SN∕T 3289-2012 苹果果腐病菌检疫鉴定方法(出入境检验检疫).pdf

书书书?中华人民共和国出入境检验检疫行业标准?苹果果腐病菌检疫鉴定方法?发布?实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前?言?本标准按照?给出的规则起草?本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口?本标准起草单位?中华人民共和国广东出入境检验检疫局?中华人民共和国嘉兴出入境检验检疫局?中华人民共和国深圳出入境检验检疫局?中华人民共和国烟台出入境检验检疫局?本标准主要起草人?王卫芳?胡佳?张建成?程颖慧?栾晶?苹果果腐病菌检疫鉴定方法?范围本标准规定了苹果果腐病菌?的检疫鉴定方法?本标准适用于相关寄主苗木和新鲜果实的苹果果腐病菌的检疫鉴定?规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的?凡是注日期的引用文件?仅注日期的版本适用于本文件?凡是不注日期的引用文件?其最新版本?包括所有的修改单?适用于本文件?培养基制备指南?第?部分?实验室培养基制备质量保证通则?进出境苹果检疫规程?术语和定义下列术语和定义适用于本文件?子实体?无性繁殖或有性繁殖?结构简单的或复杂的真菌产孢结构?统称为子实体?子座?由真菌组织形成的?可产生孢子等繁殖器官的垫状或头状组织?子囊壳?子囊菌亚门真菌形成的一种产生子囊孢子?包被有固定的孔口的子实体?子囊果?分生孢子器?半知菌球壳孢目真菌形成的一种子实体?与子囊菌的子囊壳相似?球形或瓶形?但产生分生孢子?型?型分生孢子?拟茎点霉属?分生孢子器中产生的两种类型分生孢子?型分生孢子为卵圆形至纺锤形?能萌发?型分生孢子为线型?不能萌发?分生孢子角?从成熟分生孢子器中涌出的大量分生孢子?呈黏稠状堆集?检疫鉴定原理苹果果腐病菌分类?分布及寄主参见附录?其既能在果园为害枝条枝干?又能为害采后果实?引?起贮运期果实腐烂?在田间?该病?月份开始发生?通常在小枝上尤其是树冠下部的小枝上开始发病?本标准以寄主上的症状特点?病菌形态学特征?培养特性?参见附录?和附录?作为苹果果腐病菌的主要检疫鉴定依据?致病性测定及病菌?序列分析结果作为苹果果腐病菌的辅助检疫鉴定依据?设备及用具?仪器设备体视显微镜?生物显微镜?电子天平?感量?高压灭菌器?超净工作台?生物培养箱?带黑光灯?高速离心机?仪?凝胶成像系统?实验用具标签?定性滤纸?样品袋?保鲜袋?手持放大镜?镊子?解剖刀?酒精灯?接种针?培养皿?烧杯?量筒?三角瓶?载玻片?盖玻片?微量移液器?可调式范围?试剂和培养基?试剂?溶液?无水乙醇?乙醇?无菌双蒸水?提取缓冲液?溶液?醋酸钠溶液?试剂?包括?聚合酶?苯酚?三氯甲烷?异戊醇?琼脂糖?相对分子质量标准?电泳缓冲液?培养基马铃薯葡萄糖琼脂培养基?参见附录?配制培养基时?按照?的要求?抽样口岸现场查验时?按照?进行抽样与取样?检疫鉴定方法?现场查验?苗木检验重点查验枝条和枝干?从树冠下部开始?逐渐向树冠上部观察?观察枝条表面是否有突起的坏死组织?枝干?主干上是否有凹陷的溃疡或者环割和坏死病斑?坏死组织剖面是否褐变?树皮坏死部位是否有树胶分泌?叶片是否变黄?萎蔫或部分萎蔫?果实检验仔细检查果实的果柄基部?萼部?果面是否腐烂?腐烂组织是否有汁液流出?病部是否有病菌的子实体?标注品名?数量?生产国及取样地点?取样人和取样日期等样品信息?将可疑苗木和果实样品带回实?验室作进一步检验?实验室检验?直接镜检如果病枝或病果有明显病征?直接进行显微镜检查?在体视显微镜下挑取病部子实体制成玻片?置于生物显微镜下镜检?观察记录分生孢子座?分生孢子器?分生孢子及子囊壳?