GA∕T 1611-2019 法庭科学 生物检材中甲氰菊酯等五种拟除虫菊酯类农药及其代谢物检验 液相色谱-质谱法(公共安全).pdf

ICS 13.310 A 92 中 华 人 民 共 和 国 公 共 安 全 行 业 标 准 GA GA/T 法庭科学 生物检材中甲氰菊酯等五种拟除虫菊酯类农药及其代谢物检验 液相色谱-质谱法 Forensic sciencesExamination methods for five pyrethroid pesticides including fenpropathrin and their metabolites in biological samplesLC-MS -发布-实施 中华人民共和国公安部中华人民共和国公安部 发布发布 GA/T I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委员会（SAC/TC 179/SC1）提出并归口。本标准起草单位：重庆市公安局物证鉴定中心、公安部物证鉴定中心。本标准主要起草人：王俊伟、石银涛、任飞、王绘军、郑经、于忠山、何毅。GA/T 1 法庭科学 生物检材中甲氰菊酯等五种拟除虫菊酯类农药及其代谢物检验 液相色谱-质谱法 1 范围 本标准规定了法庭科学生物检材（血、尿、肝、肾、胃及胃内容等）中甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯和氯菊酯及其共有代谢物3-苯氧基苯甲酸（3-PBA）的液相色谱-质谱（LC-MS）定性定量检验方法。本标准适用于法庭科学生物检材中甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氯菊酯和3-PBA的定性分析及定量分析。其他可疑样品中甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氯菊酯和3-PBA的定性分析和定量分析可参照使用。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 毒物分析名词术语中界定的术语和定义适用于本文件。4 原理 以空白样品和添加样品作对照，按平行操作的要求，对生物检材进行提取、净化及浓缩，采用液相色谱-质谱法定性定量，以保留时间、质谱特征离子和相对丰度比作为定性判断依据；以峰面积为依据，采用内标法进行定量分析。5 试剂和仪器 5.1 试剂 实验用水应符合GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法中规定的一级水。除非另有说明，在分析中使用的试剂均为分析纯，试剂包括：a)甲醇（色谱纯）；b)乙腈（色谱纯）；c)5mmol/L 乙酸铵溶液：称取乙酸铵 0.385g，加水定容至 1000mL，混匀；d)0.1mol/L 盐酸溶液：量取浓盐酸 9mL，加水定容至 1000mL，混匀；e)乙酸乙酯；f)无水乙醇；g)标准溶液：GA/T 2 1）1.0mg/mL标准物质溶液：根据甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氯菊酯和3-PBA标准物质的纯度，各称取适量，分别用甲醇配制1.0mg/mL氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氯菊酯和3-PBA标准物质溶液，置于冰箱中冷藏保存。有效期6个月。或采用市售标准溶液；2）10.0g/mL混合标准工作溶液：移取1.0mg/mL甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氯菊酯和3-PBA标准物质溶液各0.1mL，用甲醇定容至10mL，混匀，密封，置于冰箱中冷藏保存。有效期1个月。实验中所用其他浓度的混合标准工作溶液均由10.0g/mL混合标准溶液用甲醇稀释得到；3）1.0mg/mL内标溶液：根据反式氯氰菊酯-D6的纯度，称取适量，分别用甲醇配制1.0mg/mL内标溶液，置于冰箱中冷藏保存。有效期12个月。