NY∕T 2295.1-2012 真菌微生物农药 球孢白僵菌 第1部分：球孢白僵菌母药(农业).pdf

ICS 65.020.01 B 15 中华人民共和国农业行业标准NY/T 2295.1一2012真菌微生物农药球抱白菌菌母药第1部分:球抱自Fungal pesticides-Beauveria bassiana-Part 1:Beauveria bassiana technical concentrates(TK)2012-12-24发布2013-03-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T 2295.1-2012 前吕NY/T 2295真菌微生物农药球泡白值菌为系列标准，分为两部分.-一第1部分z球泡白僵菌母药;第2部分，球范白僵菌可湿性极剂.本部分为NY/T2295的第1部分.本部分按照GB/T1.1给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.本标准由农业部种植业管理司提出并归口.本标准起草单位:农业部农药检EE所、中国农业科学院植物保护研究所。本标准主要起草人:林荣华、姜辉、农向群、张泽华、袁普奎、王晓军、韩先国、刘琼、王红、王以燕。I NY/T 2295.1-2012 1 范围真菌微生物农药球抱臼僵菌第1部分:球范白僵菌母药本部分规定了球抱白僵茵母药的要求、试验方法、检验与验收以及标志、标签、包装、贮运。本部分适用于以分生袍子为主要成分的粉状球抱白值菌母药。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注目期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 191 包装储运图示标志GB/T 1601 农药pH值的测定方法GB/T 1604 商品农药验收规则GB/T 1605 商品农药采样方法GB 3796 农药包装通则GB/T 8170-2008 数值修约规则与极限数值的表示和判定GB/T 161501995 农药粉剂、可湿性粉ifiJ细度测定方法3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3 1 球范自僵菌母药Beauveriabass阳natechni也IIcentrat四(TK)由球泡白僵菌纯菌种经液固两相发酵而获得的高含量分生抱子粉，通常情况下还会包含伴随发酵过程的少量生物组分和化学杂质。3.2 含乎也量spore content 每克球抱白僵菌母药中所含的分生袍子数量。33 活抱率rate of living spores 球抱白僵菌母药中可萌发的分生袍子数占抱子总数的百分比，单位为百分率(%l。34 活抱量tnwnber of living spores 在单位质量球于国自僵茵母药样品中能正常萌发或能形成菌落的分生泡子数量。3 5 菌落形成单位colony formi吨units(CFU)是将球抱白僵菌母药用水稀释后得到的泡子悬浮液通过涂布的方法，让其单个分生抱子分散在琼脂平板上，待培养后每一活的分生袍子形成一个菌落.RP-个菌落形成单位(CFUl.通过肉眼观察商落的数量来推算单位微生物农药样品中的活抱子含量。1 NY/T 2295.1-2012 3.6 杂菌率rate of microbial conlaminants 球于包白f也菌母药样品中除了球抱白ff，f菌外，其他菌(其商和细菌等)盘占总商量的百分率。3.7 贮存稳定性storage stability 珠、于包白fl1l菌母药在室温和I(或)低于室i且下贮存-定时间后，产品的活抱数占其标明值的相对百分率。4 要求4.1 外观通常为白色或浅灰白色粉末。由于发困苦基质的不同颜色倘有差异，但应为均匀疏松的粉末，不可有闭块。4.2 指标球抱内倒菌母药质量控制项目指标应符合表1要求。表1球范臼僵菌母药质量控制项目指标Jjlj 日指析、fE抱敖.袍子/g或FU/g二8.ox 1010 杂闲事.%运3pl-!6.0-8.0 干燥诚jj，%;8 制度(通过J50m试验筛).%二主90贮存稳定性，%二剧。为定WI检验项目，3个月检测一次.5 试验方法除非另有说明，试验方法所用试剂级别为化学纯及以上，所用溶液均为水溶液.5.1 抽样按照G/T1605规定进行样品的采集，用随机数表法确定抽样的包装件，最终抽样盐不少于100 g。抽样时从不同部位随机抽取至少3个样点的抱子粉，混合均匀，采样时还应特别注:15、样品的代表性和避免污染，采样容器和采样t具应经过消毒灭商，样品采集后应立即进行检验，若不能立即检验，可贮存在4C冰箱中。5.2 菌种鉴别常规检测主要根据代表菌株的形态学特征进行菌种鉴别，并可辅助lTS等基因序列分析、自应商毒素鉴别等手段.当对鉴别结果有争议或者需要进行法律仲裁检验时，应到具有菌种鉴定资质的单位，将待检菌种与模式菌种进行比对，由专家确认后，出具，菌种鉴定报告，作为仲裁依据。