SN∕T 5199-2020 家畜家禽成分DNA条形码检测技术规范(出入境检验检疫).pdf

以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 51992020代替 SN/T 11622002家畜家禽成分 DNA 条形码检测技术规范Inspection protocol for livestock-derived and poultry-derived ingredients with DNA barcode method中华人民共和国海关总署发 布ICS 07.080CCS B 432020-12-30 发布2021-07-01 实施以正式出版文本为准以正式出版文本为准ISN/T 51992020前 言本文件按照 GB/T 1.12020 的规定起草。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国拱北海关、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国重庆海关、中华人民共和国郑州海关、中华人民共和国南京海关、中华人民共和国厦门海关。本文件主要起草人：罗宝正、薄清如、邵建宏、王勤、赵福振、吴绍强、廖秀云、吕继洲、徐海聂、聂福平、陈轩、沙才华、郑传发、杨俊、苗丽、唐泰山、孔繁德。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1SN/T 51992020家畜家禽成分DNA 条形码检测技术规范1范围本文件规定了家畜、家禽成分 DNA 条形码检测方法。本文件适用于家畜、家禽单一物种样品的检测，不适用于多物种混合样品中动物成分的检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T 27401实验室质量控制规范动物检疫GB/T 27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语、定义和缩略语3.1术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1.1 家畜livestock人工饲养驯化且可以人为控制其繁殖的哺乳纲动物，如猪、牛、绵羊、山羊、马、驴、骡、骆驼、兔、猫、狗等。3.1.2 家禽poultry人工饲养的为了获取其肉、卵和羽毛等的鸟纲动物，一般为雉科和鸭科动物，如鸡、鸭、鹅等，也有其他科的鸟类如火鸡、鸽子、鹌鹑等。3.2缩略语下列缩略语适用于本文件。CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethyl ammonium bromide）。Cytb：细胞色素 b（cytochrome b）。DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleic acid）。EDTA：乙二胺四乙酸（ethylene diaminetetraacetic acid）。Na2EDTA：乙二胺四乙酸二钠（ethylene diaminetetraacetic acid disodium salt）。Tris：三羟甲基氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)aminomethane）。PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）。TBE：缓冲液（tris-borate-EDTA buffer）。以正式出版文本为准2SN/T 519920204原理DNA 条形码（DNA barcode）是指生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的 DNA 片段。在遇到一种未知物种或者物种的一部分时，通过描绘其组织的 DNA 条形码，与国际数据库内的其他条形码进行比对，如果与其中一个相匹配，便可确认物种。本标准使用的PCR 引物可以同时扩增家畜、家禽甚至更多脊椎动物的一段线粒体（mitochondrion）DNA，通过序列分析和比对，进行物种鉴定。5试剂和材料5.1DNA 提取试剂5.1.1裂解液，配制方法见附录 A。5.1.2苯酚。5.1.3三氯甲烷与异戊醇混合液（按 24:1 的比例混合）。5.1.43 mol/L 乙酸钠。5.1.5无水乙醇。5.1.670%乙醇。5.1.7TE 缓冲液（Tris-EDTA buffer），配制方法见附录 A。5.2PCR 扩增试剂5.2.1Master Mix（2）。5.2.210 mol/L 上游引物（序列 5-CCC-CGC-CTG-TTT-ACC-AAA-AAC-AT-3）。5.2.310 mol/L 下游引物（序列 5-GCT-CCA-TAG-GGT-CTT-CTC-GTC-TT-3）。5.2.4双蒸水，应符合 GB/T 6682 的要求。5.2.5去离子水，应符合 GB/T 6682 的要求。5.3凝胶电泳试剂5.3.12%琼脂糖凝胶。5.3.2TBE 溶液（1），配制方法见附录 A。5.3.3溴化乙锭或焦红。6仪器设备6.1电子天平。6.2微量移液器。6.3恒温水浴锅。6.4台式冷冻离心机。6.5核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.6PCR 检测系统。6.7电泳仪。6.8凝胶成像分析系统。以正式出版文本为准3SN/T 519920207检验步骤7.1概论7.1.1样品总 DNA 提取、DNA 浓度和纯度测定、PCR 扩增、凝胶电泳分析过程按照 GB/T 27401 和 GB/T 27403 的要求进行。7.1.2对于干制样品，应首先进行水洗清理表面或刮掉表面可能污染的动物或人源 DNA。对于新鲜样品，应从样品内部取样。7.1.3设立质控阴性对照和阳性样品对照，阴性对照、阳性对照和检测样品使用相同方法提取 DNA。阳性对照使用任意一种家畜、家禽肉样（如牛、羊、猪、鸡、鸭、鹅等），阴性对照使用任意一种非脊椎动物肉样（如虾、螃蟹、海星等），阴性样品应无其他动物和人源 DNA 污染。7.1.4可以使用等效的 DNA 提取试剂进行 DNA 提取。