或采用市售标准溶液；4）1.0g/mL内标工作液取：移取1.0mg/mL内标溶液0.1mL，用甲醇稀释并定容值10mL，配制成浓度为10.0g/mL内标工作溶液，置冰箱中冷藏保存有效期6个月。实验中所用其他浓度的内标工作溶液均由1.0mg/mL内标溶液用甲醇稀释得到。注：特殊情况下可使用对照溶液代替标准溶液。5.2 材料 材料包括：a)具盖离心管；b)具塞玻璃试管；c)有机系微孔滤膜：0.22m。6 仪器与设备 仪器与设备包括：a)液相色谱-质谱仪：配有电喷雾（ESI）离子源和三重四极杆质量分析器；b)电子天平；c)离心机；d)振荡器；e)移液器；f)浓缩器；g)超声波清洗器。7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品提取 7.1.1.1 液液萃取 移取血液等液体检材样品 1.0 mL，或称取铰碎（或匀浆）的肝脏等固体检材样品 1.0g 于具盖离心管中，添加 100ng 反式氯氰菊酯-D6，用 0.1mol/L 盐酸调节 pH 值至 4，加入二氯甲烷 5mL，振荡 5min，超声提取 10min，高速离心 5min，分离有机相；重复提取一次，合并两次提取的有机相，置于浓缩器上常温空气流下浓缩至干，残留物用甲醇/水（体积比 4:1）200L 溶解，用 0.22m 有机系微孔滤膜过滤，作为检材样品提取液供仪器分析。注：检材样品取样量和二氯甲烷体积可根据实际情况调整。GA/T 3 7.1.1.2 质控样品制备 取等量相似基质的空白样品（若无相似基质空白样品可用血液替代）两份于具盖离心管中，一份作为空白样品，一份添加甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氯菊酯和 3-PBA 标准物质，作为添加样品（添加样品浓度为 5ng/mL(g)），与检材样品平行操作，得到空白样品提取液和添加样品提取液供仪器分析。7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 仪器条件 7.1.2.1.1 液相色谱-质谱条件（适用于甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氯菊酯液和反式氯氰菊酯-D6检验）以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整：a)色谱柱：Zorbax RRHD Elipse Plus18 柱（2.1mm 100mm，1.8m）或等效色谱柱；注：Zorbax RRHD Elipse Plus18 柱是 Agilent 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。b)进样量：1L；c)流速：0.5mL/min；d)流动相：A：甲醇；B：5mmol/L乙酸铵水溶液，梯度洗脱程序见表1；表 1 五种拟除虫菊酯类农药及反式氯氰菊酯-D6的梯度洗脱条件 时间 min 5mmol/L 乙酸铵水溶液 甲醇 0.1 20%80%1.0 20%80%2.0 80%20%5.0 80%20%5.1 20%80%8.0 20%80%e)离子源：电喷雾离子源（ESI）；f)扫描方式：正离子扫描；g)检测方式：多反应监测（MRM）；h)电喷雾电压：5500V；i)离子源温度：600；j)雾化气压力：50 psi；k)辅助加热气压力：50 psi；l)气帘气压力：30 psi；m)MS 参考条件（离子对、碰撞电压、去簇电压、入口电压、出口电压等）：见表 2。GA/T 4 表 2 五种拟除虫菊酯类农药及反式氯氰菊酯-D6的 MS 参考条件 化合物 定性离子对 碰撞电压 V 去簇电压 V 入口电压 V 出口电压 V 甲氰菊酯 350.3125.2*16 70 13 13 350.397.2 44 氯氰菊酯 433.1191.1*20 35 8.6 17 433.1127 45 溴氰菊酯 523.1281*7 70 7 25 523.1199.2 17 氰戊菊酯 437.2167.1*21 52 8 19 437.2125 56 氯菊酯 408.3221.1*15 70 10 20 408.3250.1 15 反式氯氰菊酯-D6 439.3197.1 23 51 23 10 注：*表示定量离子对。