形态学特征观察:以划线或稀释涂布法将样品在马铃薯葡萄糖培养基(PDA)平板上纯化培养，观察菌落特征，用JJJ.微镜观察袍子及产泡梗等细胞形态特征，对比球抱臼值菌的形态学描述参见附录A)进行鉴定。5.3 活抱量测定可采用1起微计数法或平板菌落计数法，单位分别为抱子/g或CFU/g，5.3.1 显微计数法5.3.1.1 方法提要2 NY/T 2295.1-2012 将样品润湿，配制成袍子悬浮液，并稀释至适当倍数，在显微镜下用血球计数板测定含抱量.并将样品接种到培养基平板上，培养后于显微镜下观察袍子萌发率.最后根据含抱量和抱子萌发率计算活抱击宜。5 3 1.2 仪器和试fIlJ5,3,1.2,1 仪器a)天平:精度为0.001g.b)移液器220L-200L.200L-I000L.0 恒温振荡器.d)旋涡混合器2转速注2000r/min.振幅5mm.c)显微镜物镜目镜倍数400倍。f)血球计数板1/400mm XO.1 mm精度.25X 16规格。g)计数器1-9999.h)高压蒸汽灭菌器。j)超净工作台.j)恒温培养箱.5,3.1.2.2 试剂a)Tween-80.b)煎糖.c)琼脂。5.3.1,3 含于自量测定5,3.1.3.1 试验步.a)按5.1规定抽取样品.b)称取母药样品1.00 g.共称取3个试样作为3个重复。在每份样品中加入0.05%Tween-80溶液100mL.浸泡30min，使袍子充分润湿，然后振荡30 min，得到稀释100倍的抱子悬浮液.d)用移液器从溶液中部移取袍子悬浮液2mL i1J试管中，加蒸偏水8mL.于旋涡混合楼上振荡约30 s，进行梯度稀释(稀释至血球计数板5个中格袍子数为100-300)并用血球计数板在显微镜下观察计数。每样品重复点样计数3次，取平均值.5,3.1.3.2计算试样中的含抱量按式(1)计算.K X 400 N,X 10 K X N,X 10 x=:_,_-(1)0,1 X 80 X 3 6 式中-X一一含抱蠢，单位为抱子/g(CFU/g),t一一为称取样品序号，i=1，2，3;K一稀释倍数;N 3次计数的5中格抱子数的平均值.5.3.1.4 活抱翠的测定5,3.1.4.1 试验步禀a)SA培养基(煎糖2%，琼脂1.5%)经商压蒸汽灭菌后凉至50C左右，制成lmm.2mm厚的平板。b)按5.3.1.3.1操作步骤称样、润湿、稀释、计数，然后配成1.0XI0于包子/mL的袍子悬浮液.c)接种100L袍子悬浮液到SA培养基平板上，并用曲玻棒涂布均匀，重复3个平板。3 NY!T 2295 1-2012 dJ 在25C28C下培养12h24 h，于显微镜(10X 40)下观察平板，统计抱子萌发数和于包子总数。以芽笆长度大于抱子半径计为萌发泡子。每平饭观察多个视野，累计观察于包子总数不少于300个。5.3.1.4.2计算活抱率按式(2)计算。y.，坐了X100.-.,式中Y二一一活抱率，单位为百分率(%);N，一萌发袍子总数，单位为个;N2 未萌发抱子总数，单位为个。5.3.15 i舌抱鼓的计算活抱数按式(3)计算。Z二xx y.(式中Z二一活础数，单位为袍子/g(CFU!g);X一含抱量，单位为于包子/g(CFU!g);Y 活拖率，单位为百分率(%)。5.3.2 平板菌落计数法5.3.2.1 试剂和溶液a)试剂Tween-20或TritonX-LOO;马铃薯葡萄糖培养基(PD八)。bJ 溶液0.05%Tween-20或0.05%Triton X-100。5 3.2.2 主要仪器、设备aJ 天平:精度为O.01 g;bJ 移液器，20ILL200 11.，200L1 000L;c)高压蒸汽灭凶器gd)超净工作台，c)恒温振荡器，f)恒温培养箱.532.3 实验步骤5.3.2 3.1 样晶的准备在无菌操作条件下，将样品搅拌均匀，准确称取1.00 g样品，溶入100.0mL的舍。.05%Tween 20或0.05%Triton X-100的无菌水中浸泡30min后，振荡30min，得到稀释100倍的样品溶液，标记为0号。然后参照表2(以稀释6次为例)进行样，度稀释表2梯度稀释示例编号O 1 2 3 4 5 6 灭商在体积，时，100.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0-_.-加入上一稀样浓度溶液的体积.时，1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 J.0 罪H稀释倍数10-2 10-3 10叫10-10-10-7 lO-R 4 NY/T 2295.1-2012 5.3.2.3.2 涂板计数将上述各梯度稀释液分别吸取100L于PDA平板上，并用曲玻棒均匀涂布在整个平板表面，每l稀释度做3次重复，然后置于25C下培养24h48 h后，选择适宜的稀释度，取菌落数在20个150个之间的平板进行计数.5.3.2.3.3 计算a)若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范周内，则计算该稀释度3个重复平饭菌落数的平均值，再将平均值乘以相应的稀释倍数.