NY∕T 3195-2018 热带作物种质资源抗病虫鉴定技术规程 橡胶树棒孢霉落叶病(农业).pdf

ICS 65.020 B 16 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 3195-2018 热带作物种质资源抗病虫鉴定技术规程橡胶树棒抱霉落叶病Technical code of practice for resistance identification to diseases and insects of tropical crops germpalsm-Corynespora leaf fall disease of rubber tree 2018-03-15发布2018-06-01实施中华人民共和国农业部发布日IJ1=1 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由农业部农垦局提出。本标准由农业部热带作物及制品标准化技术委员会归口。本标准起草单位中国热带农业科学院环境与植物保护研究所。NY/T 3195-2018 本标准主要起草人:黄贷修、刘先宝、李博勋、时涛、李超萍、蔡吉苗、陈奕鹏、杨扬。I NY!T 3195-2018 热带作物种质资源抗病虫鉴定技术规程橡胶树棒子包霉落叶病1 范围本标准规定了橡胶树He，剧brasiliensis(Willd.ex A.J uss.)Muell.Arg.棒子包霉落叶病抗病性评价的术语和定义、病原菌分离鉴定及接种体制备A革牵挂鉴定、抗病性评价、抗病性评价有效性判定和结下列文件对于件。凡是不注日3.1 4.1 病原菌分离鉴定的反从发病植株上选取有典配叶南i赖略离国a叶病病原菌，通过单抱分离法对分离物进行纯化，经致病性测-.画监通过形态学(血，-ITS系统发育学分析确定为多主棒抱菌，再用多主棒抱毒素的cas2亚型和同想JjlIJ确定菌株的毒素类型(参见附录B)，分别选择cas2亚型和cas5亚型的强致病力菌株用灭菌的超纯水保存备用。4 2 病原菌菌饼接种体制备将保存的cas2亚型和cas5亚型多主棒抱病菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上(平板直径9 cm),(28:1:1).C恒温培养7d，用打孔器取菌落外缘的菌饼(直径5.0mm)作为接种体，对照则取同样大小的空白PDA培养基。4.3 多主棒抱粗毒素提取液制备4.3.1 改良培养基改良Fries3号培养基:煎糖20.0g，酒石酸馁5.0g,KH2PO,1.0 g,NH,N03 1.0 g,MgSO,NY/T 3195-2018 7H20 O.5 g,NaCl O.1 g,CaC12 2H20 0.13 g，酵母膏1.0 g，蒸馈水1000mL。4.3.2 粗毒素摄取液制备从培养7d的cas2亚型和cas5亚型多主棒子包病原菌菌落边缘打取3个直径5mm的菌饼，接种于装有150mL的改良Fries3号培养液(培养液的配方见4.3.1)中，(25土1)C恒温箱12h光暗交替静置培养12 d。将培养的菌液先用2层元菌纱布过滤;滤液于室温5000r/min离心10min;上清液先用0.45m的针筒式微孔滤膜过滤器过滤，再用0.22m针筒式微孔滤膜过滤器过滤，最后一次滤液即为多主棒子包粗毒素提取液。制备好的粗毒素提取液于4C冰箱保存备用。5 抗病性鉴定5.1 病原菌菌饼接种鉴定5.1.1 鉴定设计鉴定时设IAN873为抗病对照品系，PR107为感病对照品系。每个品系选取5片无病斑、完整的橡胶树淡绿期小叶，每片小叶作为1个重复，每个重复设4个接种点，其中1个接种点为空白对照。5.1.2 接种用无菌的牙签在接种点处轻轻刺伤，将病原菌菌饼有菌丝的一面贴于叶片接种点的伤口处，对照则用空白PDA培养基贴于伤口处，用无菌的滤纸片蘸无菌水贴于菌饼上，叶片按品系贴好标签，置于(28土1)C保湿培养。24h后去除菌饼，继续保湿培养。5.1.3 数据统计接种处理3d后进行调查。采用十字交叉法量取发病叶片病斑的直径，单位为厘米(cm)，计算每张小叶和品系平均值。5.2 粗毒素生物萎藩法鉴定5.2.1 鉴定设计鉴定时设IAN873为抗病对照品系，PR107为感病对照品系。每个品系选取12片橡胶树淡绿期小叶，每2片小叶作为1个重复，其中4个重复用于粗毒素处理，2个用空白培养基处理做对照。5.2.2 接种用消毒的手术剪刀将选取叶片的叶柄去除，称重后，迅速转移到含有20mL粗毒素的50mL离心管中，以空白改良Fries3号培养基作为对照。叶柄端朝下插入粗毒素提取液中，处理的橡胶树叶片置于(25土l)C的恒温箱中12 h光暗交替培养。5.2.3 数据统计接种处理3d后进行调查。处理后的叶片用干净的吸水纸吸去叶片表面的液体，称取处理后每张橡胶树叶片的质量，根据处理后与处理前叶片质量的比值来计算水分损失。利用式(1)计算处理后的萎焉指数。R,-R WI=丁二X100.(1)式巾:WI一-萎藉指数;R，一一一对照叶片处理后与处理前的质量比值;R，一一处理叶片处理后与处理前的质量比值。5.3 自然条件下抗病性评价NY/T 3195-2018 5.3.1 对照品系鉴定时设IAN873为抗病对照品系，PR107为感病对照品系。