子囊?子囊孢子的形态特征?进行显微计测?同时分离病原菌?保湿培养如病枝或病果上只有可疑病状而无明显病征?则将病枝?截成?或病果置于样品袋中?于?下保湿培养?每天观察症状的变化?并分离病原菌?分离培养直接挑取病部的子实体或孢子?或切取病健交界的数块组织?大小约?用?进行表面消毒?无菌水冲洗?次?置于?平板上?于?黑暗培养?然后转到?荧光条件下培养?观察记录菌落的培养性状和形态学特征?包括菌落的形态?颜色?大小及子实体?分生孢子的形态和大小?疑似菌株转到?平板上纯化三次?保存备用?致病性测定将纯分离物作为供试菌株?水晶富士苹果鲜果为供试材料?接种方法为伤口接种?供试菌株在?平板上?于?黑暗下培养?然后转到?荧光条件下培养?挑取菌落上的分生孢子角?用无菌水配制成孢子悬浮液?并将孢子终浓度调整为?用?乙醇涂抹供试苹果表面?进行表面消毒?用无菌刀片在果身切出宽?左右的浅伤痕?将?孢子悬浮液注入伤口内?无菌水做对照?将无菌湿润的滤纸盖在伤口处保湿?放入样品袋中?置于?下保湿培养?每个菌株接种苹果不少于?个?定期观察接种果实的发病情况?发病后按照前述?方法分离病菌?对病菌形态鉴定?分子生物学鉴定在形态学鉴定的基础上?辅助采用分子生物学鉴定?检测分析病菌基因组中的?基因序列?提取方法?引物序列?扩增及产物测序分析等见附录?鉴定特征?症状苗木症状及果实症状文字描述及图片参见?病菌培养性状病菌培养性状文字描述和图片参见?病菌形态特征无性态形态特征和有性态形态特征文字描述和图片参见?致病性测定病菌分离物得到柯赫法则验证?即以苹果果实为接种材料?采用分离物接种?后?苹果果实即出现褐腐?软化并流出褐色汁液等症状?参见附录?从病部得到的分离物培养特征?形态特征与供试接种菌株一致?序列扩增和分析经?琼脂糖凝胶电泳分析?扩增产物的片断大小大?序列测定后与?中已知的苹果果腐病菌标准菌株?序列?登录号?进行?比对分析?同源性为?结果判定以病害症状?病菌分离物的培养性状及形态学鉴定为主要判断特征?致病性测定和?序列分析作为辅助判定特征?符合下列任一种情况均可将病菌判定为苹果果腐病菌?如果病部有明显的病状和病征?其症状特点与病菌形态学特征与鉴定特征?吻合?扩增得到的?序列与?相符?如果病部有病状但无病征?经保湿培养和?或?分离培养所产生病菌的培养性状?形态学特征与鉴定特征?吻合?致病性测定结果符合?扩增得到的?基因与?相符?样品和资料的保存?菌种和?样品的保藏苹果果腐病菌纯分离物要标注菌株来源?寄主?分离时间?鉴定人?菌株在含?甘油的冻存管中于?保存?或将菌株转接在?斜面上培养?待菌丝体长满斜面后?置于?下保存?并定期?转管?病菌基因组?样品于?下保存?检验资料的保存妥善保存检验资料?以备复验?谈判和仲裁?检验报告应注明检验日期?方法?结果等?并有检验人签名?检验图片包括症状?病菌?电泳等?附?录?资料性附录?苹果果腐病菌的分类?分布和寄主?苹果果腐病菌的分类地位英文名?有性型?属于真菌界?子囊菌亚门?粪壳菌纲?间座壳目?间座壳科?间座壳属?无性型?异名?属于真菌界?半知菌亚门?球壳孢目?球壳孢科?拟茎点霉属?苹果果腐病英文名?分布范围亚洲?日本?韩国?欧洲?保加利亚?塞浦路斯?英国?希腊?大洋洲?新西兰?美洲?加拿大?美国?巴西?寄主范围可侵染?个科?个属的植物植株及果实?猕猴桃科?猕猴桃属?柿科?柿属?蔷薇科?榅 桲 属?苹 果 属?李 属?梨 属?葡萄科?葡萄属?附?录?资料性附录?苹果果腐病症状?病菌培养性状与形态特征?症状?苗木?枝条?枝干?症状一年生的枝条最感病?小枝形成层变色区域的树皮表面出现突起的坏死组织?很少或没有树胶分泌?剖面褐变?褐变范围有几厘米?可至坏死组织以外?以突起的死组织为中心向四周迅速扩展?产生狭长?凹陷的溃疡病斑?