作为每克母药中的菌落数.如第6号稀释度3个平板的商落数(CFU)分别为79、80、81，则该母药的含抱最为:N=(79+80+81)/3J X 10 X 10=8.0 X 101OCFU/g b)如有两个连续稀释度的平板菌落数均在适宜计敏范围之内，贝IJ接式(4)词算.N=c/(1 X nl+O.1 X n2)X O.1 X dJ.(4)在机之数;落U菌/)U板口而叶数阳落落帷附中甜、U宜缸咀样MH位板单平户L井NZnl 一一第1个适宜稀释度的调查平板数;一一第2个适宜稀释度的调查平板数;第1稀释度的稀释因子.2 2 d 示例:如果第一稀粹度(O勺的菌落数(CFU)为140、148、142，第二稀释度00-勺的菌落数(CFU)为20、21、23，贝u根据式(4)计算.N二(140十14 8+142+20+21+23)/(lX3+0.1X3)XO.IX I0J=1.50XJO!CFU/g 5.4 杂菌辜的测定接5.3.2方法进行测定，用营养琼脂培养基(NA)检测样品中的细菌杂菌，用PDA培养基检测样品中的真菌杂菌。然后统计总的可见杂茵茵落数量，杂菌率按式(5)计算.x=一旦1土旦L一X100 .(5)N1十N2十N，式中zx一一杂菌率，单位为百分率%);N1一一细菌杂菌菌落数的总和，单位为CFU;N,真菌杂茵茵落数的总和，单位为CFU;N，一一有效成分球泡白僵菌菌落数总和，单位为CFU。5.5 pH的测定按GB/T1601的要求进行测定.5.6 细度的测定按GB/T16 150一1995中2.2的规定进行测定.5.7 干燥减量的测定5.7.1 仪器、设备扁形称量瓶z直径40rmn;电热干燥箱控温范围(50C200C)，误差土2C;干燥器.5.7.2试验步骤称取试样10g(精确至1mg)，置于预先恒童的称量瓶中，将此瓶放人105C土2C的电热恒泪干燥NY/T 2295.1-2012 箱内干燥.1h后取出，在干燥器中冷却至室温，称重。5.7.3 测定结果干燥减:!it按式(6)计算，式中-w=旦二旦1X 100.(创?W一-干燥以蠢，单位为百分率(%);m 试样的质量，单位为克(g);m，一干燥);j试样的质量，单位为克(g)0 5.8 贮存稳定性5.8.1 方法键要将试样密闭放宜于5C贮存12个月或20C25C贮存6个月后，对活础数进行测定，计算其占标明值的百分率，要求不低于80%。5.8 2 仪器、设备冰箱，恒温箱控I范周(0C500C).控混误差土2 C;玻璃瓶带有密封盖或瓶塞，能充分保证其密封性。5.8.3 试验步骤将20g试样放入玻璃瓶中，使其铺成平滑均匀层，密封后置于5C冰箱中放置12个月或20C25C恒温箱中放置6个月后按5.3方法测定样品中的活抱数，并计算其占标l!ij值的百分率。6 产品检验与验收应符合(J1l/T1604的规定。极限值的处理应按GB/T 8 170-2008中4.3.3的要求进行。7 标志、标签、包装、贮运71 标志、标签产品的标志、标签应符合GB3796的规定，同时注明贮运条件.7.2 包装包装应符合GB3796和IGB/T 191的规定。7.3 贮运贮运时严防日H同及35C以上高温，置于阴凉干燥处.运输时，注意轻放，防止破损。不得与有毒有害物质混装、混运.7 4 安全在使用说明书或包装标签上应注明毒性、防护措施等.7.5 保质期在正常贮运条件下，质量保证期从生产日期算起.6个月内产品活抱数不低于标明值的80%06 附录A(资料性附录)有效成分描述A.1 中文通用名称:球抱白僵茵茵+菌株编号。A.2 拉丁学名:Beau四川abassiana(Bals.)Vuill.NY/T 2295.1-2012 A.3 分类地位:真核生物域(Eukaryota);真菌界(Fungi);双核亚界(Dil日rya);子集菌门(Ascomycota);盆菌亚门(Pczizomycotina);粪壳菌纲(Sordariomycetes)j肉座菌亚纲(Hypocreomycetidac);肉座菌目(Hypocreales);虫草科(Cordycipitaceac);虫草属(Cordyce户s);球抱虫草的无性型(Anamorph01 Cordyce户s缸ssiana)。A.4 形态学特征分生袍子和分生袍子梗无色s产抱细胞轮生、簇生或单生于菌丝上，小梗瓶状，即下部膨大，上部细长呈瓶颈状，产抱轴短小，向顶部合轴式产抱呈z型排列;分生袍子单，生或疏松的聚生，不串生，球形，直径1.8m2.5m;该茵场养初期商落为白色，后逐渐变为乳白色，商丝疏松呈绒毛状，产袍子后呈粉状。A.5有效成分主要存在形式分生袍子。A.6 主要生物活性杀虫。A.7 培养保存条件最迢生长温度为25C30C;适合培养基为马铃薯葡萄糖培养基(PDA);适宜贮存温度为OC4C。7