NY∕T 3691-2020 粮油作物产品中黄曲霉鉴定技术规程(农业).pdf
ICS 65.020.01 04 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 3691-2020 粮油作物产品中黄曲霉鉴定技术规程Technical code of practice for identification of Aspergillus flavus in grain and oil crops 2020-08-26发 布2021-01-01实施Y一J在.斗、中华人民共和国农业农村部发布NY/1 3691-2020 忱二悔./目IJ11=1.)d铲入1%牛;标fU去W!GB/T 1.1一2009约H.N川ltlzqIF巴/嗖Y-./，Nit，u、牛;川|的某些内容nljG i!Ji.专利牛斗立刻1(I(Ktif.JI知他时也UUJlj这些仁和I(I议行。本4衍标1;【忖I州111件由h叫4农飞叫j业.:t农飞叫丰村才古部1节l坤俐非利种l叶咐斗:1:(川|4牛卒、豆:t析标I丑、刑呻叫州IJ赳l且革4毕，:1单(.川L叶位立中同农业科主午f品肮i汕料作4物却创d川f究j所沂、农业;农t村iii引邢1甘i协圳如挝汕11非料f/广且比飞，川!质贝4卅扎:去且必:斗令仓.1风只札L阶L七川、才l贝咋咐们刊价i飞l实4驹奇豆、(武汉)、农业农村，ilil l l料及制品质tt!i伴检驹测试1心。本，I;fI主要，斤人张1.1、!在l归队、IIJ李、Il巾11、喻到1、r-、夺培武。NY/1 3691-2020 粮油作物产品中黄曲霉鉴定技术规程范围本标l1i规定了粮叶11作物rjl!i.1l11:分Tf均养、形态早在i二及分子生物学鉴定7i法。本标fi适用l稻谷、小麦、玉米、花生 2 规范性引用文件n月l的版本适J11-1本文i1。3 32 33 3.4 35 36 3.7 38 39 3.10 G I:l 1789.I GB 4789.15 G1:l4789.16 GB/T 6682 G1319489 GI:l/丁-t 1I blll i n 以18.I)ichloran DNA.Deoxy门bonuclEMl卦，丁heeuropean Gcnhank.i!ili冈库。3.11 lTS.lntornal transcribcd spaccr,1);1 3.12 PCR:Polymcrase chain reaction，聚合同月链式反应。4 原理a),LtHilE 依据黄1111:;:;:(，AFPA和察C;J1i养基(l(jJli养性状，以1fI.I;r.i鉴定通HI引物、11111斗周W鉴定111物与!11l11特异但DNA序列的PCR检测钻!#作为鉴定放illllf的主要依据。5 实验室基本要求和生物安全实验室到、:lJ条L!及人员衍合GB4789.1和1G 13/1 27403 l!:求，实吩室生物安全1fI.预防fJ11施按照GI:19189的平I关规定执行。普示川市具有相J旺的做生物专业教育或Jfi训约历的技术人lJlill千i11111114:i的用养和l鉴定。松柏过和iiViJl交叉污染，所NY;T 3691-2020 11 J1ff:.物及Jil(，吕11I1.1，;:约121C呵11:火凶Ol1li川日.先mO.I%次低限俐ti!HW泡处JJH1 j.H-?I Q 6 仪器设备及试剂材料6.1 仪器设备除微生物实扮l;J.w.元茵及JM设备外.其他设备II下:生物安全相、liJi川、二R.W，l锅、恒71il!g.!:.i、烘箱、微型粉仰机、fT式冷冻肉心机、fT式小!9.，1:;、机、制冰+Jl、旋涡振荡然、恒rM水悄悄、水平报*、但li.lJ需床、常生m冰箱、赵低而ll冰箱、生物lnt做锐、PCR仪、核内在:tffII分析仪、凝Il止Il!.泳仪、凝!以h且侬系统、做1乱移1由(.匀。6.2 试剂与材料|徐约有规定外，所川试剂均为分析纯，实验室用水利合GB;T6682的机I.X:l!求。1)(;18)养Ji、综氏:f:ti养;J，t;及八FPAJ;养基配IIJ)i法!JI!.1.t法A;分子生物学早在-JiJiITI试剂及配制l方法儿附).l3手11i.t,l:Co 7 黄曲霉鉴定7.1 样品处理J丰收10g衍检们一1日，Jf/lJf体或微型粉邸机将微肢畔，IJII人含90ml.元li;)创l形瓶中，室温涡旋振荡或水平括:床l充分11.匀，IJII无f)47!志将阳市11JO O mL丰(:，日l占li:1l7:位。