SN∕T 3687-2013 桃X病植原体检疫鉴定方法(出入境检验检疫).pdf
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3687-2013 桃X病植原体检疫鉴定方法Deecion and identification of peach X phyoplasma 2013-08-30发布2014-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局SN/T 3687-2013 目。昌本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本书Jll起草单位:中华人民共和作|湖北:1入境检验检疫局、华中农业大学、中华人民共和|王|辽宁:1人境检验检疫局O本标准主要起草人:冯汉利、王利平、王振华、洪霓、李金甫、赵晖、曾宪东、王有福。SN/T 3687-2013 桃X病植原体检疫鉴定方法1 范围本标准规定了植物检疫中桃X病CPeach X disease)的现场检疫和分子生物学鉴定方法O本标准适用于进出境桃、油桃、樱桃、李树等种苗中桃X病植原体的检疫鉴定。2 桃X病植原体基本信息英文名:Peach X phytoplasma 分类地位:细菌界CBacteria)，软壁菌门CTenericutes)，柔膜菌纲CMollicutes)C又称软球菌纲)，非固醇南原休日(Acholeplasmatales)，非固醇菌原体科(Acholeplasmataceae)，植原本属(问tcJlrna),16Sr III植原体组O该植原体的地理分布、寄主范围和症状、传播途径及基因组特征等参见附录A。3 方法原理DAPI染色后的形态学观察为初步筛查方法;以植原体核糖体16SrDNA通用引物进行PCR扩增、测序及限制性内切酶指纹图谱为主要的判定依据。4 主要仪器设备和用具4.1 仪器设备PCR仪、荧光显微镜、超净工作台、切片机、电泳仪、凝胶成象分析仪、冷冻离心机、电子天平(1/10 000 g)、超低温冰箱、常规冰箱、灭菌锅、pH计、水浴锅、振荡器等。4.2 用具可调移液器(0L 20 f-LL,20 f-LL 200L、200L1 000 f-LL)、吸头、研钵、离心管(1.5mL、10 mL)、PCR管(0.2mL)、量筒、烧杯、慑子等O5 主要试剂5.1 CTAB缓冲液CTAB Tris-HCl EDTA 氧化讷CNaCl)PVP 40 2%100 mmol/L(pH 8.0)20 mmol/LCpH 8.0)l.4 mol/L 1%SN/T 3687-2013 5.2 其他试剂DAPI染色液、液氮、MgC12，dNTP、TqDNA聚合酶、寻|物等O6 检疫鉴定方法6.1 症状检查观察桃、樱桃、油桃等种苗、果实、叶片等.症状描述参见附录A。6.2 样品的采集及制备取有疑似症状的植物的不同部位叶、枝等植物部分进行实验室检测鉴定。6.3 DAPI染色选取幼嫩组织(叶脉、侧芽)，将叶柄和叶脉固定于5%戊二醒缓冲液中，4oc保存备用Q制作切片，切片经0.1mol/L，磷酸缓冲液(pH7.0)冲洗3次;用1g/mLDAPI溶液染色10min 15 min，在460口m激发条件，荧光显微镜观察，在韧皮部筛管部位有明显的蓝色荧光信号表明有植原体存在。6.4 植原体形态观察对采集的植物样品制备超薄切片，通过透射电镜观察中直原体形态方法(见附录B)。6.5 植原体通用引物的Nested-PCR扩增、凝胶电泳及序列测定16Sr DNA的扩增使用果式PCR，第一次PCR扩I曾使用通J+FjI物为P1/P7，第二次PCR扩fti1采用通用引物R16F2n/R2;基于引物R16F2n/R2扩增的16SrDNA基因的PCR产物凝胶电泳并经测序。具体操作见附录C。6.6 通用引物扩增产物的RFLP指纹图谱检测在6.5检测中，若经通用引物R16F2n/R16R2扩增所得到的序列通过软件进行RFLP图谱分析，具体操作见附录D。7 结果判定7.1 症状表现与A.3描述一致且DAPI染色观察结果显示蓝色荧光，可初步判定为植原体，但需通过6.5、6.6的方案进一步检测。7.2 在6.4检测中，电镜超薄切片在韧皮部筛管细胞中存在大量植原体，可初步判定该植物样品携带植原体，需要通过6.5、6.6的方案进一步检测O7.3 在6.5检测中，若通过通用P1/P7及R16日n/R2两对引物进行巢式PCR扩增，第二次扩增产物经凝胶电泳检测结果为阳性，且R16F2n/R2扩增产物测序结果经比对，与C.4序列一致，则可判定该样品携带桃X州植!原体。7.4 在6.6检测中，通用引物R16F2日/R2扩增产物的RFLP分析片段大小与桃X植原体标准国语(见图D.l)相符，可判定该样品携带桃X病植原体。