SY∕T 7471-2020 近地表油气指示微生物检测方法(石油天然气).pdf

ICS 75-010 Ell 中华人民共和国石油天然气行业标准SY/T 7471-2020 近地表油气指示微生物检测方法Detection method of near-surface indicator microorganisms for oil and gas exploration 2020-10-23发布2021-02-01实施国家能源局发布SY/T 7471-2020 目次前言.II 1 范围-2 规范性引用文件.3 术语、定义和缩略语13.1 术语和定义3.2 缩略语.1 4 仪器和设备5 材料和试剂26 样品采集2 6.1 选址与定点.2 6.2 样品采集.26.3 包装与保存7 样品制备7.1 清洗灭菌7.2 琼脂培养基制备7.3 土壤或沉积物稀释液制备8 菌落检测48.1 样品接种.4 8.2 菌落培养48.3 菌落计数.49 质量要求.4 附录A(规范性附录)培养基组分5SY/T 7471-2020 目IJ1=1 本标准按照GB/T1.1-2009(标准化工作导则第1部分:标准的结构和编写给出的规则起草。本标准由石油地质专业标准化委员会提出并归口。本标准负责起草单位:中国石油化工股份有限公司石油勘探开发研究院无锡石油地质研究所、中国石油化工股份有限公司胜利油田分公司石油工程技术研究院、中国科学院南京土壤研究所、中国农业科学院农业部沼气科学研究所。本标准主要起草人:许科伟、杨帆、汤玉平、顾磊、李武、王国建、汪卫东、胡娟、贾中君、承磊、杨禄。II SY/T 7471-2020 近地表油气指示微生物检测方法1 范围本标准规定了近地表jt壤或沉积物样品采集与保存及指示油气的甲皖氧化菌、T:民氧化菌的培r，.-/.-.-.-.;,:养、检测方法与质量要求。本标准适用于近地表主壤或沉积物样品中指示油茸的甲炕氧化菌、丁烧氧化菌的培养与检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用Mr其最新版本(包括所有的修改幸)适用于车文件。GB/T 31456-2015 在油与天然气地表地球呢学勘探技术规范3 术语、定义和缩略语3.1 术语和定义3.1.1 3.1.2，下列术语和定义适用手本文件。3.2缩略语下列缩略语适用于本件。BOB T烧氧化菌(btane-oxidizingbacteria)MOB 甲皖氧化菌(ethane-oxidizingbacteria)4 仪器和设备仪器和设备包括:a)麻花钻、洛阳铲或铁锹gb)电子天平:感量为O.Olg;c)pH计:精度为0.1级1d)菌落计数器:分辨率不小于0.08mm;e)移液器:10mL、5mL、200f.lL;SY/T 7471-2020 f)生化培养箱:精度为lCg)无菌工作台:洁净度100级gh)紫外灯:功率不大于40W;i)电热干燥箱:不小于250Cj)冷藏箱:OC 4C 的高压蒸汽灭菌锅:工作压力不大于0.35MPa，工作温度不大于142C1)涡旋振荡器:振荡速度。r/min 3000r/min。5 材料和试剂材料和试剂包括:a)烧杯;b)锥形瓶pc)无菌培养皿;d)无菌采样袋:100mL、200mL;e)玻璃珠:直径为5mm;f)氧化饷:分析纯:g)琼脂:生物纯;h)盐酸:分析纯;i)氢氧化饷:分析纯;j)甲皖:纯度大于99%;k)丁皖:纯度大于99%;1)硝酸铀:分析纯;m)磷酸二氢悍:分析纯zn)磷酸氢二号甲:分析纯p0)硫酸镜:分析纯;p)氧化钙:分析纯;q)乙二版四乙酸:分析纯;r)氯化镜:分析纯;s)硫酸锻:分析纯:t)磷酸二氢铀:分析纯pu)硝酸毛甲:分析纯。6 样晶采集6.1 选址与定点按照GB/T31456-2015执行。6.2 样品采集6.2.1 样品采集量不少于200g。采集样品时应去除瓦砾、碎石、草根等杂质。6.2.2 采样深度包括:a)平原区域采样深度30cm 60cm;2 SY/T 7471-2020 b)沙漠区域采样深度50cm-100cm;c)山地区域采样深度30cm-50cm;d)海底区域采样深度30cm-100cmo 6.3 包装与保存6.3.1 在采样现场用无菌采样袋包装。6.3.2 无菌采样袋应外贴占佳绳号标签。6.3.3 样品放人包装袋后Et置于4G-r:全藏箱保存。6.3.4 样品应在一个月之南完成检测，马宜长期保存。7 样品制备7.1 清洗灭菌7.1.1 酒精棉擦拭后的工作台，用莘夕阳照射不少于30min。