12 000 r/min离心 10 min，取沉淀，用 70%乙醇清洗两次，干燥，加 100 L 的 TE 缓冲液（pH 8.0）溶解。也可使用等效的商品化 DNA 提取试验盒。5.4.5.2PCR 扩增PCR 反应体系包括 10PCR 缓冲液 2.5 L、2.5 mmol/L 的 dNTP 0.5 L、10 mol/L 上游和下游引物各 0.5 L、5 L 模板 DNA、5U/L 的 Taq DNA 聚合酶 0.5 L，补充水至 25 L。PCR 反应条件为：94 预变性 5 min，之后 94 变性 30 s，55 退火 30 s，72 延伸 45 s，共 35 个循环；72 补充延伸 10 min，4 保温。以鮰爱德华氏菌标准株作为阳性对照，以大肠杆菌作为阴性对照，用水作为空白对照。也可使用等效的商品化 PCR 扩增试验盒。5.4.5.3琼脂糖凝胶电泳用 TAE 电泳缓冲液（配制方法见附录 A.11）配制 2%的琼脂糖凝胶。将凝胶放入水平电泳槽，使以正式出版文本为准5SN/T 15892020电泳缓冲液刚好淹没胶面。将 6 L 样品和 1 L 上样缓冲液（配制方法见附录 A.12）按比例混匀后加入样品孔。在电泳时使用 DNA 相对分子质量标准物 Marker 作对照。5 V/cm 电泳约 0.5 h，当指示剂到达底部时停止。5.4.6测序用凝胶成像分析系统观察核酸条带并判断结果，经核酸扩增电泳后，如出现一条大小约 276 bp 的DNA 片段，应对其切胶回收后进行测序，参考序列参见附录 C.1。5.4.7结果判定经核酸扩增电泳后阳性对照会出现一条大小约 276 bp 的 DNA 片段，而阴性对照和空白对照没有该核酸条带。待检样品经核酸扩增电泳后，在阳性对照相应位置上有条带并经测序验证者为阳性。无条带或条带的大小不是 276 bp 的为阴性。6综合判定结合发病症状和病理变化，初判为疑似鮰类肠败血症。需采样进行细菌分离、镜检、生化鉴定和聚合酶链式反应。经细菌分离、镜检和生化鉴定和/或经聚合酶链式反应扩增出 276 bp 片段并经测序验证判为阳性，判定为鮰类肠败血症；无临床症状和病理变化，但经聚合酶链式反应扩增出 276 bp 片段并经测序验证判为阳性，可判定为携带鮰爱德华氏菌。以正式出版文本为准6SN/T 15892020附 录 A（规范性）试剂配制A.1血液琼脂平板的配制蛋白胨 10 g牛肉高 5 g 氯化钠 5 g 琼脂 10 g20 g水 1 000 mL煮沸至充分溶解，121 高压15 min20 min，待其自然冷却至50 左右时加入50 mL抗凝羊血（除去纤维）或兔血。混匀后分装制成平板，保存于 2 8 条件下。A.2吕氏碱性美蓝染色液的配制美蓝 0.3 g95%乙醇 30 mL0.01%氢氧化钠溶液 100 mL将美蓝溶解于 95%乙醇中，然后与氢氧化钠溶液混合。A.3结晶紫染色液的配制结晶紫 1 g95%乙醇 20 mL1%草酸铵水溶液 80 mL将结晶紫溶解于 95%乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。A.4革兰氏碘液的配制碘 1 g碘化钾 2 g水 300 mL将碘与碘化钾先进行混合，加入水少许，充分振摇，待完全溶解后，加水至 300 mL。A.5沙黄复染液的配制沙黄 0.25 g95%乙醇 10 mL水 90 mL将沙黄溶解于 95%乙醇中，然后用水稀释。以正式出版文本为准7SN/T 15892020A.6半固体琼脂管的配制琼脂 0.35 g0.4 g水 100 mL将琼脂放入水中，煮沸使其溶解，调节pH至7.4，分装小试管。121 高压灭菌15 min。直立凝固后，保存于 2 8 条件下。A.7四甲基对苯二胺 1%水溶液的配制四甲基对苯二胺 1 g水 90 mLA.8Hugh-Leifson 培养基的配制蛋白胨 2 g 氯化钠 5 g 磷酸氢二钾 0.3 g 琼脂 4 g 葡萄糖 10 g 0.2%溴麝香草酚蓝溶液 12 mL 水 1 000 mL 将蛋白胨和盐类加水溶解后，调节 pH 至 7.2，加入葡萄糖和琼脂煮沸，溶化琼脂，然后加入 0.2%溴麝香草酚蓝溶液，混匀后，分装试管，121 高压灭菌15 min，直立凝固，保存于2 8 条件下。