2 SN/T 3687-2013 8 样品保存8.1 样品保存与处理样品经登记和经于人签字后妥善保存。对检出桃X病植原体的样品应保存于-200C冰箱中，以备复核oi亥类样品保存期满后须经高压灭菌后方可处理O8.2 结果记录与资料保存J整的实验i己录包括样品的来源、种类、时间，实验的时|町、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。PCR疑胶电泳检测需有电泳结果照片。3 SN/T 3687-2013 附录A(资料性附录)桃X病植原体其他相关信息A.1 地理分布北美洲:加拿大(格雷特湖地区)、美国(1931年在加利福尼亚首次发现，现除了南卡罗来纳州、乔治亚州、阿肯色州和德克萨斯州外，几乎传遍整个美国)，中国尚无报道。A.2 寄主范围桃树X病植原体可侵染大多数核果类果树，主要奇主植物包括李属植物如桃树(peach)、油桃(nectarine)、甜樱桃(sweetcherry)、李子(plur川、扁桃(almondtree)、杳(apricottree)，及荷兰鸭儿芹(Cryttaenia ja如icaHassk)。最近研究还表明许多果园中的杂草也可能是其寄主o经人工接种能感染芹菜。A.3 表现症状发病桃树最初的症状是形成黄色的病斑和卷叶，叶片黄化或红化，不规则水浸状斑点，通常沿着中脉向上卷曲。褪绿部分变干，变脆，坏死组织脱落，叶片破碎，穿孔，然后脱落，仅留一簇叶片在枝条的顶端(见图A.1和图A.2)。不久以后，整个植株出现褪绿，叶片脱落，只在枝条的顶部留下一些簇状叶片，幼树在发病后13年死亡，较成年的植株表现为慢性病症状。樱桃发病，果实上产生了小斑点而且不能成熟。X病植原体在美洲稠李上的典型症状在整个灌木上出现。叶片提前成熟，从亮黄到变红，在5月下旬或6月上旬脱落，植株节间大部分变短，稠李病株在表现症状后一般13年内死亡。图A.1油桃表现桃X病害症状图A.2桃上表现桃X病害症状4 SN/T 3687-2013 A.4 传播途径在自然条件下，桃X病主要是由叶蝉介体传播和扩散，尤其是桃叶蝉CoLLadnusge1nznat川，且户hytliusacutus，深山叶蝉Colldnusmntanus和Pr户hlsz川zrrratuso在一定程度上，Fieberiella卢。而和Gr户hoce户hal(旷Zue川叶蝉也能传播。远距离以无症带茵茵木传播为主。A.5 基因组特征西方x-病植原体染色质DNA的246046bp序列，这段序列包括20个基因，其中19个基因己获得全长序列(l止ftingand Kirkpatrick，2003)。d SN/T 3687-2013 B.1 试剂试材B.1.1 饿酸固定液a)巴比妥乙酸饷缓冲液巴比妥饷2.89 g 乙酸的1.15 g 加双蒸水至100mL。b)2%娥酸水溶液c)1%饿酸固定液:巳比支乙酸讷缓冲液2%饿酸水溶液附录B(规范性附录)电子显微镜观察5.0 mL 12.5 mL 0.mol/L盐酸5.0 mL 力日双蒸水至25.0mLo 1昆合后用0.1mol/L盐酸调至pH为7.2，即为1%俄酸固定液，4oC保存备用。B.1.2 戊二醒固定液一般为25%戊二醒水溶液。可配制在除巳比妥以外任何缓冲液中使用，终浓度为25%0 B.1.3 环氧树脂Epon 812)1民I烯二酸西干(DDSA)邻苯二甲酸二I醋(D.B.P)5.0 mL 20.0 g 1.75 mL 二乙基苯胶CD.M.P-30)0.4 mL 将Epon812倒入烧杯中，置80oC温箱融化备用o按上述比例，顺序加入DDSA，充分搅拌，待融化呈透明，.-T:丰泪.再加入邻苯二甲酸二I四行，仔细搅拌，然后慢慢逐;而川人二乙某苯眩，边加边搅拌，-T:包埋齐IJ呈红棕色。B.1.4 Formvar膜将聚乙烯醇缩甲醒溶于三氯甲!院，配成0.2%3%溶液，存于冰箱备用。制膜时取一块干净玻璃片插入溶液中，取出倾斜待三氯甲炕挥发，用慑子沿玻璃边划痕，将玻璃倾斜人蒸饵水中，薄膜即从玻璃片上脱落下来漂浮于水面，取干净的铜网摆上，压紧，再用一块滤纸覆盖其上，捞起后置于培养皿干燥备用。B.2 实验步骤B.2.1 取材选取呈现早期症状的桃X病植原体叶子，用刀片切成整齐的细条，大小为3mm20取健康桃叶做6 SN/T 3687-2013 对照。B.2.2 固定采用戊二醒饿酸双固定法G样品在25%戊二自主进行前固定2h后，PBS(0.2mol/L pH 7.4)清洗三次，然后用1%饿酸后固定2h，PBS清洁三次。B.2.3 脱水采用乙醇和系列梯度脱水。30%乙醇/15min50%乙醇/15min70%乙醇/15min80%丙醇/15 min90%丙酣/15min100%丙酣/15mi口。