7.1.2.1.2 液相色谱-质谱条件（适用于 3-PBA 检验）以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整：a)色谱柱：Zorbax RRHD Elipse Plus C18柱（2.1mm 100mm，1.8m），或等效色谱柱；注：Zorbax RRHD Elipse Plus C18柱是 Agilent 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。b)进样量：1L；c)流速：0.5mL/min；d)流动相：A：乙腈；B：水，梯度洗脱程序见表3；表 3 3-PBA 液相色谱的梯度洗脱条件 时间 min 流速 mL/min 水 乙腈 0.1 0.5 90%10%2.0 0.5 90%10%2.1 0.5 2%98%4.0 0.5 2%98%4.1 0.5 90%10%7.0 0.5 90%10%e)离子源：电喷雾离子源（ESI）；f)扫描方式：负离子扫描；g)检测方式：多反应离子监测（MRM）；h)电喷雾电压：-4500V；i)离子源温度：650；j)雾化气压力：60 psi；GA/T 5 k)辅助加热气压力：50 psi；l)气帘气压力：20 psi；m)3-PBA 的 MS 参考条件（离子对、碰撞电压、去簇电压、入口电压、出口电压等）见表 4。表 4 3-PBA 的 MS 参考条件 化合物 母离子 子离子 碰撞电压 eV 去簇电压 V 入口电压 V 出口电压 V 3-PBA 213.1 92.9-26.2-70-9-8 169-16 7.1.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液及标准工作溶液，按7.1.2.1的分析条件进样分析。7.2 定量分析 7.2.1 样品提取 移取血液等液体检材样品1.0mL，或称取铰碎的肝脏等固体检材样品1.0g两份，按7.1.1进行操作。内标-工作曲线法：另取等量相似基质的空白样品六份，一份作为空白样品，另外五份添加不同浓度的标准物质（添加浓度应呈良好的线性关系，且检材样品中目标物的含量应在线性范围内），作为添加样品，与检材样品平行操作。内标-单点校正法：另取等量相似基质的空白样品两份，一份作为空白样品，另外一份添加标准物质（检材样品中目标物含量应为添加样品中目标物含量的(100 50)%，作为添加样品，与检材样品平行操作。7.2.2 仪器检测 7.2.2.1 仪器条件 按7.1.2.1规定的条件分析。7.2.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液及标准工作溶液，按7.1.2.1的分析条件每个样品进样分析23次。若要报告测量不确定度，每个样品分析次数应不少于6次。7.2.3 计算 7.2.3.1 计算含量 7.2.3.1.1 内标-标曲法 在系列浓度的添加样品中，以目标物与内标物定量离子对的峰面积比（Y）为纵坐标、目标物浓度（W）为横坐标进行线性回归，得线性方程。根据检材样品中目标物与内标定量离子对峰面积比，按公式（1）计算出待测样品中目标物的质量浓度。.(1)式中：GA/T 6 W 检材样品中目标物的含量，单位为微克每克（g/g）或微克每毫升（g/mL）；Y 检材样品提取液中目标物与内标峰面积比；a 线性方程的截距；b 线性方程的斜率。7.2.3.1.2 内标-单点法 记录检材样品提取液和添加样品提取液中目标物和内标的保留时间和峰面积值，按公式(2)计算校正因子，按公式(3)计算含量：标内内标AMAMf=.(2)式中：f 校正因子；M标 添加样品中目标物添加量，单位为微克(g)；A内 添加样品中内标物峰面积平均值；M内 添加样品中内标物添加量，单位为微克(g)；A标 添加样品中目标物峰面积平均值。样内内样MAMAfW=.(3)式中：W检材样品中目标物的含量，单位为微克每克（g/g）或微克每毫升（g/mL）；f 校正因子；A样 检材样品提取液中目标物峰面积平均值；M内 检材样品中内标物添加量，单位为微克(g)；A内 检材样品提取液中内标物峰面积平均值；M样 检材样品的取样量，单位为毫升(mL)。