A.9磷酸盐（PBS）缓冲液的配制磷酸二氢钾 0.24 g磷酸氢二钠 1.44 g氯化钠 8.0 g氯化钾 0.2 g加水至 1 000 mL。A.10TE 缓冲液（pH 8.0）的配制A.10.11 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）50 mL 的配制称取 Tris 碱 6.06 g，加水 40 mL 溶解，滴加浓 HCl 约 2.1 mL 调 pH 至 8.0，定容至 50 mL。A.10.20.5 mol/L EDTA（pH 8.0）50 mL 的配制称取 EDTA-Na22H2O 9.306 g，加水 35 mL，剧烈搅拌，用约 1 g NaOH 调 pH 至 8.0，定容至 50 mL。（EDTA 二钠盐需加入 NaOH 将 pH 调至接近 8.0 时，才会溶解。）A.10.31TE（10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；1 mmol/L EDTA，pH 8.0）的配制：1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）1 mL 以正式出版文本为准8SN/T 158920200.5 mol/L EDTA（pH 8.0）0.2 mL 加水至 100 mL。A.11TAE 电泳缓冲液（50 倍浓缩液）242 g 的 Tris 和 37.2 g 的 Na2EDTA2H2O，加 800 mL 水充分搅拌溶解后，加入 57.1 mL 的醋酸，加蒸馏水定容至 1 000 mL，室温保存。使用时用蒸馏水稀释 50 倍即可。A.12上样缓冲液溴酚蓝 100 mg，加双蒸水 5 mL，在室温下过夜，待溶解后再称取蔗糖 25 g，加水溶解后移入溴酚蓝溶液中，摇匀后定容至 50 mL，加入氢氧化钠（NaOH）溶液滴，调至蓝色。以正式出版文本为准9SN/T 15892020项目结果项目结果吲哚产生*-甲基红试验-枸橼酸盐利用*-KCN 肉汤中生长-丙二酸钠利用*-V-P 反应-硫化氢产生*-醋酸盐利用-硝酸盐还原+ONPG-色素-尿素分解-苯丙氨酸脱氨酶-赖氨酸脱羧酶+精氨酸双水解酶-鸟氨酸脱羧酶d接触酶+DNA 酶-脂酶-明胶水解-D-葡萄糖产酸产气+D-侧金盏花醇-七叶苷水解-纤维二糖-卫茅醇-myo-肌醇-乳糖-麦芽糖+D-甘露醇-D-山梨醇+蜜二糖-甲基-D-葡萄糖苷-棉子糖-L-鼠李糖-水杨素-L-阿拉伯糖*-甘油-蕈糖（海藻糖）*-D-木糖-蔗糖*-酒石酸盐利用-D-甘露糖*-黏液酸盐-注：无符号“*”者为科内不同种属鉴别项目，有“*”者表示为属内种间鉴别项目。“+”为阳性反应，“-”为阴性反应，“d”为阳性或阴性反应。附 录 B（资料性）鮰爱德华氏菌生化特性检测以正式出版文本为准10SN/T 15892020附 录 C（资料性）参考序列C.1PCR 扩增的鮰鱼爱德华氏菌酶表达蛋白基因（Eip）序列：TCATCACATCATCTAGCGATTCCTGTAGCATCTTCAACAGCGCGCCAAAGGATGTTGAATCGAACTTCAGCTCATGACTGATGACAACATCCGCCATGCGTAGTACCTCGATAGGCATCACCGCCGCACTGTAAAACCCGGCTTGCCGCTTTGGCTTTGGGCCCAGTTGTTGCCACCGCTTGTCATCATCAGTGAGATCGTCAATATTCATTATGTGCTCCTGCCGATGTAGCCTATCTGTATAAAGCGGAAGGGGTATCGCCTATCTGTGTAAAG以正式出版文本为准以正式出版文本为准SN/T 51892020中华人民共和国出入境检验检疫开本 8801230 1/16 印张 1 字数 28 千字2021 年 6 月第一版 2021 年 6 月第一次印刷印数 1500书号：155175150 定价 18.00 元鮰类肠败血症检疫技术规范行 业 标 准SN/T 51892020*北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023）编辑部：（010）65194242-7509中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷中国海关出版社有限公司出版发行网址