样品可在70%乙醇中停留过夜。B.2.4 渗透脱水后的组织块在丙酬/树脂中渗透3d，再在全树脂中渗透1do B.2.5 包埋用环氧树脂做包埋剂O将组织块放在胶囊中央，滴入包埋剂O于37oC下24h,60 oC下24ho B.2.6 切片在超薄切片机上将固定的组织块作切片O选择好的切片，将切片用二甲苯蒸发展开，用载有Formvar膜的铜网捞起，置培养皿内干燥、保存OB.2.7 切片染色采用乙酸双氧铀和拧撮酸铅双染色。取染色蜡盘数个，将乙酸铀染液滴人蜡盘上O取带切片的铜网，插入染色滴中，染20min30 min，然后取出铜网，蒸榴水洗去多余染色液滤纸吸干O将铜网再放入另一蜡盘，滴人拧棱酸铅染液，使铜网翻扣在染色液上，染20min30 min，再用0.1mol/L氢氧化的漂洗干净，滤纸吸干。B.2.8 显微镜观察透射电子显微镜观察植原体形态，如图B.1，引自(Guo.Y.H.Walla.J.A等1996)。7 SN/T 3687-2013 说明:A 韧皮部少量植原体;B 切J皮部大量植原体聚集;cw 细胞壁;M 植原体放大倍数:A，24，OOO;B，6，500X图B.1感染植原体病的美洲稠李叶柄交叉部电镜图8 SN/T 3687-2013 附录C(规范性附录)通用引物Nested-PCR扩增及测序C.1 DNA提取取大约0.2g叶组织(叶柄、叶脉、韧皮部)，加入液氮在无菌研钵中进行充分研磨，将粗汁液转移至2 mL离心管，4O(下4500 r/min离心5min。将悬浮液转至新的2mL离心管中。4O(下13 000 r/min离心15min，去掉上清液。加入1mL CTAB提取缓冲液;将离心管置于65O(水浴中温浴1h1.5 h，每隔20min左右将离心管颠倒混匀;2000 r/mi口，4O(离心2min;将离心后的上清转移至一个新的离心管中，加人氯仿/异戊醇(24/1)1mL，由匀，形成乳浊液;将乳浊液在13000 r/min,4 O(离心5min;上清转入新管，加人800，uL预冷的异丙醇，13000 r/min,4 oc离心10min;弃上清，加人500，uL的70%的乙醇，在13000 r/min,4 oc离心5mi川弃掉上洁，干燥沉淀，加入100，uL的灭菌蒸榴水溶解。其他的DNA提取方法也可以借鉴，也可以选择使用商业DNA提取民剂盒，提取的DNA在-800C的条件下可以冻存1年。C.2 引物序列号|物采用植原体16SrDNA通用寻|物P1jP7和R16F2n/R16R2，寻|物序列见表C.L表C.1PCR检测的引物引物名称引物序列S产物!bp通用引物Pl AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGA 1 800左右P7 CGTCCTTCATCGGCTCTT R16F2n GAAACGACTGCTAAGACTGG 1 200左右R16R2 TGAC丁GGGCGGTGTGTACAAACCCCGC.3 巢式PCR反应体系及参数C.3.1 16Sr DNA巢式PCR(Nested-PCR)扩增反应体系见表C.2o表C.2PCR反应体系试剂名称终浓度加样量ILl 10XPCR反而缓冲浪lX 岛fgC!，2.5 mmol/L 9 SN/T 3687-2013 表C.2(续)试剂名称终浓度加样量liL dNTPs 0.2 mmol/L jf向引物0.4 mol/L 反向引物。.!Jmol/L Taq D)Ji聚合酣2.5 U DNA模板20 ng 1,ug 补ddHzO至50,uL 取P1/P7引物的一扩PCR产物1L稀释50倍为寻|物R16F2n/R16R2的Nested-PCR二扩模板，反应体系同第一次PCR。C.3.2 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置阴性对照:kJ健康的桃叶脉或枝条韧皮部提取的总DNA为模板;阳性对照:以携带有桃X病植原体16SrDNA序列的阳性克隆质粒为模板;PCR反应的空白对照:以水代替DNA模板OC.3.3 PCR的反!但参数P1/P7:94 oC/2 min;94 oC/30 s,52 oC/75 s,72 oC/95 s，35个循环，72oC/7 mino R16F2n/R2:94 oC/2 m i n;94 oC/45 s,55 oC/60 s,72 oC/90 s,35个循环，72oC/7 min。