7.2.3.2 计算相对相差 记录两份平行操作的检材样品中目标物的含量，按公式（4）计算相对相差：%10021=XXXRD.(4)式中：RD 相对相差，用百分比（%）表示；X1、X2 两个检材样品平行定量测定的含量数值；X两个检材样品平行定量测定含量的平均值。8 结果评价 8.1 定性结果评价 8.1.1 阳性结果评价 在相同条件下进行样品测定时，检材样品中目标物的色谱峰保留时间与标准溶液一致（相对误差在 2.5%之内）、目标物的定性离子与标准溶液一致，且离子丰度比与浓度接近的标准溶液相比，相对偏差不超过表5规定的范围，空白样品无干扰，则可判断检材样品中检出目标物。GA/T 7 表 5 离子丰度比的最大允许相对偏差范围 离子丰度比 50%2050 1020 10%最大允许相对偏差 20 25 30%50%8.1.2 阴性结果评价 检材样品未出现与目标物标准溶液一致的色谱峰，且添加样品中出现与目标物标准溶液一致的色谱峰，空白样品无干扰，则可判断检材样品中未检出目标物。方法检出限参见附录A。8.2 定量结果评价 如果目标物含量的RD20%，定量数据可靠，其含量按两份检材的平均值计算。如果检材样品中目标物含量的RD20%，定量数据不可靠。应按7.2重新提取检验。拟除虫菊酯类农药的检出限及在生物体内的代谢参见附录A，鱼塘投毒案中检材选择、保存和样品提取参见附录B。GA/T 8 附 录 A（资料性附录）拟除虫菊酯类农药的检出限及在生物体内的代谢 A.1 方法检出限 采用 LC-MS 分析，方法检出限均为 10ng/mL(g)，定量下限均为 50ng/mL(g)。A.2 拟除虫菊酯类的体内代谢 拟除虫菊酯类农药在生物体内的代谢，主要是化合物酯键处断裂。在体内代谢为菊酯类农药的非特异代谢产物 3-苯氧基苯甲酸（3-PBA）和特征代谢产物。以甲氰菊酯为例，其在体内代谢为 3-PBA 和四甲基环丙烷羧酸（甲氰菊酸）的葡萄糖醛酸。在自然界中，主要分解为 3-PBA 和甲氰菊酸。见图 A.1 甲氰菊酸 甲氰菊酯 3-PBA 图 A.1 甲氰菊酯结构及代谢示意图 OHOCH3H3CH3CCH3OOOHGA/T 9 附 录 B（资料性附录）鱼塘投毒案中检材选择、保存和样品提取 拟除虫菊酯农药（pyrethroid pesticides）是一种在农业生产中广泛应用的杀虫剂，因其对鱼类、昆虫具有极强毒性，不法分子常使用该类农药对鱼塘投毒。鱼塘投毒案中检材的选择、保存注意事项和样品提取过程包括：a)鱼中毒死亡时，鱼内脏和鱼鳃中拟除虫菊酯农药含量最高，结合鱼塘水可以大体积萃取富集的特点，所以在死亡早期，鱼内脏、鱼鳃和鱼塘水是最佳提取检材；b)拟除虫菊酯农药在鱼体和鱼塘水中降解较快，尤其是在鱼塘水和鱼内脏中。所以在鱼塘投毒案中，应尽早提取检材。以甲氰菊酯为例，鱼塘水在鱼中毒死亡5d后，甲氰菊酯含量下降62.1%，此后对鱼塘水进行检测意义不大。拟除虫菊酯农药在鱼鳃中的含量较高且相对稳定，受外界干扰影响较小。以甲氰菊酯为例，鱼中毒死亡5d7d天后，甲氰菊酯在鱼内脏中的含量已低于鱼鳃。若受客观原因制约，检材提取或检验不及时，3-PBA应做为主要甚至是唯一的检测目标，3-PBA的检测能够为鱼塘投毒案定性的提供间接证据。3-PBA性质稳定，不易分解，在提取回收率和仪器检测灵敏度方面均高于甲氰菊酯；c)保存检材时毒物的分解动力学主要受保存条件的影响，包括温度、时间、器皿类型、防腐剂、pH值等。其中，温度是影响保存生物检材中毒物分解主要因素之一。温度在2035时，生物检材的腐败发生最快，因而毒物及其代谢产物的分解速度也较快。所以，采取的检材要低温或加入抑菌剂保存，以防止细菌分解药物，提高药物原体残留度；d)取鱼塘水检材100 mL（或大于100 mL）于三角烧瓶中，添加100ng的内标物反式氯氰菊酯-D6。用0.1mol/L盐酸调pH值至4，然后加入二氯甲烷15mL，振荡后超声提取10min，取有机相于50mL离心管中（提取两次，将提取液合并），常温空气流下挥干后残留物里加入甲醇/水（体积比4：1）200 L溶解，用0.22m有机滤膜过滤，作为检材样品提取液供仪器分析。