7.2样品总 DNA 提取7.2.1对于固态样品，如肌肉、内脏、皮毛、牙齿、骨骼、头角等，应充分碾碎、研磨、混匀，取约100 mg 作为被提取物；对于液态样品，应充分振荡混匀，取约 200 L 作为被提取物。7.2.2将被提取物转移至 1.5 mL 离心管中，加入 700 L 裂解液（5.1.1），置于 65 中水浴 3 h，期间不时振荡混匀。7.2.3经 13 523 g 离心 5 min 后，取上清液并转移至新的 1.5 mL 离心管。加入等体积苯酚（5.1.2），充分混匀后，13 523 g 再离心 5 min。7.2.4取上清液，加入等体积三氯甲烷与异戊醇的混合溶液（5.1.3），充分混匀，13 523 g 离心 5 min。7.2.5取上清液，加入 1/10 体积的乙酸钠溶液（5.1.4），混匀后再加入 2 倍体积-20 预冷的无水乙醇（5.1.5），-20 静置 1 h，13 523 g 离心 5 min 后，弃去上清液。7.2.6用 70乙醇（5.1.6）洗涤一次，在超净台内室温下晾干，加入 50 L TE 缓冲液（5.1.7）溶解沉淀，制成 DNA 溶液。7.3DNA 浓度和纯度的测定取 5 L DNA 溶液，用双蒸水（5.2.4）稀释至 1 mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计检测 260 nm 和 280 nm 处的吸光值 A260和 A280。当 A260/A280的比值介于 1.71.9，浓度介于 10-3 g/L10-1 g/L 时，适宜 PCR 扩增。DNA 的浓度按式（1）计算：C=AN52/1 000（1）式中：CDNA 浓度，单位为微克每微升（g/L）；A260 nm 处的吸光值；N核酸稀释倍数。7.4PCR 扩增7.4.1体系在冰盒中配制下列反应体系，每个检测反应体系共计 25 L，其中 DNA 溶液（10 ng100 ng）2.0 L。向每个PCR反应管中加入配制好的反应混合液。可以使用等效的PCR扩增试剂。反应体系如下：Master Mix（2）12.5 L；上游引物（10 mol/L）1.0 L；下游引物（10 mol/L）1.0 L；以正式出版文本为准4SN/T 51992020双蒸水 8.5 L；DNA 溶液 2.0 L。7.4.2加样在各 PCR 反应管中分别加入制备好的样品、阴性对照和阳性对照 DNA 溶液，空白对照使用水作为模板。盖紧管盖后混匀，瞬时离心 5 s10 s。7.4.3扩增进行 PCR 扩增，反应结束后保存于 4 环境中。反应参数为：94 预变性 5 min；94 变性 30 s，58 退火 30 s，72 延伸 30 s，共 35 个循环；72 延伸 5 min。7.5凝胶电泳分析取 PCR 扩增产物 5 L 置于 2%琼脂糖凝胶（5.3.1）和 TBE（1）溶液（5.3.2）中，以 110 V 电压进行 30 min 电泳，电泳结束后使用凝胶成像分析系统观察并记录结果。不同动物扩增出的目的条带大小在 249 bp 左右略有变化。7.6测序和比对将呈现目的条带的扩增样品进行测序，测序后的结果在 GenBank 中使用 BLAST 功能对序列进行检索比对。8结果判断与表述8.1有效性原则以下条件应同时满足，否则本次实验不成立：空白对照：无特异性条带；阴性对照：无特异性条带；阳性对照：有显著条带且大小正确。8.2结果判断按照 7.6 的方法对测序结果进行检索比对，同源性超过 97%且同源性最高的判定为所检测样品的物种。8.3结果表述如果样品 PCR 扩增和测序成功，GenBank 中比对与（如牛）物种序列同源性超过 97%且同源性最高，表述为“样品检出（如牛）成分”。如果样品 PCR 扩增未成功，结果表述为“样品未检出家畜、家禽成分”。以正式出版文本为准5SN/T 51992020附录A（规范性）DNA 提取裂解液、TE 缓冲液和 TBE 溶液（1）的配制A.1裂解液A.1.1称取 CTAB 10 g、Tris 6.1 g、NaCl 41 g、Na2EDTA 3.7 g 置于 1 L 烧杯中，加入双蒸水约 800 mL，充分搅拌混匀。A.1.2根据实际温度环境，使用浓 HCl 和 NaOH 调节 pH 值至 8.0。A.1.3继续加双蒸水定容至 1 L 后，室温保存。A.2TE 缓冲液A.2.1称取 Tris 121.1 g 置于 1 L 烧杯中，加入双蒸水约 800 mL，充分搅拌混匀，根据实际温度环境，使用浓 HCl 调节 pH 值至 8.0，继续加双蒸水定容至 1 L，得到浓度为 1 mol/L、pH 值为 8.0 的 Tris。A.2.2称取 Na2EDTA 186.1 g 置于 1 L 烧杯中，加入双蒸水约 800 mL，充分搅拌混匀，根据实际温度环境，使用 NaOH 调节 pH 值至 8.0，继续加双蒸水定容至 1 L，得到浓度为 0.5 mol/L、pH 值为 8.0 的Na2EDTA。A.2.3将上述两种溶液按比例混合，得到最终浓度为 10 mmol/L Tris 和 1 mol/L Na2EDTA 的 TE 缓冲液，室温保存。A.3TBE 溶液称取 Tris 54 g、硼酸 27.5 g，与 A.2.2 所述 0.5 mol/L Na2EDTA（pH 8.0）20 mL 置于 1 L 烧杯中，加入双蒸水 1 000 mL，充分搅拌混匀，得到 TBE 溶液（1），室温保存。以正式出版文本为准以正式出版文本为准以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫开本 8801230 1/16 印张 0.75 字数 16 千字2021 年 6 月第一版 2021 年 6 月第一次印刷印数 1500书号：155175107 定价 16.00 元家畜家禽成分DNA条形码检测技术规范行 业 标 准SN/T 51992020*SN/T 51992020北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023）编辑部：（010）65194242-7509中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷中国海关出版社有限公司出版发行网址