C.3.4 琼脂糖凝胶电泳制备1%的王山脂粉J凝胶，以DNAMarker 作为分flP:标记-进行也泳分析，山泳结束后在凝胶成像仪观察并记录结果OC.4 扩增产物测序将引物R16F2n/R2扩增产物序列连接克隆载体pMD18-T，并送测序公司测序，序列号(六日BankAcc.No.JN882012)序列结果如下:1 GAAACAGTTGCTAAGACTGGATAGGAAAAGTAAAGGCATCTTTACTTTTT 51 TAAAAGATCT TCTTTGAAGG TATGCTTAAG GAGGGGCTTG CGACACATTA 101 GTTAGTTGGT AGGGTAAAGG CCT ACCAAGA CT ATGA TGTG T AGCTGGACT 151 GAGAGGTTGA ACAGCCACAT TGGGACTGAG ACACGGCCCA AACTCCTACG 201 GGAGGCAGCA GTAGGGAA TT TTCGGCAA TG GAGGAAACTC TGACCGAGCA 251 ACGCCGCGTG AACGATGAAG TACCTCGGTA TGTAAAGTTC TTTTATTAAG 301 GAAGAAAAAA GAGTGGAAAA ACTCCCTTGA CGGTACTTAA TGAAT AAGCC 351 CCGGCTAATT ATGTGCCAGC AGCCGCGGTA ATACATAAGG GGCGAGCGTT 401 ATCCGGAATT ATTGGGCGTA AAGGGTGCGT AGGCGGTTTA ATAAGTCTAT 451 AGTTTAATTT CAGTGCTTAA CGCTGTTGTG CTATAGAAAC TGTTTTACTA 501 GAGTGAGATA GAGGCAAGCG GAATTCCATG TGTAGCGGTA AAATGCGT AA 551 ATATATGGAG GAACACCAGA GGCGTAGGCG GCTTGCTGGG TCTTTACTGA 601 CGCTGAGGCA CGAAAGCGTG GGGAGCAAAC AGGA TT AGA T ACCCTGGT AG nu l SN/T 3687-2013 651 TCCACGCCGT AAACGATGAG TACTAAGTGT CGGGTAAAAC TGGTACTGAA 701 GTTAACACAT TAAGTACTCC GCCTGAGTAG TACGTACGCA AGTATGAAAC 751 TTAAAGGAAT TGACGGGACT CCGCACAAGC GGTGGATCAT GTTGTTTAAT 801 TCGAAGA T AC ACGAAAAACC TTACCAGGTC TTGACA TTTT CTTGCGAAGT 851 TATAGAAATA TAATGGAGGT CATCAGGAAA ACAGGTGGTG CATGGTTGTC 901 GTCAGCTCGT GTCGTGAGA T GTTAGGTTAA GTCCT AAAAC GAGCGCAACC 951 CTTGTCTTA GTTGCCAGCA TGTAATGATG GGGACTTTAA CAGACTGCC 1001 AATGAAAAA T TGGAGGAAGG TGGGGA TT AC GTCAAATCAT CATGCCCCTT 1051 ATGATCTGGG CTACAAACGT GATACAATGG TTGATACAAA GAGTAGCTGA 1101 AACGCGAGTT CTT AGCCAAT CTCAAAAAAT CAATCTCAGT TCGGATTGAA 1151 GTCTGCAACT CGACTTCATG AAGTTGGAAT CGCTAGTAAT CGCGAATCAG 1201 CA TGTCGCGG TGAATACGTT CTCGGGGTTT GTACACACCG CCCGTCA C.5 结果判定通用寻|物P1/P7，THI扩增片段约为1.8kbp，寻|物R16F2n/R2，预计扩增片段约为1.2kbpo检测样品经通用引物R16日n/R2扩增出现对应目的片段，并且二扩产物经测序与C.4序列一致，则可判定该样品携带桃X病植原体。1 1 SN/T 3687-2013 附录D(规范性附录)RFLP指纹图i普分析D.1 引物序列R16F2n,5-GAA ACG ACT GCT AAG ACT GG-3 RJ6R2，5一TGACGG GCG GTG TGT ACA AAC CCC G-3 D.2 PCR反应体系同C.3.1oD.3 PCR反应参数同C.3.3oD.4 RFLP分析以R16F2n/R16R2引物扩增产物进行RFLPo经通用寻|物R16F2n/R16R2扩增所得到的序列通过软件进行RFLP图谱分析CWeiW e1 al.,2007)，选择17种限制性内切酶CAluL BamH L Bfa L Bst UI、Dra1,EcoR 1,Hae III、HhaL Hin门、HI、H户II、K户n1、MhI、MseLRsa LSs户I、T叫1)酶切后，对比罔D.1提供的桃X植原体16SrDNA的RFLP酶切图谱(Leeet al.