l吸取1mL附jl币的基础液IJII人含9时，兀部i;!fl(JTi:i心价I，t:ii!i!GB 4789.15，依次JO俏梯度稀释，分川得到1)1 X 10、1X 10-、1X 10-3、IX10-、1X I0 稀料!且(j(Jii:址液。7.2 黄曲霉分离与纯化校!自GB-1789.1 5，吸取每个稀释浓度的囱悬液1001 1.涂布Y1)(;18 lli4iJPI版上-rt于tlltH1养和，在280C、相对itJ且90%、煞l情条卡|下用养3d 5 d，何个稀释j丘处理!主主i3汰。挑取外观氏平1tl绿色抱子(J(J-i悴转战军;rfr(10f)C 18梢养ll饭L进行二次划线纯化州养，直至4叶剑ITIN4/品，如J忍耐I(Jtog J);1f物1N.川出l株)，J)养条例1，;)o 7.3 黄曲霉鉴定方法7.3.1 形态鉴定7.3.1.1 AFPA 培养鉴定将7.2rlj.J;凯11m株拔种于选择t)养基AFPA平扳1:.1，:养条例|可7.20将-1扳倒转J在养3d 5 d,;w.苦苦恼t知fI(fi颜!包，这l仅li落jf而旦仙桥色的出株，备用。7.3.12 察氏培养基培养鉴定根扭j:.G 13L1789.16，而Jl仅7.3.1.1 1元般也m在转核子你氏附养挫，1)1养5d7dJ污观察l组洛形态、颜色，fIj生物It.微镜然分生袍子及分U包子在E的形态忖仰和liil子的手11:;91)等.lMf条iIIIT)7.20 7.3.2 分子生物学鉴定7.3.2.1 DNA提取从7.:l.1.2土1;1111 1:币I)Jfj.i洲的株l4丝休，使用Th1Ji,U;WJ J&1刘组DN八illJI坦试开11企Jl按照其以作说明快速挝收DNA.或也1If11CTAB 1去创JIDNA具体步骤及试剂见IH;99%),.13 政11I1.f机异们扩梢产物为中1异性。N八条刊;):段大小与阳nX.J!自-f虫(-1I1Y1111:j元.Hil1条才g;:J J:见)。3 NY/T 3691-2020 A.1 DG18培养基A.1.1 成分自吕蛋白JI在无7)(11ii稍稍1卜1，10MgSO,H,()f瓦币iJff，:J)j(jJ旨A.1.2 制法A.2 A.2 1 成分NaNO K,HPO,ICI MgSO,.7 FcSO,.7 J，U;和ii到()J旨蒸仰i水A.2.2章。法:!r!:l仅600mL蒸111:水一J1II入水，JififliifJ司JJII入JJl()J旨，J1II7:!A.3 AFPA培养基A.3.1 成分:lli II!陈向于叮浸粉村棕酸铁饭年m:jJff，:;A!;素mOJ!;1 A.3.2串IJ法附录A(资料性附录)培养基和试剂10.0 g 20.0 g 0.5 g 0.002 g O.1 g 15.0 g。、FcSO，7H，O，依次逐,后，121C灭茵15mino 芷i仅600mL蒸俯水分另IJJJII人蛋II!J在、醉时应粉、朽核酸铁饭、钊币!i胶、每(吕京，依次i主-)JII入水中的fWf后Jm人陈1m，JJIJ热融化，补J1II茶馆i水定容至1000 mL.分装后，12JC灭菌15min。8.1 试剂及配制附录B(资料性附录)CriH法提取DNi8.1.1 液氮似rf甜f磨时的低站tvf、驼，保护核酸不受核股隅降IW(，。NY 11 3691-2020 8.1.2 Imol/L Tris HCI，厅J800 I时，超纯水浴血平12 1.1 g f-ffl i刽JiIj I炕(Tris),)JII衣就阪川，ipH,州至8.0，川)/():j二容至11.8.1.3 CTAB J.业l仅液成分0.1mol/L Tris-I-IC1(1】卜1=7.5)，10mol/L 1二l川、八(1汁1=7.5)，2%J六炕基芝IJl1iUSf化做(CTA),0.7 mol/l.NaCl,1%日章lLi乙;(o8.1.4 0.5 mol/L ED!A(pH=8.0)将186.j g二)/(乙二版四乙般二俐(EIH-Na22Hz O)J11人800 mI.7I1，搅拌济自峙，厅JNaOJ-l训WpH至8.0，寇将至11.。8.1.5 70%乙n;:hl取70时，元水乙畔，)J11灭l:r-i;JjtoJi7/(.i!容至100ml.，价川l。日2提取步骤8.2 1 币ilJJlit、l根上的待l!1J植树;的丝100mg干r体小，)J11液氮充分圳股，将粉末转移至2mL 7l心竹 1。8.2 2 迅速)J11入顶热的CTAB州I由800L.迅边;IL紧1r盖，充分振;.,:f 65C)/(m-倒130 min,Jj fuJ不断振伤。