5.3.2 鉴定圆设计鉴定圃选址于橡胶树棒抱霉落叶病常发区，地势平坦，土壤理化性质均一，囚周元高大乔木，立地环境一致，每个品系种植30株，完全随机排列，种植规格75cmX75 cm，种质圆管理按NY/T221的规定进行锄草、浇水及施肥，确保苗木生长旺盛。5.3.3 调查时间每年发病高峰期，即9月初调查。5.3.4 调查方法每年调查1次，每个品系5.3.5 病情级别划分病情级别及相对R;S 6 抗病性评价6.1 抗病性评价标准根据病斑直径、萎焉指数和表2。表2橡胶树棒抱霉落叶病抗病性评价分级标准病斑直径(O)，cm篓藉指数(WI)病情指数(Dl)DO.5 WIlO DI15 O.5D1.0 10WI20 15DI20 1.0D1.5 20WI30 20DI30 1.5D2.。30WI40 30Dl40 D注2.0WI注40DI注406.2 抗病性评价有效性判定小叶，共180片小叶。(2)抗病性等级高抗(HR)中抗(MR)轻感(S)中感(MS)离感(HS)3 Y!T 3195-2018 当感病对照品系CPRlon达到其相应感病程度(病斑直径注2.0cm，萎焉指数二三 40，病情指数40)，该批次抗棒抱霉落叶病鉴定视为有效。当3种方法评价的结果有差异时，以抗性水平低的结果为准。当3种方法的抗病性等级相差2级以上(包括2级)时，该鉴定结果视为无效，应重新进行抗病性鉴定评价。7 结果记录填写橡胶树品系抗棒抱霉落叶病鉴定结果于附录C表格。4 Y!T 3195-2018 附录A(资料性附录)橡胶树棒抱霉落叶病A.1 田间症状橡胶树棒子包霉落叶病在4月ll月均可发病，发病高峰期为9月，橡胶树幼苗、开割树上的嫩叶利老叶均能被感染.受害叶片上产生的症状随叶龄、品系的不同而有所变化。叶面上形成浅褐色近圆形(少数呈现不规则形)坏死病斑，直径1mm8 mm，病斑中心纸质、边缘深褐色，外围有一黄色晕罔(图A.la)。受害老叶病斑较大，病斑中心纸质、有些出现炮弹状穿孔(图A.lb)，周围的日十组织黄红色或红褐色，严重时叶片脱落。口十片受害严重叶尖出现皱缩回枯(图A.lc)。受害叶片除了能产生坏死病斑和萎建脱落外，染病叶片上，病菌产生的毒素往往沿口十脉扩展变褐，组织失绿变黄，形成典型的鱼骨状症状(图A.ld)。感病嫩枝和叶柄，通常出现浅褐色长条形病斑;叶柄或叶片基部感病，则枝条上几乎所有的叶片都会干枯且迅速凋落。植株受害后出现反复落叶，甚至整株枯死。说明一圆斑型，b一一炮弹状穿孔，A.2 病原菌形态苦苦、f 一一叶尖枯;d一一典型鱼骨状飞图A.l橡胶树棒抱霉落叶病田间症状,.急通病原菌分生于包子梗单生或数根丛生，直立或弯曲，不分枝，褐色，光滑，大小(lOO550)mX(26)m.分生于包子顶生，单生，倒棍棒状、圆柱状，正直或弯曲，淡褐色，光滑，2个20个假隔膜，顶端钝圆，基部脐点明显.平截，大小(50300)mX(922)m.偶见于包子成链(图A.2)。5 NY/T 3195-2018 说明.a一一分生袍子梗及分生袍子;b 丛生分生袍子梗:6 一假隔膜明显的分生抱子;d-分生抱子链.图A.2病原菌形态附录B(资料性附录)橡胶树多主棒抱病菌分子鉴定8.1 分子鉴定ITS引物和扩增程序ITS1:5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3;ITS4:5-TCCTCCGCTT A TTGA T A TGC-3。NY/T 3195-2018 扩增程序:95C预变性5min;94C变性30s，55C退火45s,72C延伸1min，循环34次;在72C延伸10min，4C保存。B.2 cas2亚型cassiicolin毒素基因特异引物和扩增程序casF17:5-GGATTTGCCTGAGATCCTA-3;casR24:5-CAAACAA TGCT AACCAAACAAAC了。扩增程序:95C预变性5min;94C变性30s，53C退火45s,72C延伸1min，循环34次;在72C延伸10min，4C保存。B.3 cas5亚型cassiicolin毒素基因特异引物和扩增程序casF19:5-CGGGGAGGTATCAGGTGTGAGATA-3;casR26:5-CAGAACAAGCCAAAAGAGAACT AC-3。扩增程序:95C预变性5min;94C变性30s，56C退火45s,72C延伸1min，循环34次;在72C延伸10min，4C保存。7 Y!T 3195-2018 附录C(规范性附录)橡胶树棒子包霉落叶病抗病性评价结果橡胶树棒抱霉落叶病抗病性评价结果见表c.1.表C.l橡胶树棒抱霉落叶病抗病性评价结果记录表编号品系名称品系来源病斑直径.cm萎焉指数病情指数抗病性等级E自株编号:王在索亚型:接种时间:年月日评价时间:年月日记录人评价技术负责人8 FON|的凹H饲Z中华人民共和国农业行业标准热带作物种质资源抗病虫鉴定技术规程橡胶树棒子包霉落叶病NY/T 3195-2018 每中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子店街18号楼)(邮政编码，100125网址:)中国农业出版社印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销*峰毒印张l字数20千字2018年5月北京第1次印刷奇峰开本880mmX1230mm 1 16 2018年5月第1版书号161094470 定价26.00元峰版权专有僵权必究举报电话(010)65005894