7.1.2 将清洗并烘干后的锥形瓶f烧杯和破璃三角涂布棒用锡锚纸包装，屉于电热干燥箱中160C干二，俨-热灭菌2h-4h。旧f多液器吸头置于高牛蒸汽灭菌锅12lJP灭菌20min。7.1.4 将清洗并烘干的玻啼珠装人烧费:12重于高压蒸汽灭菌锅121C灭菌20min。7.1.5 将7.1.3、7.1.4灭菌厉的器柑11又出后置于干燥箱中4YC-60C烘干，备用。l 7.2 琼脂培养基制备fllF飞7.2.1 称取培养基各组分巨见附录A)，将各组分加入锥形瓶，用NaOH搭液或HCl溶液调节pH值为7.0-7.2，再加入20g琼脂，补充水至枉，搅拌均匀封口。I7.2.2 配置好的培养基置于高压蒸汽灭菌锅中iI21.C条件下灭菌2伽lin，然后降温到50.C-5YC，置l-l 11;1 I r-1 I I,.于无菌工作台上，摇匀倒水培养皿。7.2.3 制备好的琼脂培养?冷却后，7.3 土壤或沉积物稀释液制备士壤或沉积物含水率(%)=(由士重干士重)x 1001温士重)11(.7.3.5 称取同一土壤或沉积物样品5g放人100mL锥形瓶中，用移液器加人45mL无菌生理盐水。向锥形瓶中加入7-8颗玻璃珠，用涡旋振荡器振荡使块状沉淀全部分散，制成稀释度为10-1的土壤或沉积物悬液。7.3.6 吸取lmL土壤或沉积物悬液至9mL无菌盐水中，依次按10倍法稀释，稀释次数不少于6次;每递增一个稀释度，挨一个新的吸头。7.3.7 每次移液前，对上一级稀释度的土壤或沉积物悬液振蔼汩匀6s-8s，在稀释过程中反复吸人3 SY/T 7471-2020 吹出悬j夜3-5次。8 菌落检测8.1 样品接种8.1.1 在工作台上进行，涂布棒在每次使用之前应用酒精棉擦拭并用酒精灯灼烧，冷却后使用。8.1.2 制备后的土壤或沉积物稀释液进行培养皿接种，每个稀释度样品接种两个培养皿。8.1.3 用移液器吸取100L相应稀释度的土壤或沉积物稀释液，注到培养皿中琼脂培养基上，用涂布棒涂匀。8.1.4 取另一组培养皿不接种土壤或沉积物稀释液，接种无菌生理盐水，作为空白对照。8.1.5 对培养皿进行编号，记录样号、接种浓度、培养菌种。8.2 茵落培养8.2.1 涂布接种完成后，将培养皿水平静置30min，之后将其倒置于充有甲院或丁烧气体的密闭培养箱中，30C恒温培养5d-7d，直至菌落数量稳定。8.2.2 MOB培养箱中甲皖浓度保持在10%左右，BOB培养箱中丁惋浓度保持在10%左右。8.3 菌落计数8.3.1 菌落培养结束后，统计每个培养皿上的菌落数。如果不能立即计数，应将培养皿存放于4C冷藏箱，且不应超过24ho8.3.2 进行培养皿菌落计数时，直接采用菌落计数器进行计数。对所有稀释度样品进行计数，选择菌落数在30 300个的稀释度样品进行菌落计算。8.3.3 在记下各培养皿的菌落数后，求出该稀释度下的培养皿平均菌落数。8.3.4 菌落数量按公式(2)、公式(3)计算:每克干士中甲:皖氧化菌数量=(甲皖氧化菌落平均数稀释倍数)/干土所占百分比(2)每克干士中了皖氧化菌数量=(丁皖氧化菌落平均数稀释倍数)/干士所占百分比(3)9 质量要求若空白培养皿出现菌蓓，则表明实验过程中有污染，本次实验无效。4 A.l MOB培养基组成lL MOB培养基组分a)硝酸铀(NaN03)!.8g;b)氧化按(NH4CI)吨3g;c)磷酸二氢怦(KH2P);t)0.35g;附录A(规范性附录)培养基组分d)磷酸氢二押(K2HP04.3町QJ，0.78g;e)硫酸镜(MgS04.7H20)3.5g;f)氧化钙(CaCI2.2H20)O.lg;g)乙二阳乙酸(E302g。A.2 BOB 培养基组成lL BOB培养基组分4:a)硫酸镜(MgmJH2创，.Y.25g;b)氯化按(NH4CI)2f!35g;c)硫酸按(NH4)2SQ，r1吨:8g;d)磷酸二氢铀(NaHFOAm)5.oe)磷酸氢二饵(f)氧化钙(CaC12g)硝酸押(KN03)1 SY/T 7471-2020 d 笃笃-E守卜电医中华人民共和国石油天然气行业标准近地表油气指示微生物检测方法SYfT 7471-2020 石油工业出版杜出版(北京安定门外安华里二区一号楼)北京巾石油彩色印刷有限责任公司排版印刷新华书店北京发行所发行880 x 1230毫米16开本0.75印张17千字印1-4002021年1月北京第1版2021年1月北京第1欠印刷书号:155021 8205 定价:20.00元版权专有不得翻印