，1998)进行结果分析判断。图D.1引起桃X病的植原体RFLP酶切图谱12 SN/T 3687-2013 D.5 结果判断通用引物R16F2n/R2扩增产物的RFLP分析片段大小与桃X植原体标准图谱相符，可判定该样品携带桃X病植原体。13 SN/T 3687-2013 参考文献1 J Yan Zhao,Wei引Tei，Ing-Ming Lee etc.Construction of an interactive online phytoplaSma classification tool,i PhyClassifier,and its application in analysi日ofthe peach X-disease phytoplasma group(16SrIII).Molecular Plant Pathology Laboratory,USDA-Agricultural Research Service,Beltsville,MD6 20705,U.S.A.2J B.N.Ohanvantali and F.Kappel.Peach X-disease in southwestern Ontario.Canadian Plant Disease Survey 58:3,1978.3J Guo,Y.日.，引Talla，J,A.,Cheng,Z.-M.,and L时，1.-M.X-disease confirmation and distribution in chokecherry in North Dakota.Plant Dis.1996,80:95-102.4J D.E.GUNDERSEN,1.-M.LEE,D.A.SCWF etc.Genomic Diversity and Differentitation among Phytoplasma Strains in 16Sr RNA Groups 1(Aster yellows and Related Phytoplasma)and III(X-Diease and Related Phytoplasmas).INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC BACTE-RIOLOGY Jan.1996,p.64-75.5J Ing-Mi吨L时，DawnE,Gundersen-Rindal,Robert E.Davis and Irena M.Bartoszyk Revised Classification Scheme of phytoplasmas based on RFLP analysis of 16Sr RNA and ribosomal protein gene sequences.1 nternational J ournal of Systematic Bacteriology.l 998,48:1153-1169.6J Liping Wang,Ni Hong,Marta Martini etc.Molecular characterization of two phytoplasma strains associated with X disease in peach in Canada.Phytopathogenic Mollicutes.2012,Vo1.2(1):9-14.7J Wei W,Davis RE,Lee I-M and Zhao Y.Computer simulated RFLP analysis of 16Sr RNA genes:identification of ten new phytoplasma groups.lnternational J ournal of Systematic and Evolution ary Microbiology.2007,57:1855-1867.14 2日-h的同军中华人民共和国出入境检验检疫行业标准桃X病植原体检疫鉴定方法SN/T 3687-2013 中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)总编室:(010)6427323争夺网址www.叩.c丑中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷兴印张1.25字数30千字2014年3月第一次印刷1/16 2014年3月第一版印数1一1600 开本880X 1230 7巳定价21.00争夺书号:155066 2-26617 SN/T 3687-2013