严重时引起小枝环割?导致枝条上部叶片黄化?生长不良?有时大枝甚至主干也受侵染?树皮病斑下陷?黑色?开裂?边缘不平整?最终形成粗皮?后期树皮病部形成黑色颗粒状分生孢子器及黑色子囊壳?子囊壳的长喙突破病部皮层而外露呈毛发状?潮湿时溢出奶油色的分生孢子角?果实症状侵染初期果实较硬?发病果实病部较软?果皮褐色?在果柄凹处常见多汁的渗出物?白色菌丝体和黑色颗粒状分生孢子器?剖开病果?可见果肉组织呈水浸状?软腐?颜色为浅褐色?发病后期?病果颜色呈黑褐色?病果剖面可见灰白色菌丝体?病菌培养性状分离物菌落在?黑暗下?平板上的平均生长速率为?菌落白色?菌丝致密?从平板背面观察?菌落背面无色?后?菌落上形成黑色?圆形的子座?转至?荧光条件下培养?左右产生淡橘红色的分生孢子角?在以上培养条件下?病菌只产生无性态?而不产生有性态?病菌形态特征?无性态形态特征子座黑色?圆形?直径?最大可达?分生孢子器埋生在子座内?褐色至暗褐色?球形?烧瓶形或扁球状?分生孢子器产生两种类型的分生孢子?型分生孢子长卵圆形?五色?单胞?含多个油球?型分生孢子丝状?无色?单胞?无油球?一端弯曲?型?型分生孢子的大小分别为?描述?菌株在?荧光条件下培养?有性态形态特征子囊壳黑色?球形?埋生在子座中?具长而突出的喙?子囊无柄?长棍棒状?壁薄易消溶?内含?个子囊孢子?排列成斜两列?子囊孢子椭圆形?无色?双细胞?分隔处稍缢缩?描述的子囊?子囊孢子大小分别为?在?培养条件下?病菌不产生子囊壳?附?录?资料性附录?苹果果腐病症状?病原培养性状及形态特征图说明?初期的褐变病枝及病枝剖面?引自?后期的坏死?凹陷?溃疡病枝?引自?病果剖面初期呈现褐色腐烂状?病果剖面后期呈现黑褐色腐烂状?病果剖面后期可见灰白色菌丝体?引自?经伤口接种导致苹果褐腐?左?对照果?右?发病果?接种菌株?图?苹果果腐病菌的症状图?说明?菌落?菌落上形成分生孢子座和分生孢子角?型长卵圆形分生孢子?型丝状分生孢子?子囊壳?子囊?子囊孢子?病枝上形成的子囊壳及其溢出的子囊孢子?注?引自?菌株在?荧光条件下培养?引自?引自?图?苹果果腐病菌的培养性状和形态特征图?附?录?资料性附录?马铃薯葡萄糖琼脂培养基?的配制?每升培养基中马铃薯?葡萄糖?琼脂的含量马铃薯?葡萄糖?琼脂?制方法称取洗净去皮的马铃薯?切成小块?加水煮沸?用四层纱布过滤?滤液加入葡萄糖?琼脂?继续加热搅拌混匀?稍冷却后定容至?分装三角瓶?加塞?包扎?高压灭菌?附?录?规范性附录?序列测定?提取?提取法病菌在?黑暗条件下培养?从其菌落边缘挑取新鲜菌丝?或直接刮取病部的菌丝体及?或子实体?加入?提取液?溶液?充分研磨?水浴?加入?酚三氯甲烷液?酚?三氯甲烷?异戊醇?大力振荡至均一状态?常温离心?取上清液后再加入等体积酚三氯甲烷液进行抽提?取上清液?加入十分之一体积?醋酸钠溶液和?倍体积无水乙醇?上下颠倒混匀?室温静置?离心?弃上清液?沿离心管壁加入?乙醇溶液?上下颠倒数次?离心?弃上清液?加入?缓冲液溶解?沉淀?置于?备用?也可用商品化的适合真菌基因组?提取试剂盒提取菌丝?引物?扩增及?产物检测分析?反应总体积?缓冲液?含?上下游引物?各?聚合酶?模板?反应程序?预变性?变性?退火?延伸?个循环?最后?延伸?产物在?电泳缓冲液中?琼脂糖凝胶电泳及凝胶成像分析?产物纯化后测序?比对分析?参?考?文?献?书书书?中华人民共和国出入境检验检疫行?业?标?准苹果果腐病菌检疫鉴定方法?中 国 标 准 出 版 社 出 版北京市朝阳区和平里西街甲?号?北京市西城区三里河北街?号?总编室?网址?中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷?开本?印张?字数?千字?年?月第一版?年?月第一次印刷印数?书号?定价?元