8.2,3 J 2 000 r/min离心15min，JIlLU斤，)J11入RNase附(终浓度10mg/U.:l7C似站;t30 min 日，JJII人飞f体职的盼-;d仙异戊醉(体81比为25 24 1),Jt匀，12000r/min T/.心15111ino8.2,4 吸收U，i液，再次力11人气H*fJUIiii)jAjJ异戊邸，混匀，12000r/min 肉心15rnin。8.2,5 Tl-Jlit U，i液，如l入等体积的井冈碎，充分棍匀.-20C冰箱rl:li(:ft)I:30 min以仁;J2000 r/min 7t.心10l11ill。8.26 弃l二七，il，在i沉淀.jJII 70%(I乙醉，4C13000 r/min 7i.心10min，去U，ili后倒jll于你纸上，1:以DNA，千快!污JJII入501.让;12l子水i价1的!DNA r d NY/1 3691-2020 C.1 试剂及自己制附录C(资料性附录)PCR检测方法C.1.1 5 X TBE 1泳级I巾被怀31-54 g Tris,27,5 g刷111章，20mL 0,5 Illol/L I二DTA(pl-I8，0)，侦用 浓度为O，5X T巳巳。C.1,2 6 X loa C.1 3 1%:琼E历琼剧;I讪(JI脂l阳旨附串租耕粉:M凝)胶k称收l 比gJJ琼:UI灿L叶呗啪品脂h归l吁拉刷，!f汗二吁于f二甘钳IJ形吕嗣肌11扣，,!J川H川11入l0OmLO，5XT、日EI也包泳缓p川冲l臼液u力加j川川11热浴仰厅。C.1.4 Gc仙Ircd染料:纣纺i合DNA发山橙包P荧i光，使旦干紫外外、灯灯-下1观见察。C.2 PCR扩增引物见表C.10 表C.1 PCR检测引物鉴)i二类型引物|才怀拈lklt的述l二F游引物j于主1片段小l(由届川ITSII门创核圳体内转录flIWi1灭5-TCCGTAGGTGA八CCTGCGG-:600 bp 引物鉴定(rDNA-ITSl 5-TC【:TCCGCTIATI吨GAl 八rGC-:lIlh;i:鉴Ji二BAII BA2 H微:剑臼W*I(llcnAJ5-CGTAACCAAATCGGTGCTGC1TrC 550 bp 5八CCl巳AGTGTAGTGACC(;II GGC-3通川号|物CFI/CF4 何加hti臼业问(CMl5-AGGCCGA YTCTYTG八CYGA-3700 bp 5-ITIYTGCATCATRAGYTGGAC3 11111得特异性FI.AI/I斗，A2YIlJ1在特异性门51于列5-GTAGGGTrCCTAGCGAGCC-:1 可l物鉴5-GGAAAAAGATrGA1TIGCGTC-3 500 bp C.3 PCR反应体系在PCRi巾1111人lOXPCR级ill液2，511.,MgCl,(25 mmol/L)J.5 L，dNTP(2，5 mmol/L)J 1-1.,上曲(f111物(20lllol/UO，51.，下iJfPJI物(20Imol/L)0,5 1-1.,(1(/iif(5U/1-1.)0,25 1-1.。反应总体系jJ25/L，1m人0，5L的DNA锁板之后，剩余体积用无TI水补齐。市根据不同PCR扩剧的试开IJ余的操作说明和J.l:J05、循环);72C10 min 3 CFI/CF4 9,IC 5 min;!)IC:30 s.5TC:30 s.72.C.10 s(35个循环);72C 10 min 4 FI.AI/I斗，A2)，IC 5 min;!)IC:W日.55C30 s.72.C 30 s(35个循环);72.C 10 min C.5 电泳配jj;IJ1%rl(H京脂粉凝胶(合Gelred)，月PCR扩增产物51.与6X loadin日bllrrer 11.Ill合均匀，1116 NY/1 3691-2020 I)NA Markcr作为分子tt标i己，然后分)IjJII入到J1.1.Il啊iI(J Jm样孔111，按j凶11:源选择fT适的1.1.Jk.lt行也泳，当!mf级 I液巾的拟盼jiE迁移剑1/2位忧，切断1.1.似.协11:1也泳。C.6疑胶成像观察与记录取Ll:U;(脐带jf凝胶)lJ.人在是IJ止JjJZ像系统1.lt行观察，:t1拟中7 ONON-ESH问Z.X 中|叫农业出版衬出版CJt京市JlVJ阳以左子店衔18号楼)比.,|呵:I:I1:;www.cc叩)北京印刷一厂印刷新华书店仁京发行所发行各地新华斗5J;lTf手辑lj(11邮政编刑100125x 印张0.75Y数15千?2020年12月It:rim1次印刷*2020年12川第版书号16109.8330 定价:只丑本880mmX1230mm 1/16 18.元版权专有侵权必究举报电话(010)59194261 NY/T 3691-2020
